本发明属于光学传感材料制备技术及糖蛋白检测方法研究领域，尤其是涉及一种辣根过氧化物酶分子印迹荧光传感材料的制备方法。
背景技术：
分子印迹作为识别小分子的常规手段，在针对小分子识别上已经得到了广泛的应用。然而随着技术的发展，越来越多的研究开始关注生物大分子印迹材料的开发以及应用。比如蛋白，病毒，rna，多肽等等。针对这一领域研究者开发了多种多样的分子印迹材料例如分子印迹纳米粒子，量子点-分子印迹传感器，以及分子印迹电化学传感器等等。然而生物大分子印迹材料的制备也存在着许多问题，特别是蛋白印迹材料，存在由于自身结构复杂存在不同区域具有不同的性质，而且在蛋白分子印迹过程中，蛋白分子存在自旋现象，这会严重的破坏印迹空穴的识别力而导致印迹效果不佳。尽管有研究者针对蛋白分子印迹过程中，通过特殊的化学作用键固定模板蛋白，但是这种方法需要特殊的设计，耗费比较大。分子印迹后修饰手段，是指在分子印迹过程中首先对模板进行印迹形成印迹空孔穴，然后再形成的印迹孔穴中进行化学修饰，引入新的化学基团或者引入荧光基团，提高孔穴的识别力。从而提高分子印迹材料的选择识别特性。
糖蛋白在生物学有着重要的意义，特别是在临床诊断方面。蛋白质组学的研究。糖蛋白组学作为其中一个重要分支，备受众多实验工作者的关注。通常，生物样品中成分复杂，而糖蛋白的丰度较低，且被其他的高丰度蛋白及高含量组分所掩盖，现有的手段对于很多糖蛋白是很难分离并鉴定的，因此，发展新型、高效的分离富集材料，对于糖蛋白组学的研究是至关重要的。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服传统大分子印迹材料中“假模板”和“公共模板”难以实施的问题，是在于提供了一种辣根过氧化物酶分子印迹荧光传感材料的制备方法。该法具有通用性，所制备的材料不仅对糖蛋白有较好的选择性，而且由于其所具有的荧光性，可以实现糖蛋白的快速检测。
本发明通过以下方案实现：
一种辣根过氧化物酶分子印迹荧光传感材料的制备方法，包括如下步骤：
(a)在水相中，将模板分子与功能单体混合搅拌，加入交联剂、引发剂，通过本体聚合法制备辣根过氧化物酶分子印迹聚合物；
(b)对步骤(a)所制得的分子印迹聚合物进行后修饰，赋予材料荧光性。
进一步，所述模板分子为辣根过氧化物酶。
进一步，所述功能单体为({[2-(2-甲基丙烯酰胺)-二硫代乙基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙酸。
进一步，所述交联剂为n,n'-亚甲基双丙烯酰胺。
进一步，所述引发剂为过硫酸铵和四甲基乙二胺。
本发明公开了辣根过氧化物酶分子印迹聚合物的制备过程如下：
(1)将模板辣根过氧化酶和功能单体({[2-(2-甲基丙烯酰胺)-二硫代乙基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙酸在tris-hcl缓冲液中进行孵育30分钟；
(2)在步骤(1)所制备的溶液中加入交联剂n,n'-亚甲基双丙烯酰胺、引发剂10％过硫酸铵和5％四甲基乙二胺，通氮气，并且在氮气的条件下密封；
(3)在水浴25℃条件下聚合24小时，引发步骤(2)制备的聚合体系；
(4)将步骤(3)所制得的聚合物进行冷冻干燥后，分别用100ml双重水、10％sds/冰乙酸、200ml双重水依次洗涤，去除模板后真空干燥至恒重，得到辣根过氧化物酶分子印迹聚合物。
进一步，所述模板辣根过氧化物酶的用量为30mg。
进一步，所述功能单体({[2-(2-甲基丙烯酰胺)-二硫代乙基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙酸。
进一步，所述tris-hcl缓冲液的浓度为10mm，ph为9.0。
上所述的辣根过氧化物酶分子印迹聚合物的制备过程中，所述交联剂n,n'-亚甲基双丙烯酰胺用量为308mg。
进一步，所述引发剂10％过硫酸铵的用量为200μl，5％四甲基乙二胺的用量为100μl。
进一步，所述10％sds与冰乙酸的体积比为1:9。
本发明还公开了辣根过氧化物酶分子印迹聚合物后修饰过程如下：
(1)取50mg辣根过氧化物分子印迹聚合物，将其溶解到50ml浓度为50mm的三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(tecp)磷酸缓冲液中，室温下放置24小时；
(2)将步骤(1)得到的溶液离心，去除上清液，即得到二硫键断开暴露出巯基的辣根过氧化物酶分子印迹聚合物；
(3)将步骤(2)得到的材料放入25ml圆底烧瓶中，加入15ml双重水和乙醇的混合液、4-乙烯基苯硼酸和引发剂偶氮二异丁腈，在60℃下水浴反应8小时后，乙醇清洗三次；
(4)将步骤(3)得到的材料离心，真空干燥至恒重后即得辣根过氧化物酶分子印迹荧光传感材料。
进一步，所述tecp磷酸缓冲液(0.1mm,ph＝6.3)浓度为50mm,体积为50ml，ph为6.3，。
进一步，所述双重水和乙醇的体积比为2:1。
进一步，所述4-乙烯基苯硼酸量为1mmol。
进一步，所述偶氮二异丁腈的加入量为10mg。
本发明的辣根过氧化物酶分子印迹荧光传感材料用于糖蛋白的快速检测。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明所制备的辣根过氧化物酶分子印迹荧光传感材料不仅对糖蛋白有较好的选择性，而且由于其所具有的荧光性，可以实现糖蛋白的快速检测。
(2)本发明中所用的制备方法具有通用性，解决了大分子印迹材料中“假模板”和“公共模板”难以实施的问题，克服了传统荧光材料如碳点、量子点、荧光素所带来的背景干扰值大和费用高的缺点。检测方法快速、灵敏、准确，为分子印迹复合材料的开发提供了一种有效的手段。
附图说明
图1辣根过氧化物酶分子印迹荧光传感材料的制备路线
具体实施方式
为了使本发明上述特征和优点更加清楚和容易理解，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步详细描述。
实施例1辣根过氧化物酶分子印迹荧光传感材料的制备
(1)辣根过氧化物酶分子印迹聚合物的制备
将30mg模板分子和332mg功能单体首先在10mmtris-hcl缓冲液中(ph9.0)进行孵育30分钟,然后加入308mgn,n'-亚甲基双丙烯酰胺,200μl的10％过硫酸铵(w/v)和100μl的5％四甲基乙二胺(v/v)，将预聚合反应液冲氮气10min去除气泡后水浴25℃，聚合24小时。聚合好的分子印迹材料采用冷冻干燥的方式去除水分，然后分别用100ml双重水,10％sds/冰乙酸(100ml,1:9,v/v)和200ml双重水进行洗涤去除模板，去除模板后真空干燥。
(2)辣根过氧化物酶分子印迹聚合物后修饰方法
取一定量的洗脱后的分子印迹材料溶解到50ml的50mmtecp磷酸缓冲液中(0.1mm,ph＝6.3),室温下放置24小时后，离心去除上清液后，得到二硫键断开暴露出巯基的分子印迹材料。然后用水清洗，真空干燥箱干燥。将以上得到的分子印迹材料放入25ml的圆底烧瓶中，加入15ml(双重水:乙醇，v/v＝2:1)，加入4-乙烯基苯硼酸1mmol，加入10mg引发剂偶氮二异丁腈，60℃下水浴反应8小时，乙醇清洗三次，离心然后真空干燥。按照上述方法，不加模板分子hrp，制备本发明对应的非印迹聚合物。
辣根过氧化物酶分子印迹荧光传感材料的制备路线见图1。
实施例2辣根过氧化物酶分子印迹荧光传感材料性能评价
1、辣根过氧化物酶分子印迹荧光传感材料吸附性能评价
(1)测量不同浓度的辣根过氧化物酶标液的紫外吸收值，建立浓度与紫外吸收值的标准曲线。然后将1mg的未修饰印迹材料或非印记材料加入4ml离心管中，再加入3ml浓度为0.1-10mgl-1的辣根过氧化物酶标液。将该混合物在室温下震荡一段时间，离心取上清液后再用紫外分光光度仪测量紫外吸收值，通过标准曲线计算出对应的浓度值。
(2)利用公式：q＝(c0-ct)vm-1×103其中q(mgg-1)表示吸附量，c0(mgl-1)为辣根过氧化物酶标液的浓度；ct(mgl-1)为吸附震荡后上清液的浓度；vm(ml)为加入辣根过氧化物酶标液的体积。最终得出印迹材料对于辣根过氧化酶的吸附量为223.63mgg-1。
2、辣根过氧化物酶分子印迹荧光传感材料动力学性能评价
称取1mg的未修饰印迹材料置于4ml离心管中，再加入3ml0.6mgml-1的辣根过氧化物酶标液，在室温下分别震荡0.5-12h，利用上述实施案例1的方法对其吸附量进行计算。最终得到材料对目标物的吸附在8h达到平衡。
3、辣根过氧化物酶分子印迹荧光传感材料选择性性能评价
(1)选择糖蛋白伴清蛋白(conalbumin)、辣根过氧化物酶(hrp)鸡卵白蛋白(ova)以及非糖蛋白牛血清蛋白(bsa)进行选择性试验。研究后修饰的材料对目标物的蛋白选择效果。分别配制浓度为1.0mgl-1辣根过氧化物酶(hrp)、牛血清蛋白、鸡卵白蛋白和伴清蛋白的单标溶液。
(2)取3ml配制好的溶液加入离心管中，分别加入1mg的修饰后印迹材料及非印记材料，在室温下震荡8h，再通过上述(1)方法评价后修饰材料对于目标糖蛋白的选择性。
(3)吸附结果表明经过后修饰的材料对于糖蛋白的吸附量得到明显提高，特别是对于目标分子辣根过氧化物酶的吸附量保持最高，而对于非糖蛋白牛血清蛋白的吸附量无明显提升，这说明4-乙烯基苯硼酸的引入提高了材料对于目标糖蛋白的选择性，后修饰对于印迹效果无负面的影响。同时，通过对比吸附提高量，得出对结构与分子尺寸相近的鸡卵白蛋白的吸附量提高最为明显，而对于尺寸较大的伴清蛋白吸附量提高最弱。这说明材料具备良好的空间尺寸的选择性，可以用于不同分子量糖蛋白的分离与识别。
4、辣根过氧化物酶分子印迹荧光传感材料荧光性能评价。
(1)配置不同浓度的辣根过氧化酶标液(0.1-10mgml-1)tris-hcl缓冲液(ph9.0)。将1mg后修饰的分子印迹荧光材料加入不同浓度的标液中，利用荧光光度计对其荧光值进行测量，激发波长为365nm，最大发射波长为403nm。
(2)确定辣根过氧化物酶在此波段下无影响，并且随着辣根过氧化物酶的浓度增加，荧光值出现减弱的情况。在0.1-10mgml-1范围内具有较好的线性关系，最低检出限为0.01mgml-1，可实现对辣根过氧化酶的快速检测。
(3)通过公式(f0-f)/f0建立浓度与荧光值变化之间的关系曲线，其中f0为辣根过氧化物酶标液的初始荧光值，f为加入材料后的荧光值。通过曲线可以得出后修饰印迹材料随着辣根过氧化酶添加浓度的增加，荧光猝灭会10mgml-1后达到平衡，而非印记未达到平衡，同时后修饰的印迹材料其荧光变化值要明显高于非印记材料。以上数据表明印迹材料对目标分子具有较高的选择性，同时能够将印迹空穴中的识别信号转换为荧光信号，实现材料对于糖蛋白快速灵敏的检测。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。