双黄酮‑铜配合物及其制备方法和应用与流程

本发明属于有机合成、医药领域，具体涉及一种双黄酮-铜配合物及其制备方法和应用。

背景技术：

双黄酮类化合物是裸子植物特有的化学成分，例如银杏、卷柏等，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等生物活性。其中，穗花杉双黄酮(Amentoflavone，Ame)是双黄酮类化合物中较为常见的一种，其结构式如下所示：

Sun等研究发现穗花杉双黄酮通过激活hPPARγ来提高抗癌基因的表达，从而达到抑制乳腺癌细胞和宫颈癌细胞的效果[Lee E.,Shin S.,Lee J.etal.Cytotoxic activities of amentoflavone against human breast and cervical cancers are mediated by increasing of pten expression levels due to peroxisome proliferator-activated receptor γactivation[J].Bulletin of the Korean Chemical Society,2012,33(7):2219-2223.]。Chen等研究发现穗花杉双黄酮通过抑制因子NF-kappaB的活性，阻碍血管的生成和癌细胞的新陈代谢，达到抑制肿瘤细胞生长的目的[Chen J.H.,Chen W.L.,Liu Y.C.Amentoflavone induces anti-angiogenic and anti-metastatic effects through suppression of NF-kappa B activation in MCF-7cells[J].Anticancer Research,2015,35(12):6685-6693.]。Lee等研究发现，穗花杉双黄酮可以抑制由紫外辐射引起的金属蛋白酶的表达，从而起到抗氧化、防辐射的作用[Lee C.W.,Na Y.,Park N.,etal.Amentoflavone inhibits UVB-induced matrix metalloproteinase-1expression through the modulation of AP-1 mponents in normal human fibroblasts[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2012,166:1137-1147.]。Zhang等研究发现穗花杉双黄酮和银杏黄素具有一定的抗氧化活性，去除DPPH自由基的能力较强[Zhang Y.P.,Shi S.Y.,Wang Y.X.,etal.Target-guided isolation and purification of antioxidants from Selaginella sinensis by offline coupling of DPPH-HPLC and HSCCC experiments[J].Journal of Chromatography B,2011,879:191-196.]。Li等研究表明，穗花杉双黄酮具有抗氧化活性，可有效清除OH^-·，O₂^-·，DPPH·，ABTS⁺·等自由基，并可以保护DNA免受OH^-·引起的氧化损伤[Li X.C.,Wang L.,Han W.J.,etal.Amentoflavone protects against hydroxyl radical-induced DNA damage via antioxidant mechanism[J].Turkish Journal of Biochemistry-Turk Biyokimya Dergisi,2014,39(1):30-36.]。

中药配位化学表明，微量元素和有机化合物反应生成的配合物存在着配合平衡，所以可以呈现出原来成分的生物活性；又由于微量元素间、有机成分间、配合物间以及它们相互间的协同和拮抗作用可以减弱或增强原有各成分的生物活性，也可能产生新的生物活性[曹治权.中药药效的物质基础和作用机理研究新思路(一)-中药中化学物种形态和生物活性关系的研究[J].上海中医药大学学报,2000,14(1):36-39.]。例如，Zhou等研究发现槲皮素稀土配合物清除O₂^-·的能力均强于槲皮素，槲皮素稀土配合物可以抑制多种肿瘤，且抗肿瘤活性均强于槲皮素，其中配合物对膀胱肿瘤细胞具有较强的抑制作用，而槲皮素无此作用[Zhou J.,Wang L.F.,Wang J.Y.,etal.Synthesis,characterization,antioxidative and antitumor activities of solid quercetin rare earth(III)complexes[J].Journal of Inorganic Biochemistry,2001,83:41-48.]。

然而，到目前为止，有关双黄酮配合物的合成及其生物活性的研究未见报道。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种穗花杉双黄酮-铜配合物，满足抗肿瘤和抗氧化活性药物的使用需求。本发明的另一目的是提供一种上述双黄酮-铜配合物的制备方法。本发明还有一目的是提供双黄酮-铜配合物的应用。

技术方案：为实现上述发明目的，本发明的技术方案为：

双黄酮-铜配合物，结构式如下：

X为NO₃^-或Cl^-。

一种制备所述双黄酮-铜配合物的方法：将铜盐用醇溶解后加入到双黄酮的醇溶液中，控制pH为5-7，加热搅拌，反应2-5h，有沉淀产生，将沉淀过滤，用醇和水洗涤后用二甲亚砜作为溶剂重结晶，干燥，得双黄酮-铜配合物。

所用双黄酮为穗花杉双黄酮，但不局限于穗花杉双黄酮，泛指具有5-OH和4-C＝O或5”-OH和4”-C＝O的双黄酮类化合物。

所用铜盐为硝酸铜、氯化铜等醇溶性铜盐。

所用溶剂为包括乙醇、甲醇及不同浓度的甲醇、乙醇水溶液等。

用碱的醇溶液调节pH值，所用碱包括氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、乙醇钠、甲醇钠等常用碱类。

反应时，加热温度为30-50℃，反应时间为2-5h。

溶液中双黄酮与铜离子的摩尔比为2-2.5：1。

重结晶所用溶剂为二甲亚砜，干燥方法为冷冻干燥、低温真空干燥等。

所述双黄酮-铜配合物在制备抗肿瘤药物和/或抗氧化药物中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明首次合成得到了穗花杉双黄酮-铜配合物，采用MTT法研究了Ame-Cu配合物的抗肿瘤活性，结果表明，Ame-Cu配合物抑制肝癌细胞(HepG2)和宫颈癌细胞(HeLa)的能力强于Ame本身，紫外-可见吸收光谱、荧光光谱和粘度法表明Ame-Cu配合物抗肿瘤活性的机理可能是配合物与嵌入式插入DNA，引起细胞凋亡。邻苯三酚自氧化法、ABTS法显示Ame-Cu配合物清除自由基能力强于Ame本身，说明配合物的抗氧化活性强于Ame；有利于进一步开发双黄酮类化合物，为新药研究提供依据，有利于人类健康事业的发展。

附图说明

图1是Ame和Ame-Cu配合物的红外光谱谱图；

图2是Ame和Ame-Cu配合物的紫外-可见吸收光谱谱图；

图3是Ame质谱图；

图4是Ame-Cu配合物的质谱图；

图5是Ame和Ame-Cu配合物对HepG2细胞的抑制作用结果图；

图6是Ame和Ame-Cu配合物对HeLa细胞的抑制作用结果图；

图7是fDNA对Ame紫外-可见吸收光谱的影响结果图；

图8是fDNA对Ame-Cu配合物紫外-可见吸收光谱的影响结果图；

图9是Ame对fDNA-EB体系荧光发射光谱的影响结果图；

图10是Ame-Cu配合物对fDNA-EB体系荧光发射光谱的影响结果图；

图11是Ame和Ame-Cu配合物对fDNA溶液粘度的影响结果图；

图12是Ame对邻苯三酚自氧化速率的影响结果图；

图13是Ame-Cu配合物对邻苯三酚自氧化速率的影响结果图；

图14是Ame对ABTS⁺·自由清除能力结果图；

图15是Ame-Cu配合物对ABTS⁺·自由清除能力结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

精确称取53.8mg Ame于圆底烧瓶中，用5mL乙醇溶解，精确称量三水合硝酸铜12.1mg，用5mL乙醇溶解，将硝酸铜溶液滴加到Ame溶液中，向反应溶液中滴加乙醇-氨水(V/V,3:1)溶液，调节pH为6，保持30℃反应4-5h，产生沉淀，过滤，依次用乙醇、水洗涤，DMSO重结晶，冷冻干燥得Ame-Cu配合物。

实施例2

精确称取53.8mg Ame于圆底烧瓶中，用5mL90％的乙醇溶解，精确称量三水合硝酸铜12.1mg，用5mL90％的乙醇溶解，将硝酸铜溶液滴加到Ame溶液中，向反应溶液中滴加乙醇-乙醇钠溶液，调节pH为5，保持30℃反应4-5h，产生沉淀，过滤，依次用乙醇、水洗涤，DMSO重结晶，冷冻干燥得Ame-Cu配合物。

实施例3

精确称取53.8mg Ame于圆底烧瓶中，用5mL甲醇溶解，精确称量三水合硝酸铜12.1mg，用5mL甲醇溶解，将硝酸铜溶液滴加到Ame溶液中，向反应溶液中滴加甲醇-甲醇钠溶液，调节pH为7，保持40℃反应3-4h，产生沉淀，过滤，依次用甲醇、水洗涤，DMSO重结晶，冷冻干燥得Ame-Cu配合物。

实施例4

精确称取53.8mg Ame于圆底烧瓶中，用5mL85％的甲醇溶解，精确称量三水合硝酸铜12.1mg，用5mL85％的甲醇溶解，将硝酸铜溶液滴加到Ame溶液中，向反应溶液中滴加甲醇-甲醇钠溶液，调节pH为7，保持50℃反应2-3h，产生沉淀，过滤，依次用甲醇、水洗涤，DMSO重结晶，冷冻干燥得Ame-Cu配合物。

实施例5

精确称取53.8mg Ame于圆底烧瓶中，用5mL乙醇溶解，精确称量二水合氯化铜8.5mg，用5mL乙醇溶解，将氯化铜溶液滴加到Ame溶液中，向反应溶液中滴加乙醇-氨水(V/V,3:1)溶液，调节pH为6，保持30℃反应4-5h，产生沉淀，过滤，依次用乙醇、水洗涤，DMSO重结晶，冷冻干燥得Ame-Cu配合物。

实施例6

精确称取53.8mg Ame于圆底烧瓶中，用5mL90％的乙醇溶解，精确称量二水合氯化铜8.5mg，用5mL90％的乙醇溶解，将氯化铜溶液滴加到Ame溶液中，向反应溶液中滴加乙醇-乙醇钠溶液，调节pH为5，保持30℃反应4-5h，产生沉淀，过滤，依次用乙醇、水洗涤，DMSO重结晶，冷冻干燥得Ame-Cu配合物。

实施例7

精确称取53.8mg Ame于圆底烧瓶中，用5mL甲醇溶解，精确称量二水合氯化铜8.5mg，用5mL甲醇溶解，将氯化铜溶液滴加到Ame溶液中，向反应溶液中滴加甲醇-甲醇钠溶液，调节pH为7，保持40℃反应3-4h，产生沉淀，过滤，依次用甲醇、水洗涤，DMSO重结晶，冷冻干燥得Ame-Cu配合物。

实施例8

精确称取53.8mg Ame于圆底烧瓶中，用5mL85％的甲醇溶解，精确称量二水合氯化铜8.5mg，用5mL85％的甲醇溶解，将氯化铜溶液滴加到Ame溶液中，向反应溶液中滴加甲醇-甲醇钠溶液，调节pH为7，保持50℃反应2-3h，产生沉淀，过滤，依次用甲醇、水洗涤，DMSO重结晶，冷冻干燥得Ame-Cu配合物。

实施例9

对实施例1-8制备的产物进行表征，Ame和Ame-Cu配合物的红外光谱图如图1所示。由图可以看出，Ame在2800-3500cm^-1有宽的吸收，这是缔和羟基伸缩振动峰，因为Ame分子中5-OH和4-C＝O之间，5”-OH和4”-C＝O之间形成了分子内氢键。而Ame-Cu配合物中此处的吸收均变窄，且在3407cm^-1左右的峰形变得尖锐，说明形成配合物后，分子内氢键遭到破坏；Ame中1657cm^-1处的强峰为羰基的伸缩振动引起的，是羰基的特征吸收峰，形成配合物后，此处吸收峰向低波数移动，移动到1630cm^-1，说明羰基参与了配位；配合物在622cm^-1之间产生一吸收峰，这是Cu-O伸缩振动引起的，是氧原子参与配位的有力证明。因此，可以推测，Ame中的羰基、羟基参与了配位，而最可能的配位点为5-OH，4-C＝O，5”-OH和4”-C＝O。

Ame和Ame-Cu配合物的紫外-可见吸收光谱如图2所示，Ame在337nm(带I)和270nm(带II)处有两个特征吸收峰，这是黄酮类化合物的特征吸收，带I和带II分别对应着桂皮酰系统和苯甲酰系统的紫外吸收，均为π-π*的跃迁引起的。Ame-Cu配合物在375-450nm之间产生吸收平台，为带I红移所致，说明桂皮酰系统参与了配位，带II虽然位置没有明显变化，但是吸收强度相对降低，且在298nm处还产生了新的吸收峰，这些现象表明共属于桂皮酰系统和苯甲酰系统的羰基参与了配位，配位后，共轭体系增大，电子跃迁所需要能量降低，π-π*更易发生，故带I发生红移。而4-C＝O更易发生n-π*跃迁，故在298nm处产生一新峰。可以推断，Cu²⁺与Ame形成配合物的位点为5-OH，4-C＝O，5”-OH，4”-C＝O。

在正离子模式下，分别对Ame及Ame-Cu配合物作了质谱分析，并根据质谱模拟得到谱图上分子离子峰对应的离子结构式，并由此推断出Ame-Cu的结构。

图3为Ame在正离子模式的质谱图，准分子离子峰m/z 539.0920归属为[Ame+H]⁺。图4a为Ame-Cu配合物的质谱图，由图中可以看出，Ame-Cu配合物主要准分子离子峰为带两个正电荷的离子峰，且均带一个正电荷，分别为m/z678.0256和m/z 756.0403。图4b为离子峰m/z 678.0256的同位素质谱图，可以看到离子峰m/z 678.0256的同位素峰为m/z 679.0284，m/z 680.0243，m/z 681.0268，m/z 682.0297，相邻离子峰的分子量分别相差1.0028，0.9959，1.0025，1.0029，从而证实，该离子峰带一个正电荷。由红外光谱和紫外-可见光谱可知，Ame与Cu²⁺形成配合物的配位点为5-OH，4-C＝O，5”-OH，4”-C＝O，由于重结晶和溶解配合物的溶剂为DMSO，DMSO含有氧原子和硫原子，具有强的的配位能力，且较难电离，故配合物中可能含有DMSO，由此推测m/z 678.0256归属为[Cu(Ame-H)(DMSO)]⁺，元素组成为C₃₂H₂₃O₁₁CuS，与m/z 678.0256可能的元素组成一致(图4c)。同时，采用质谱模拟软件对[Cu(Ame-H)(DMSO)]⁺进行模拟，得到模拟质谱图，如图4d所示。由图可以看出[Cu(Ame-H)(DMSO)]⁺的同位素离子峰分别为m/z 678.0252，m/z 679.0285，m/z 680.0234，m/z 681.0267，m/z 682.0301，与m/z 678.0256的同位素质谱峰匹配度很高，因此，可以证实，离子峰m/z 678.0256对应的离子为[Cu(Ame-H)(DMSO)]⁺。同理，离子峰m/z 826.0636(图4e)对应的离子为[Cu(Ame-H)(DMSO)₂]⁺。综上所述，Ame与Cu²⁺形成了1:1的配合物，红外光谱和紫外-可见光谱证实Ame与Cu²⁺形成配合物的配位点为5-OH，4-C＝O，5”-OH和4”-C＝O，由于5”-OH的活性比5-OH的高，因此，Ame与Cu²⁺形成的配合物的配位点为5”-OH和4”-C＝O可能性最大，故[Cu(Ame-H)(DMSO)]⁺和[Cu(Ame-H)(DMSO)₂]⁺最有可能的结构式如下所示：

可以发现离子[Cu(Ame-H)(DMSO)]⁺和[Cu(Ame-H)(DMSO)₂]⁺结构相似，区别仅是含有不同数量的DMSO分子，其原因是离子[Cu(Ame-H)(DMSO)₂]⁺在仪器电压作用下失去一个DMSO，因此，配合物离子的结构为[Cu(Ame-H)(DMSO)₂]⁺。此外，由于试验中金属盐为硝酸盐或盐酸盐，故配合物中含有硝酸根或氯离子，因此，Ame-Cu配合物结构式如下所示：

X为NO₃^-或Cl^-。

实施例10

采用MTT法研究了Ame和Ame-Cu配合物的抗肿瘤活性，过程如下：

(1)将HepG2、HeLa细胞株悬浮液接种于96孔培养板，每孔加100μL，(1×10⁵个/mL)，37℃，于5％CO₂培养箱中培养24h；

(2)培养24h后，弃上清液，加入100μL预先稀释好的样品，每个浓度设10个复孔，于5％CO₂培养箱中培养24h；同时设置对照孔(DMSO、细胞液、MTT)、调零孔(培养基、DMSO、MTT)；

(3)培养36h后，弃上清液，加入100μL含MTT(5mg/mL)的DMEM培养基，继续培养4h；

(4)4h后小心去除上清，每孔加200μL DMSO，在恒温振荡器中充分振荡15min，酶标仪595nm处测定吸光度值，通过OD值计算样品对HepG2、HeLa细胞的抑制率，运用改良Karber公式算出半数抑制浓度IC₅₀值。

lgIC₅₀＝Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4) (公式2)

式中，IR为抑制率，OD₀为对照组的吸光度，OD₁为样品组的吸光度，Xm为lg(最大剂量)，I为lg(最大剂量/相邻剂量)，P为阳性反应率之和，Pm为最大阳性反应率，Pn为最小阳性反应率。

结果如图5-6所示。实验发现Ame-Cu配合物能有效抑制肝癌细胞HepG2和宫颈癌细胞HeLa的生长，IC₅₀值分别为5.638和5.247μmol·L^-1，比Ame的IC₅₀值小(Ame的IC₅₀值分别为13.633和8.040μmol·L^-1)，说明Ame-Cu配合物抗肿瘤活性较好，且强于Ame。采用紫外-可见光谱法、荧光光谱法和粘度法研究了Ame和Ame-Cu配合物与鲱鱼精DNA(fDNA)的相互作用，以进一步揭示抗肿瘤活性的机理，所得图谱如图7-11所示，结果表明，Ame和Ame-Cu配合物与fDNA的相互作用为嵌插模式，且配合物与fDNA作用能力均强于Ame。由此可以推测，Ame及其配合物的抗肿瘤活性的机理可能是Ame或其配合物进入细胞内部，与DNA链发生嵌插作用，引起细胞凋亡。由于配合物与DNA的相互作用强于Ame，故其抗肿瘤活性也强于Ame。

实施例11

采用邻苯三酚自氧化法、ABTS法研究了Ame和Ame-Cu配合物清除自由基能力，步骤如下：

(1)邻苯三酚自氧化法

邻苯三酚自氧化速率V₀的测定：25℃下，在10mL样品管中加入2mL的Tris-HCl缓冲液(pH＝8.20)，并加入100μL DMSO作为对照，加入0.8mL蒸馏水后，再加入浓度为2mmol·L^-1的邻苯三酚溶液0.2mL，混匀后倒入比色皿中，以纯水为空白，测定322nm处的吸光度，每10s记录一次A值，共反应4min。以t为横坐标，A为纵坐标进行线性回归，其直线斜率为V₀，测定三次，求平均值。

加入样品后邻苯三酚自氧化速率V₁的测定：25℃下，在10mL样品管中加入2mL的Tris-HCl缓冲液(pH＝8.2)，并加入100μL不同浓度的样品DMSO溶液，加入0.8mL蒸馏水后，再加入浓度为2mmol·L^-1的邻苯三酚溶液0.2mL，混匀后倒入比色皿中，以双蒸水为空白，测定322nm处的吸光度，每10s记录一次A值，共反应4min。以t为横坐标，A为纵坐标进行线性回归，其直线斜率为V₁，测定三次，求平均值。根据公式3计算自由基清除率。

SR(％)＝(1-v₁/v0)×100％ (公式3)

(2)ABTS法

空白样清除ABTS⁺·自由基离子能力测定：25℃下，在10mL样品管中加入2.9mL的ABTS⁺·自由基离子工作液，并加入100μL DMSO，反应5min后，测量紫外-可见光谱，并记录730nm处的吸收强度A₀。

样品清除ABTS⁺·自由基离子能力测定：25℃下，在10mL样品管中加入2.9ml的ABTS⁺·自由基离子工作液，并加入100μL不同浓度的样品DMSO溶液，反应5min后，测量紫外-可见光谱，并记录730nm处的吸收强度A₁。根据公式4计算ABTS⁺·自由基离子清除率。

SR(％)＝(1-A₁/A₀)×100％ (公式4)

如图12-15所示。邻苯三酚自氧化法结果表明Ame和Ame-Cu配合物清除O₂^-·自由基IC₅₀为23.273μmol·L^-1和4.5683μmol·L^-1，可以发现Ame-Cu配合物清除O₂^-·自由基的能力明显强于Ame。

Ame和Ame-Cu配合物对ABTS⁺·自由基的清除能力具有浓度依赖性，在一定的范围内，清除率与浓度呈线性关系。本发明绘制了清除率与浓度(c)的曲线，得到相应的线性方程，并计算得到最大半抑制浓度(IC₅₀值)，Ame和Ame-Cu配合物清除ABTS⁺·自由基的IC₅₀值分别为20.703和6.310μmol·L^-1，可以看出，Ame-Cu配合物清除ABTS⁺·自由基的能力明显强于Ame。

本发明首次合成得到了穗花杉双黄酮-铜配合物，并对其抗肿瘤和抗氧化活性进行研究，发现，配合物的抗肿瘤、抗氧化活性均强于双黄酮本身，开辟了双黄酮类配合物的研究工作，为新药研发提供了重要的参考价值。