一种快速检测细菌菌落总数的测试皿及其制备方法与流程

本发明属于快速检测领域，涉及微生物检测技术，具体涉及一种快速检测细菌菌落总数的测试皿，以及该测试皿制备方法。

背景技术：

细菌广泛存在于空气、水和土壤中，是主要卫生菌指标之一，有些细菌对人体有害，会刺激人体消化道、胃部等，严重的还可对肝脏造成损伤，造成食物中毒，危及生命安全。对于细菌菌落总数现行检测技术主要采用《GB 4789.2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》，该方法为平板法，具有检测结果准确可靠的特点，是经典的微生物检测和鉴定方法，然而该方法耗时长，需要现配置培养基，操作步骤繁琐，难以满足快检的实际要求。

纸片法的出现，弥补了平板法的缺点，逐步成为微生物检测和鉴定的主要方法和标准,2007年，Petrifilm^TM测试片被正式列为中国出入境检验检疫行业标准，该方法正逐渐被越来越多的食品生产加工企业及各类检测机构所认可。3M创新有限公司公开了一项公告号为CN102985554B，名称为快速检测微生物的装置的发明专利，该装置的使用依赖于待测样品的涂布和盖膜操作，引入了因人为操作不当，导致判读结果有误的可能。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足及满足实际检测的需要，本发明提供了一种快速检测细菌菌落总数的测试皿及测试皿的制备方法。

技术方案：

快速检测细菌菌落总数的测试皿，包括无菌培养皿和测试片，所述测试片平铺于无菌培养皿底部，所述测试片上添加有细菌菌落特征显色液体培养基，所述细菌菌落特征显色液体培养基每100mL含有胰蛋白胨0.8～2.0g、酵母粉0.4～0.8g、葡萄糖1.0～4.0g、磷酸氢二钾0.05～0.1g、氯化钠0.05～0.2g、磷酸二氢钾0.2～0.4g、硫酸镁0.2～0.4g、显色酶解底物混合剂0.015～0.04g。

所述显色酶解底物混合剂由2,3,5-氯化三苯基四氮唑与NBT按1～2:1比例溶解于N,N-二甲基甲酰胺得到的。

所述测试片是直径为50～70mm的无纺布。

所述无菌培养皿是单次使用的培养皿。

本发明的另一个目的还提供了一种快速检测细菌菌落总数的测试皿的制备方法，其包括如下步骤：

a.配制细菌菌落特征显色液体培养基：每100mL按照以下方式配制，称量胰蛋白胨0.8～2.0g、酵母粉0.4～0.8g、葡萄糖1.0～4.0g、磷酸氢二钾0.05～0.1g、氯化钠0.05～0.2g、磷酸二氢钾0.2～0.4g、硫酸镁0.2～0.4g，于烧杯中加蒸馏水100mL加热搅拌溶解，在121℃高压灭菌锅条件下灭菌15min，冷却至室温后，加入经过滤灭菌的显色酶解底物混合剂0.015～0.04g，得到细菌菌落特征显色液体培养基，在0～4℃下冷藏备用；

b.各组件的前处理

测试片的前处理：辐照剂量为2KGy；

无菌培养皿的前处理：辐照剂量为2KGy；

c.测试皿的制备

将经步骤b处理后的测试片平铺于无菌培养皿的底部后，置于平面超净工作台上，用紫外线照射30min，然后将步骤a的得到的细菌菌落特征显色液体培养基均匀添加于测试片上，于35～95℃烤制4h后，盖上无菌培养皿上盖，得到快速检测细菌菌落总数的测试皿，置于抽真空铝箔包装袋中。

本发明快速检测细菌菌落总数的测试皿在现有纸片法检测的基础上，利用微生物生化反应的特性，将微生物胞内酶的种类及反应条件作为微生物分类鉴定的主要依据，通过在分离培养基或选择性培养基中，加入微生物特异性酶显色底物，当目的菌在培养基上生长时，其特异性酶就能降解显色底物，并产生带有特殊颜色的代谢物，使菌落形成特定的颜色或形态，从而进行样品中微生物的培养和检测。本发明采用培养皿和无纺布为载体，进行细菌菌落总数培养、检测，菌落清晰可见，易于判读和分析，检测准确度达国标90％以上，能够满足实际检测需求。

有益效果：

1.通过培养基优化，获得一种适用于细菌菌落总数生长的培养基；以透气性好、吸附性强、大小合适的无纺布材料作为培养基的载体，通过无纺布的前处理，培养基的吸附及烘干，将培养基附着在测试片上；通过将待测样品直接接种于测试片上，实现对待测样品中细菌菌落总数的快速培养和检测。

2.本发明快速检测细菌菌落总数的测试皿，与现有测试片相比，避免了由于涂布不均及盖膜不当产生气泡的现象，气泡的产生和存在，对于检测样品的计数结果将产生较大影响，避免了人为操作不当引起的误差。同时，采取培养皿为载体，利用特有的培养基配方，可实现细菌菌落总数立体生长，使其便于观察和区分。

3.本发明快速检测细菌菌落总数的测试皿，具有使用简便，可以长期存放，应用灵活的特点，可大大节省培养基配置、培养皿灭菌、清洗等处理的时间，降低了劳动强度，缩短了检测时间。同时，本发明测试皿制备方法简单、易行，能够实现自动化生产，成本低廉，使用方便。

附图说明

图1为本发明测试皿制备流程图；

图2为本发明测试皿的阳性显色图。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制，本发明试剂如无特别说明，均为常规试剂。

实施例1快速检测细菌菌落总数的测试皿的组成

快速检测细菌菌落总数的测试皿，包括无菌玻璃培养皿和直径为50-70mm的无纺布，无纺布平铺于无菌培养皿底部，无纺布上均匀涂布有细菌菌落特征显色液体培养基。

细菌菌落特征显色液体培养基含有胰蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、磷酸氢二钾、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、显色酶解底物混合剂，其中显色酶解底物混合剂由2,3,5-氯化三苯基四氮唑与NBT按1～2:1比例溶解于N,N-二甲基甲酰胺得到的。

细菌菌落总数特征显色液体培养基的成分，100mL，表1

表1细菌菌落总数特征显色液体培养基的成分，100mL

胰蛋白胨、酵母粉购自广东环凯微生物科技有限公司，葡萄糖、磷酸氢二钾、氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸镁购自国药集团化学试剂有限公司，2,3,5-氯化三苯基四氮唑、NBT购自生工生物工程(上海)股份有限公司，N,N-二甲基甲酰胺购自天津市科密欧化学试剂有限公司。

每份快速检测细菌菌落总数的测试皿检测一个样品。

实施例2快速检测细菌菌落总数的测试皿的制备，制备流程见图1

2.1细菌菌落特征显色液体培养基的制备

其中100mL细菌菌落特征显色液体培养基配制的方法：称量胰蛋白胨1.6g、酵母粉0.65g、葡萄糖3.0g、磷酸氢二钾0.08g、氯化钠0.1g、磷酸二氢钾0.3g、硫酸镁0.3g，于烧杯中加蒸馏水100mL加热搅拌溶解，在121℃高压灭菌锅条件下灭菌15min，冷却至室温后，加入经过滤灭菌的显色酶解底物混合剂0.030g，得到细菌菌落特征显色液体培养基，在0～4℃下冷藏备用。

2.2各组件前处理：

2.2.1无纺布的前处理：辐照剂量为2KGy

2.2.2无菌培养皿的前处理：辐照剂量为2KGy

2.3测试皿的制备：将经步骤2.2.1辐照处理后的无纺布平铺于经2.2.2步骤处理的无菌培养皿的底部后，置于平面超净工作台上，用紫外线照射30min，然后将步骤2.1的得到的细菌菌落特征显色液体培养基均匀添加于无纺布上，于35～95℃烤制4h后，盖上无菌培养皿上盖，得到快速检测细菌菌落总数的测试皿，置于抽真空铝箔包装袋中。即得到快速检测细菌菌落总数的测试皿，得到的产品置于2～8℃环境下，保存期限能达到1年。

实验例 待检样品中细菌菌落总数的测定

使用上述制备得到的快速检测细菌菌落总数的测试皿检测待检样品。

首先样品处理：取样品25mL(g)放入含有225mL灭菌稀释液(磷酸盐稀释液或生理盐水)的取样器或均质杯内，制成1:10的样品匀液，用1mL的灭菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，注入含有9mL灭菌稀释液的试管内，摇匀后得到1:100的样品稀释液，按照上述操作步骤依次往下稀释，制备10倍递增系列的样品稀释匀液。一般样品选2～3个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品可直接吸取原液进行检测。

其次接菌培养：将测试皿置于平坦台面，打开测试皿上盖，用灭菌枪头或滴管吸取1mL样品匀液加到测试片上，调整测试片角度使样品液浸润整张测试片，盖上测试皿上盖，进行培养。每个稀释度接种两片，同时取1mL无菌生理盐水接种另一测试皿作空白对照。将接种好的测试皿放置于37±1℃培养箱中培养18～24h。

上述磷酸盐稀释液的配制：称取34.0g的分析纯磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用175mL的1mol/LNaOH调节pH至6.0，用蒸馏水稀释至1000mL后，取1.25mL,用蒸馏水继续稀释至1000mL，分装于干净的适量容器中，121℃高压灭菌15min。

上述生理盐水的配制：取8.5g分析纯氯化钠溶解到1000mL蒸馏水或纯净水中，充分混匀溶解，分装到适量容器后，121℃高压灭菌15min。

最后分析检测结果：

1.培养后测试片上呈现红点菌落的计为细菌。

2.计数

选取30～300CFU数值之间的测试皿，根据菌落形态计数菌落总数。

1)如只有一个稀释度测试片上的菌落数在适宜计数范围内，计算该稀释度两个测试片菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，计数为每克(或每毫升)中菌落总数。

2)若两个连续的稀释度的测试片菌落数在适宜计数范围内时，按式(1)计算：

式中：

N▁样品中菌落数；

ΣC▁测试片上(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和；

n₁▁第一个适宜稀释度测试片数；

n₂▁第二个适宜稀释度测试片数；

d▁稀释因子(第一个稀释度)

3)若所有稀释度的测试片上菌落数均大于300CFU，则对稀释度最高的测试片进行计数，其他测试片可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以相应稀释倍数计算。

4)若所有稀释度的测试片菌落数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算；若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

5)若有稀释度的测试片菌落数均不在30～300CFU之间，其中一部分小于30或大于300时，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

6)若高稀释度的测试片上的菌落数大于300CFU，计数最高稀释度的测试片上的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。

发明人用本发明测试片法、国家标准检测法对样品中的细菌菌落总数进行检测，对比结果如下：

将生菜样品用灭菌生理盐水稀释至10^-2、10^-3、10^-4三个梯度。用灭菌枪头或滴管吸取1mL待测生菜样品菌液接种于国标培养基和本发明的测试皿上，以1mL灭菌生理盐水作为空白对照，在37±1℃条件下，培养24h后，记录观察结果如下表2：

表2不同的检测方法检测结果比对表(培养时间24h，培养温度37±1℃)

结果表明，实验例本发明测试皿与国标的符合度高达107.9％。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。