一种耐干扰素的HBV细胞系模型的建立方法及其在制备抗HBV药物中的应用与流程

文档序号:11899104阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种耐干扰素的HBV细胞系模型的建立方法,其特征在于,包括以下步骤:

(1)培养HBV体外转染细胞株HepG2.2.15;

(2)将低浓度10~70IU·mL-1的干扰素IFNα-2b加入到细胞株HepG2.2.15中,同时加入遗传霉素G418进行长期诱导12~48wk获得HepG2.2.15/IFNα-2b细胞系模型。

2.根据权利要求1所述的一种耐干扰素的HBV细胞系模型的建立方法,其特征在于,所述步骤(1)中,在培养基DMEM中加入80mg·L-1G418、10%胎牛血清,2mmol/L谷氨酰胺,100IU/mL青、链霉素;pH7.2~7.4,所用培养条件为37℃,5%CO2,待细胞长成单层后,0.25%胰蛋白酶消化,每3~4d传代一次,获得HepG2.2.15。

3.根据权利要求1所述的一种耐干扰素的HBV细胞系模型的建立方法,其特征在于,所述步骤(2)中,HepG2.2.15细胞计数后分组,培养液中分别加入终浓度为0、10、30、50、70IU·mL-1的IFNα-2b,同时加380mg·L-1G418诱导,培养3~4d,待细胞长满后消化计数再培养,持续诱导培养12~48wk获得HepG2.2.15/IFNα-2b细胞系模型。

4.根据权利要求1所述的一种耐干扰素的HBV细胞系模型的建立方法,其特征在于,还包括以下步骤:在HepG2.2.15/IFNα-2b细胞系模型中加入最佳药效浓度的干扰素IFNα-2b,确定最佳刺激浓度和刺激时间。

5.根据权利要求4所述的一种耐干扰素的HBV细胞系模型的建立方法,其特征在于,所述最佳药效浓度的确定方法如下:

取HepG2.2.15细胞消化后计数,配制成3×104个mL-1接种于96孔培养板,2h后待细胞完全贴壁,分别给予不同浓度的IFNα-2b,阴性对照组不给药。继续培养96h,收集细胞上清液,HepG2.2.15细胞分泌标志物HBsAg、HBeAg、HBV DNA的受抑制程度最高的浓度为最佳药效浓度。

6.根据权利要求5所述的一种耐干扰素的HBV细胞系模型的建立方法,其特征在于,所述最佳刺激浓度的确定方法如下:

取刺激12wk的各组细胞,调整细胞浓度为3×104个mL-1,接种于96孔培养板,每孔100μL,2h后待细胞完全贴壁,移除培养液,加入含有最佳药效浓度的IFNα-2b培养液,96h后收集细胞上清液,比较不同刺激浓度的各组细胞上清液中HBsAg、HBeAg、HBV DNA的变化,从而确定最佳刺激浓度。

7.根据权利要求6所述的一种耐干扰素的HBV细胞系模型的建立方法,其特征在于,所述最佳刺激时间的确定方法如下:

选取上述最佳刺激浓度分别刺激不同刺激时间的细胞,调整细胞浓度为3×104个mL-1,接种于96孔培养板,每孔100μL,2h后待细胞完全贴壁,移除培养液,加入含有最佳药效浓度的IFNα-2b培养液,96h后收集细胞上清液,比较不同刺激时间的各组细胞上清液中HBsAg、HBeAg、HBV DNA的变化,从而确定最佳刺激时间。

8.一种如权利要求1所述的耐干扰素的HBV细胞系模型的建立方法在制备抗HBV药物中的应用。

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