鉴定紫花苜蓿种子携带菟丝子种子的试剂盒及检测方法与流程

本发明主要涉及一种紫花苜蓿种子是否携带苜蓿菟丝子的快速分子检测方法及其专用引物。具体涉及苜蓿菟丝子基因组DNA检测的试剂盒及其检测方法。

背景技术：

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是一种十分重要的豆科牧草，因其草产量高、营养丰富、品质好、耐干旱和盐碱等胁迫、不需施氮肥且能固氮改土、适应性强等优良特性，从而在全世界广泛种植和应用，素有“牧草之王”之美誉。紫花苜蓿的全球种植面积约为3500万公顷，目前我国的紫花苜蓿种植面积已多达200万公顷，居世界第五位(王彦华等，2009)。

高品质的种子是优质牧草的重要保障，但是紫花苜蓿种子中常常混有苜蓿菟丝子种子。苜蓿菟丝子属于世界性苜蓿草地的恶性杂草，当其寄生在苜蓿上后，会吸取苜蓿养分，从而使苜蓿的生长受阻，被寄生的植株长势衰弱、矮小，发育结实困难，提早成片死亡，最终影响苜蓿的产量、质量及其经济效益。在我国新疆塔城地区，紫花苜蓿种子中菟丝子种子的含量高达13.4％，苜蓿菟丝子已严重危害当地紫花苜蓿的种子生产(姜海燕等，2005)。而紫花苜蓿和苜蓿菟丝子种子的粒径大小相似，颜色相近，一旦紫花苜蓿中混有苜蓿菟丝子种子，传统方法难以鉴定和清除(见图1、图2)，将给紫花苜蓿的生产带来不可挽回的损失。

技术实现要素：

本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种鉴定紫花苜蓿种子携带苜蓿菟丝子种子的引物。填补现有检测手段难以鉴定紫花苜蓿种子中是否携带苜蓿菟丝子种子的空白，提出一对能够快速检测紫花苜蓿种子携带苜蓿菟丝子的引物。

本发明的目的二是提供一种鉴定紫花苜蓿种子携带苜蓿菟丝子种子的试剂盒。

本发明的目的三是公开一种鉴定紫花苜蓿种子携带苜蓿菟丝子种子的检测方法。

此方法省时省力，操作简便，能够在实验室条件下较短时间内完成。本研究具有很强的应用价值，有助于种子检验人员快速、准确以及高效地检测出紫花苜蓿中是否携带苜蓿菟丝子。在我国紫花苜蓿的推广种植中，该技术具有非常广阔的应用前景，能够为我国的牧草生产和畜牧业的发展做出巨大的贡献。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种鉴定紫花苜蓿种子携带苜蓿菟丝子种子的引物，其主要特点在于，苜蓿菟丝子的引物为：

C_apF(5′-3′)：CGAAGATCTTCGAATACCTCCA；

C_apR(5′-3′)：ATCAATAACTGCATGCATTGCG。

一种鉴定紫花苜蓿种子携带苜蓿菟丝子种子的试剂盒，其主要特点在于包括有：

苜蓿菟丝子PCR检测体系，其中包括2×EcoTaq PCR SuperMix，

引物C_apF(5′-3′)：CGAAGATCTTCGAATACCTCCA；

引物C_apR(5′-3′)：ATCAATAACTGCATGCATTGCG和ddH₂O。

一种鉴定紫花苜蓿种子携带苜蓿菟丝子种子的检测方法，其主要特点在于包括如下步骤：

A.收集种子，采用SDS裂解法提取待测种子基因组DNA备用；

B.利用苜蓿菟丝子引物，对待测种子基因组DNA进行PCR检测。PCR检测体系的总体积为10μl，其中包括2×EcoTaq PCR SuperMix(上海生工，产品编号：SK2082)5μl，引物C_apF(5′-3′)：CGAAGATCTTCGAATACCTCCA 0.5μl，引物C_apR(5′-3′)：ATCAATAACTGCATGCATTGCG 0.5μl，ddH₂O 3.5μl和待测种子DNA模板50ng/μl 0.5μl。扩增条件为：(1)94℃预变性3min；(2)94℃变性30s；(3)57℃退火30s；(4)72℃延伸50s；(5)2-4步骤循环33次；(6)72℃延伸7min；

C.将PCR产物在1-2％的琼脂糖凝胶中电泳，电泳电压为135-130V，时间为14-18min，凝胶成像系统中拍照：

D.如果出现明显条带，则说明紫花苜蓿种子中携带有苜蓿菟丝子；如果无明显条带，则说明紫花苜蓿种子中不携带苜蓿菟丝子。

本发明的有益效果是，可以快速有效的检测出紫花苜蓿种子中是否携带苜蓿菟丝子种子，还可以在苜蓿菟丝子和紫花苜蓿DNA浓度比为1∶10000和1∶5000(PCR产物二次扩增)的水平上，检测出紫花苜蓿中混有的微量苜蓿菟丝子种子。此方法具有成本低、稳定性强、重复率高和简单快捷等特点，能够鉴定大批量的紫花苜蓿种子中是否携带苜蓿菟丝子，为保障紫花苜蓿种质的优质安全提供可行依据。

附图说明

图1.紫花苜蓿种子和苜蓿菟丝子种子粒径相似性；

图中：A为紫花苜蓿种子，B为苜蓿菟丝子种子，比例尺为1mm。

图2.苜蓿菟丝子寄生紫花苜蓿的照片；

图中：图中用箭头分别指出紫花苜蓿和苜蓿菟丝子。

图3.苜蓿菟丝子和紫花苜蓿DNA的PCR鉴定结果；

图中：苜蓿菟丝子(C.approximata)的1-3编号表示3种不同来源的苜蓿菟丝子种子，紫花苜蓿(M.sativa)的1-8编号表示紫花苜蓿的8个不同品种，“M”表示DL2000的DNA Marker，“H₂O”表示以ddH₂O为模板的负对照组。

图4.(a)紫花苜蓿种子中混有不同比例苜蓿菟丝子的PCR鉴定结果；

图4.(b)紫花苜蓿种子中混1∶5000比例苜蓿菟丝子的二次PCR产物鉴定结果；

图4.(c)紫花苜蓿种子中混有1∶10000比例苜蓿菟丝子的二次PCR产物鉴定结果。

图中：1∶1、1∶5、1∶25、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶5000、1∶10000表示苜蓿菟丝子种子和紫花苜蓿种子基因组DNA模板混合的质量比，“M”表示DL2000的DNA Marker，“H₂O”表示以ddH₂O为模板的负对照组。

具体实施方式

以下结合实施实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1：一种鉴定紫花苜蓿种子携带苜蓿菟丝子种子的引物，苜蓿菟丝子引物为：

C_apF(5′-3′)：CGAAGATCTTCGAATACCTCCA

C_apR(5′-3′)：ATCAATAACTGCATGCATTGCG。

实施例2：一种鉴定紫花苜蓿种子携带苜蓿菟丝子种子的试剂盒，其主要特点包括有：

苜蓿菟丝子PCR检测体系，其中包括2×EcoTaq PCR SuperMix，

引物C_apF(5′-3′)：CGAAGATCTTCGAATACCTCCA

引物C_apR(5′-3′)：ATCAATAACTGCATGCATTGCG和ddH₂O。

实施例3：一种鉴定紫花苜蓿种子携带苜蓿菟丝子种子的方法，其主要特点包括如下步骤：

A.收集下述种子，采用SDS裂解法提取待测种子基因组DNA备用；

表1.苜蓿菟丝子和紫花苜蓿参试信息

B.利用苜蓿菟丝子专用引物，对上述种子基因组DNA进行PCR检测。PCR检测体系的总体积为10μl，其中包括2×EcoTaq PCR SuperMix(上海生工，产品编号：SK2082)5μl，引物C_apF(5′-3′)：CGAAGATCTTCGAATACCTCCA 0.5μl，引物C_apR(5′-3′)：ATCAATAACTGCATGCATTGCG 0.5μl，ddH₂O 3.5μl和上述种子DNA模板(50ng/μl)0.5μl。扩增条件为：(1)94℃预变性3min；(2)94℃变性30s；(3)57℃退火30s；(4)72℃延伸50s；(5)2-4步骤循环33次；(6)72℃延伸7min；

C.将PCR产物在1-2％的琼脂糖凝胶中电泳，电泳电压为135-130V，时间为14-18min，凝胶成像系统中拍照：

D.如果出现明显条带，则说明紫花苜蓿种子中携带有苜蓿菟丝子；如果无条带，则说明紫花苜蓿种子中不携带苜蓿菟丝子。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测其效果为：

图3显示三种来源不同的苜蓿菟丝子基因组DNA为模板的电泳条带明亮清晰，而以紫花苜蓿种子基因组为模板的对照中无电泳条带，以ddH₂O为模板的负对照组也没有电泳条带。

实施例4：验证快速检测紫花苜蓿种子中是否携带苜蓿菟丝子的方法包括如下步骤：

苜蓿菟丝子和紫花苜蓿种子DNA分别以1∶1、1∶5、1∶25、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶5000、1∶10000的比例混合，提取混合后种子的基因组DNA并用作模板，以ddH₂O为模板作对照，采用C_apF(5′-3′)：CGAAGATCTTCGAATACCTCCA，C_apR(5′-3′)：ATCAATAACTGCATGCATTGCG引物进行PCR扩增。PCR体系和方法同实施例3。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测其效果为：

图4显示DNA模板混合后，在苜蓿菟丝子比紫花苜蓿的DNA浓度为1∶1、1∶5、1∶25、1∶100、1∶200、1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶5000的水平下，苜蓿菟丝子均能出带以ddH₂O为模板的负对照组也没有电泳条带。在苜蓿菟丝子比紫花苜蓿的DNA浓度为1：10000和1；5000的水平下，初次PCR产物经1％琼脂糖凝胶检测，无条带，二次PCR产物有明显条带出现。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。