一种重组鸡干扰素λ（rChIFN‑λ）基因的克隆表达及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物工程技术领域中的干扰素领域，具体涉及一种重组鸡干扰素λ(rChIFN-λ)基因的克隆表达及其制备方法和应用。

背景技术：

IFN-λ是近年来新发现的一类细胞因子，命名为Ⅲ型干扰素，其家族成员包括IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3与IFN-λ4，但鸡IFN-λ只有一种ChIFN-λ,DNA片段为561bp，蛋白大小约为22kDa。鸡IFN-λ具有一对特异的功能受体复合体(IFN-λR1/IL-10R2)，当鸡IFN-λ与受体复合体结合时，导致受体异二聚体化，可激活下游JAK-STAT信号转导，从而发挥广泛的生物学效应，包括抗病毒效应、免疫调节与抗肿瘤等等。已经有研究表明IFN-λ在一下病毒中发挥良好的抗病毒效应，比如，流感病毒、单纯疱疹病毒、肝炎病毒等。

新城疫是由禽副黏病毒科新城疫病毒(Newcastle Disease,ND)引起的一种禽类急性、高度接触性传染病，主要侵害鸡与火鸡。该病主要损害消化道、胃肠道与神经系统。新城疫不仅严重危害养禽业，同时也对世界经济业造成巨大损失，被世界动物卫生组织列为法定报告疾病，被中国列为一类动物疫病。

技术实现要素：

本发明目的在于发明一种高效抗病毒活性重组鸡干扰素λ(rChIFN-λ)基因的克隆表达及其制备方法和应用。本发明所述的鸡干扰素λ生产简便，成本低，活性高，对新城疫和流感有良好的治疗效果。

本发明的第一目的是提供上述重组鸡干扰素λ(rChIFN-λ)蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的另一目的是提供该蛋白的生产方法和原核表达质粒pET32a-rChIFNλ的制备方法。

本发明的再一目的是提供该蛋白在细胞上抑制病毒繁殖和在临床上治疗动物病毒性疫病的应用和效果。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

步骤一：引物设计与合成。根据Genbank提供的鸡IFN-λ的基因序列(GenBank no.KF680102.1)，设计一对引物IFN-λ-F1,IFN-λ-R1，通过SignalP预测并除去信号肽，设计引物，分别在上下游插入EcoR1与Hind3两个酶切位点，为IFN-λ-F,IFN-λ-R。序列如下：

IFN-λ-F1：ATGGTATGCTACGGGGTCAC

IFN-λ-R1：CTAAGTGCAATCCTCGCGCTG

IFN-λ-F：CCGGAATTCCAGGTCACCCCGAAGAA

IFN-λ-R：CCCAAGCTTCTAAGTGCAATCCTCGCGCTGGGC

步骤二：基因克隆与鉴定。用SPF鸡胚自制鸡胚成纤维(CEF)细胞，使用POLY(I:C)刺激2h后，抽提RNA，经反转得到扩增鸡IFN-λ基因的模板cDNA，使用IFN-λ-F,IFN-λ-R引物扩增出鸡IFN-λ去信号肽的基因片段。

步骤三：将基因克隆至pMD-19T载体。将鸡IFN-λ基因连接至pMD-19T载体，16℃连接4h以上，转化至含氨苄琼脂平板，挑取单克隆菌放入LB培养基中摇菌，菌液PCR鉴定出阳性克隆，测序正确后扩大培养，提取质粒pMD-19T-rChIFN-λ。

步骤四：构建pET32a-rChIFN-λ重组质粒。分别将pMD-19T-rChIFN-λ与pET32a空载体用EcoR1与Hind3快切酶双酶切，胶回收后用T4连接酶，常温连接30min以上，转化至含氨苄琼脂平板，挑取单克隆菌放入LB培养基中摇菌，菌液PCR鉴定出阳性克隆，测序正确后扩大培养，提取重组质粒pET32a-rChIFN-λ。

本发明的有益效果如下：

本发明能提炼出较高浓度与活性的蛋白，为后续实验打下良好基础，且在细胞层面有良好抗病毒活性，针对鸡新城疫在动物体内有显著疗效。

附图说明

图1为PCR扩增的鸡IFN-λ基因琼脂糖核酸电泳图；其中，泳道M为DNA marker DL2000，泳道1为阴性对照，泳道2为chIFN-λ基因扩增结果。

图2为SDS-PAGE鉴定重组鸡干扰素λ(rChIFN-λ)蛋白表达结果图；其中，泳道M为低分子量蛋白Marker，泳道1为pET-32a空载体包涵体变性前，泳道2为pET-32a空载体包涵体复性后，泳道3为重组鸡干扰素λ(rChIFN-λ)包涵体变性前，泳道4为重组鸡干扰素λ(rChIFN-λ)包涵体复性后。

图3为Western blot鉴定重组鸡干扰素λ(rChIFN-λ)蛋白表达结果图；其中，泳道M为低分子量蛋白Marker，泳道1为pET-32a空载体上清对照，泳道2为pET-32a空载体包涵体对照，泳道3为重组鸡干扰素λ(rChIFN-λ)上清，泳道4为重组鸡干扰素λ(rChIFN-λ)包涵体沉淀。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但本发明并不限于此。

实施例1鸡IFN-λ基因原核表达载体的构建

(1)相关引物设计与合成

引物设计是根据Genbank提供的鸡IFN-λ的基因序列(GenBank no.KF680102.1)，设计一对引物IFN-λ-F1,IFN-λ-R1，通过SignalP预测并除去信号肽，设计引物，分别在上下游插入EcoR1与Hind3两个酶切位点，为IFN-λ-F,IFN-λ-R。序列如下：

IFN-λ-F1：ATGGTATGCTACGGGGTCAC

IFN-λ-R1：CTAAGTGCAATCCTCGCGCTG

IFN-λ-F：CCGGAATTCCAGGTCACCCCGAAGAA

IFN-λ-R：CCCAAGCTTCTAAGTGCAATCCTCGCGCTGGGC

(2)基因克隆与鉴定

取10日龄SPF鸡胚，用镊子去除头、四肢和内脏，将鸡肉剪碎后胰酶消化4min,过滤，制成CEF细胞，传代一次之后，使用POLY(I:C)刺激，2h后，弃上清，取细胞样品抽提RNA，经反转得到扩增鸡IFN-λ基因的模板cDNA，先使用IFN-λ-F1,IFN-λ-R1扩增出鸡IFN-λ基因，再使用IFN-λ-F,IFN-λ-R引物进行扩增，扩增出鸡IFN-λ基因去信号肽片段。反应体系如下：25μl Premix ExTaq酶，2.5μl模板DNA(cDNA)，0.5μl上游引物，0.5μl下游引物，蒸馏水补至50μl。反应程序如下：94℃预变性4min,94℃变性1min,55℃退火30s,72℃延伸40s,72℃延伸7min，其中第2至第4步35个循环。核酸电泳条带大小约492bp。

(3)将基因克隆至pMD-19T载体

将rChIFN-λ基因连接至pMD-19T载体，反应体系如下：5.0μl Ligation SolutionⅠ，0.5μl pMD 19-T vector，4.5μl chIFN-λ+αPCR回收产物。16℃连接4h以上，用DH5α感受态转化至含氨苄琼脂平板，37℃放置过夜，挑取单克隆菌放入含氨苄LB培养基中摇菌6-8h，菌液PCR鉴定出阳性克隆，反应体系如下：7.5μl Premix rTaq酶,6.1μl ddH₂O，0.2μl上游引物IFN-λ-F，0.2μl下游引物IFN-α-R，1.0μl菌液，反应程序如下：94℃预变性4min,94℃变性1min,55℃退火30s,72℃延伸40s,72℃延伸7min，其中第2至第4步30个循环。挑选鉴定阳性样品送测序，测序正确后扩大培养，提取质粒pMD-19T-rChIFN-λ。

(4)pET32a-rChIFN-λ重组质粒构建

分别将pMD-19T-rChIFN-λ与pET32a空载体用EcoR1与Hind3快切酶双酶切，反应体系如下：1.5μl EcoR1酶，1.5μl Hind3酶，5μl 10×Buffer,2-5μg质粒，ddH₂O补至50μl，37℃水浴30min。胶回收后用T4连接酶，酶切产物按照pMD-19T-rChIFN-λ：pET32a空载体＝3:1的比例加入8μl，1μl T4连接酶，1μl T4连接Buffer，常温连接30min以上，转化至含氨苄琼脂平板，挑取单克隆菌放入含氨苄LB培养基中摇菌，菌液PCR鉴定出阳性克隆，送测序，测序正确后扩大培养，提取重组质粒pET32a-rChIFN-λ+α。

实施例2蛋白表达与鉴定

将重组质粒pET32a-rChIFN-λ用BL21感受态转化，单克隆菌扩大培养后，按照1:100比例接种氨苄LB培养基，37℃摇床培养，直至OD600nm值为0.6左右时，加入IPTG诱导表达后，菌液离心，弃上清，PBS重悬、离心清洗2次后，超声破碎仪200W裂解15min，4℃离心分离出沉淀，用预冷PBS清洗2次，用含8M尿素的Lysis Equilibration Buffer溶解包涵体，室温孵育60min，4℃离心出去不溶杂质，上清用0.45μm滤器过滤，将其与Ni柱结合，用不同浓度咪唑洗脱液洗脱直至OD280值为0，最后用含有250mmol/L咪唑的Elution Buffer洗脱，收集滤液。将滤液放入用EDTA处理过的透析袋中，分别用8M,6M,4M,2M,0M,PBS进行梯度透析，每次间隔12h，最后用SDS-PAGE鉴定。

实施例3体外抗病毒活性鉴定

将DF-1细胞铺板至96孔板细胞板，待长至80％-90％，将rChIFN-λ以4倍梯度稀释100μl加入每孔，分别从4^-1-4^-10,，每个梯度24个重复，于37℃孵育12h，分别将100TCID50VSV,NDV,AIV病毒加入，100μl每孔，于37℃孵育1h，将病毒液弃掉，用PBS洗2次，换上2％血清DMEM，放于37℃48h，检测病毒含量。结果显示：rChIFN-λ对DF-1细胞产生良好的保护能力，在体外DF-1细胞上有良好的VSV,AIV抗病毒活性，分别为1.87*10³IU/mg，7.8*10³IU/mg。

实施例4体内抗病毒活性鉴定

在2周龄SPF鸡上检测rChIFN-λ抗病毒活性。给2周龄SPF鸡静脉注射100μg rChIFN-λ，4h后，以同样的量再次进行静脉注射，再隔2h后注射攻新城疫病毒。之后1、3、5、7、9、11天采集咽拭子与泄殖腔拭子，普通鸡胚接胚检测排毒；每日观察鸡采食与精神状况；记录死亡情况。结果显示：rChIFN-λ组对SPF鸡的保护率可达到33％,而攻毒对照组的存活率仅8％；此外，咽拭子与泄殖腔拭子结果显示，rChIFN-λ组与攻毒对照组比较，可推迟4-9d排毒，且排毒量明显降低；rChIFN-λ组的SPF鸡采食正常，精神良好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

华南农业大学

一种重组鸡干扰素λ（rChIFN-λ）基因的克隆表达及其制备方法和应用

（1） 鸡IFN-λ基因

ATGGTATGCT ACGGGGTCAC AATTATTTTG GTGGGGACCC TGGGGTCCCT CCTGGTGGGT 60

GCCTTCCCCC AGGTCACCCC GAAGAAGAGC TGCAGCCTCT CCAAGTACCA GTTCCCTGCA 120

CCTTTGGAGT TGAAGGCAGT GTGGAGGATG AAGGAGCAGT TTGAAGACAT CATGCTGTTA 180

ACAAACAGAA AATGCAACAC CAGACTCTTC CATCGGAAGT GGGACATAGC TGAGCTGTCG 240

GTACCTGACC GAATCACCCT GGTGGAGGCT GAGCTGGACC TCACCATCAC CGTGCTCACA 300

AACCCCACAA CCCAGAGACT GGCAGAGACG TGCCAACAGC CCCTGGCCTT CCTTACCCAA 360

GTCCAGGAGG ACCTGCGAGA CTGCTTGGCC CTCGAGGCAC CTTCACATCA GCCCTCTGGG 420

AAACTGAGGC ACTGGCTGCA GAAGCTGGAG ACAGCCAAGA AGAAGGAGAC CGCCGGCTGC 480

CTGGAGGCCT CAGCCATCCT CCACATCTTC CAAGTACTGA ACGACCTGCG GTGGCAGCCC 540

AGCGCGAGGA TTGCACTTAG 560

（2） IFN-λ-F1

ATGGTATGCT ACGGGGTCAC 20

（3） IFN-λ-R1

CTAAGTGCAA TCCTCGCGCT G 21

（4） IFN-λ-F

CCGGAATTCC AGGTCACCCC GAAGAA 26

（5） IFN-λ-R

CCCAAGCTTC TAAGTGCAAT CCTCGCGCTG GGC 33