本发明属于皮克林乳液聚合法制备核壳结构的两性亲和微球技术及蛋白保护研究领域，尤其是辣根过氧化物酶在高温条件下保持活性。
背景技术：
蛋白体外不稳，易受到环境的影响，在极端的ph条件，加热，变性剂和有机溶剂的条件下，会导致蛋白结构改变，暴露出疏水基团，导致蛋白单体通过疏水作用而聚集，最终导致蛋白的不可逆变性。研究人员对于体外蛋白保护做了大量的研究工作，开发了多种蛋白保护试剂，如表面活性剂、聚合物微球、聚合纳米粒子、聚合物胶束以及分子伴侣等。这些工作极大的扩展了我们对于蛋白变性机理的认识。其中表面活性剂，例如反向胶束，能够在乙醇和水相中形成胶束，胶束的内部形成水核，提供蛋白再折叠的环境。但是表面活性剂的种类繁多，适合种类比较少，且表面活性剂难以去除。聚合物胶束能够实现表面活性剂的功能，但是聚合胶束的形成往往通过自组装，其稳定性差，且蛋白的三级结构的形成依靠的就是自组装，对于以后研究蛋白折叠以及变性机理带来了困难。聚合微球以及聚合物纳米材料在蛋白保护以及促进蛋白再折叠方面受到了越来越多的关注。通过不同功能单体之间的组合制备具有保护蛋白材料，方法简单高效。这种方法也同时遇到了一些问题，一方面，根据以往文献报道，蛋白再折叠和不可逆变性主要是依靠疏水作用，制备的材料如果太疏水就会导致难以在水溶液中分散，制备的材料如果太亲水就会导致其保护和再折叠的能力大大减弱。另一方面疏水基团和亲水基团随机分布在聚合物颗粒中，对以后研究清楚蛋白的变性机理带来困难。因此开发一种材料，即具备稳定性，同时也具备能够将疏水基团与亲水基团随意组合和分离，将会给未来研究蛋白变性机理提供一种有效的手段。
技术实现要素：
本发明的目的在于制备一种新型核壳结构的两性亲和聚合物，该聚合物表面疏水、内部亲水，可以在高温条件下对辣根过氧化酶具有较好的保护性，使辣根过氧化酶有较好的活性和良好的酶活性。
本发明通过以下方案实现：
一种新型核壳结构的两性亲和聚合物微球制备方法，包括如下步骤：
(a)通过蒸馏沉淀方法，在乙腈溶液中加入功能单体、交联剂和引发剂，通氮气后密封，制备疏水性颗粒聚(二乙烯基苯-co-4-乙烯基苯硼酸)微球；
(b)以步骤(a)所制得的聚合物微球为皮克林乳液稳定剂，形成稳定的油包水的体系，在油相中加入步骤(a)制备的聚合物微球，在水相中加入功能单体、交联剂和引发剂，油浴70℃条件下引发聚合，通过皮克林乳液分散聚合的方式制备核壳结构的两性亲和聚合物微球。
进一步，所述功能单体为4-乙烯基苯硼酸。
进一步，所述交联剂为二乙烯基苯。
进一步，所述引发剂为偶氮二异丁腈。
进一步，所述疏水性颗粒聚(二乙烯基苯-co-4-乙烯基苯硼酸)微球的制备过程如下：
(1)将功能单体4-乙烯基苯硼酸和交联剂二乙烯基苯溶解在乙腈中。
(2)在步骤(1)所制备的溶液中引发剂偶氮二异丁腈，通氮气，并且在氮气的条件下密封。
(3)在油浴70℃条件下聚合30分钟，引发步骤(2)制备的溶液。
(4)将步骤(3)所制得的溶液接蒸馏设备后，继续加热，温度升至110℃，直至溶剂的体积蒸出一半，停止反应。
(5)将步骤(4)所得的溶液抽滤，依次用丙酮、四氢呋喃、甲醇清洗后，真空干燥后备用。
进一步，所述功能单体4-乙烯基苯硼酸的用量为10mmol。
进一步，所述交联剂二乙烯基苯的用量为10mmol。
上述的疏水性颗粒聚(二乙烯基苯-co-4-乙烯基苯硼酸)微球的制备过程中，所述引发剂的用量为55mg。
进一步，所述乙腈的用量为160ml。
本发明还公开了核壳结构的两性亲和聚合物微球制备过程，过程如下：
(1)将聚(二乙烯基苯-co-4-乙烯基苯硼酸)微球溶解到10ml甲苯溶液中，超声30分钟。
(2)将功能单体丙烯酰胺以及交联剂n,n'-亚甲基双丙烯酰胺加入到5ml水中。
(3)将步骤(2)得到溶液加入到步骤(1)所得到的溶液中，剧烈震荡3分钟，直至形成稳定的皮克林乳液。加入引发剂过硫酸铵，密封充氮气，油浴70℃反应24小时。
(4)将步骤(3)得到的材料通过倾析的方式去除油相，抽滤，用甲醇洗三遍，真空干燥至恒重后即得核壳结构的两性亲和聚合物微球。
进一步，所述聚(二乙烯基苯-co-4-乙烯基苯硼酸)微球量为120mg。
进一步，所述功能单体丙烯酰胺的用量为200mg。
进一步，所述交联剂n,n'-亚甲基双丙烯酰胺的用量为10mg。
进一步，所述引发剂过硫酸铵的用量为10mg。
本发明制备得到的新型核壳结构的两性亲和聚合物微球用于保护辣根过氧化酶。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明所制备的一种核壳结构的两性亲核聚合物，表面疏水、内部亲水，可以用于在高温条件下对辣根过氧化酶有较好的保护性，使辣根过氧化酶有较好的活性和良好的酶活性。
(2)该制备方法中没有使用表面活性剂，克服了传统表面活性剂去除困难的问题，将会给未来研究蛋白变性机理提供一种有效的手段。
附图说明：
图1:两性核壳聚合物微球扫描电镜图
图2:高温下材料内部的辣根过氧化酶酶活性测试图
具体实施方式
为了使本发明上述特征和优点更加清楚和容易理解，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步详细描述。
实施例1一种新型核壳结构的两性亲和聚合物的制备
(1)制备疏水性颗粒聚(二乙烯基苯-co-4-乙烯基苯硼酸)微球,10mmol的4-乙烯基苯硼酸，10mmol的二乙烯基苯，溶解到160ml的乙腈中，加入10mg的引发剂过硫酸铵，通氮气后密封。油浴70℃，聚合反应30min，待溶液出现浑浊后，接蒸馏设备，油浴温度提高到110℃，继续反应直至乙腈的体积蒸出一半，时间控制在2小时内。聚合反应结束后，用型号g5的砂芯漏斗进行抽滤，然后依次用丙酮、四氢呋喃、甲醇清洗，真空干燥后备用。
(2)皮克林乳液聚合法制备两性核壳聚合物微球
将步骤(1)所得的微球120mg加入到装有10ml甲苯的螺口试剂瓶中，超声30min，步骤(1)制备的微球作为皮克林乳液的稳定剂，形成油包水的乳液体系，其中油相为甲苯，水相为双重水。在水相中加入200mg丙烯酰胺作为功能单体，10mgn,n'-亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂，充分溶解后。将甲苯与水混合，大力摇晃3min，直至形成稳定的皮克林乳液，加入引发剂10mg过硫酸铵，通氮气密封，油浴70℃反应24小时。聚合反应结束后，通过倾析去除上层透明油相，将乳液倒入g5砂芯漏斗中，用甲醇清洗三次，真空干燥。
实施例2
核壳结构的两性亲和聚合物微球维持辣根过氧化酶的热稳定性测试
取5mg两性核壳聚合物微球，加入到2ml的浓度为0.5mgml-1辣根过氧化物酶水溶液中。将该辣根过氧化物酶水溶液70℃加热1小时。离心去除上清液后，加入100μldab辣根过氧化物酶显色试剂。将材料至于普通光学显微镜下进行观察，发现微球内部由无色变为红色，这表明核壳结构的两性亲和聚合物微球能够在高温条件下，固定辣根过氧化酶在其内部的亲水核中而保持辣根过氧化酶的活性。
对照组为不加入两性核壳聚合物微球的上述溶液，处理方式与上述相同。加入材料的辣根过氧化物酶水溶液，经高温处理后仍保持一定的催化活性，能引起显色剂变色；而不加入材料的对照组，辣根过氧化物酶失活，无显色反应。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。