本发明涉及(r)-和(s)-4-[(3-氨基-1-吡咯烷基)羰基]-n-(3-异噁唑基甲基)苯磺酰胺及其盐的合成方法、结构鉴定、对质子泵(h+,k+-atp酶)抑制活性以及抗胃溃疡疗效。
背景技术：
目前随着社会发展以及人们生活方式的变化，由于吸烟、饮酒、情绪紧张、药物刺激等因素引起的胃溃疡发病率逐渐增高，成为一种常见病和多发病，给患者带来极大的痛苦。
质子泵抑制剂(protonpumpinhibitors,ppis)是目前治疗胃溃疡最先进的一类药物(lih,mengl,liuf,etal.h+/k+-atpaseinhibitors:apatentreview.expertopintherpatents,2013,23:99–111)。胃酸是引起消化性溃疡及其他消化性疾病的重要因素之一，迅速强效地抑制胃酸分泌是目前治疗消化性溃疡的重要手段。胃酸分泌的最后步骤是胃壁细胞内质子泵(h+,k+-atp酶)驱动细胞内h+与小管内k+交换。ppis作用于关键靶点h+,k+-atp酶，阻断了胃酸分泌的最后通道，所以能抑制组胺、乙酰胆碱、胃泌素和食物刺激等各种因素引起的酸分泌，并且抑酸作用强，特异性高，持续时间长久(许国铭，钟捷.质子泵抑制剂——基础与临床.上海:上海科技教育出版社，2004)。
根据与h+/k+-atp酶作用的不同方式，ppis主要分为不可逆型和可逆型两大类(jainks,shahak,bariwalj,etal.recentadvancesinprotonpumpinhibitorsandmanagementofacid-pepticdisorders.bioorgmedchem,2007,15:1181-1205)。不可逆型ppis如苯并咪唑类化合物奥美拉唑(omeprazole)、兰索拉唑(lansoprazole)、泮托拉唑(pantoprazole)、埃索美拉唑(esomeprazole)等，其本身并无抑制h+/k+-atp酶活性的作用，但在胃壁细胞的酸性环境中，可以质子化发生smiles重排转变为次磺酸活性体，然后迅速与h+/k+-atp酶半胱氨酸残基上的巯基作用形成共价结合的二硫键，而与质子泵不可逆结合，使h+/k+-atp酶失活，从而抑制质子泵的泌酸功能(shinjm,choym,sachsg.chemistryofcovalentinhibitionofthegastrich+,k+-atpasebyprotonpumpinhibitors.jamchemsoc,2004,126:7800-7811)。可逆型ppis又称为钾竞争性酸阻滞剂(potassium-competitiveacidblockers,p-cabs)(anderssonk,carlssone.potassium-competitiveacidblockade:anewtherapeuticstrategyinacid-relateddiseases.pharmacology&therapeutics,2005,108:294-307)。此类药物通过占据质子泵k+亲和部位与k+竞争而抑制h+/k+-atp酶，这种抑制是可逆的，故其抗酸分泌作用迅速短暂。目前上市的p-cabs有韩国yuhan公司开发的瑞伐拉赞(revaprazan)，其ic50值为0.35μm(ph6.1)(hongyw,leeyn,kimhb,etal.processesforpreparationofpyrimidinederives:wo9818784[p],1998-05-07)，以及日本武田株氏会社开发的vonoprazan(tak-438，ic50＝19nm，ph6.5)(arikaway,nishidah,kurasawao,etal.discoveryofanovelpyrrolederivative1-[5-(2-fluorophenyl)-1-(pyridin-3-ylsulfonyl)-1h-pyrrol-3-yl]-n-methylmethanaminefumarate(tak-438)asapotassium-competitiveacidblocker(p-cab).jmedchem,2012,55:4446-4456)。
不可逆型ppis对质子泵的抑制作用较强，对胃酸抑制的程度较深；但长期用药，容易引起与胃酸缺乏有关的副反应，如消化不良、高胃泌素血症等，并可能引起胃分泌细胞的增生，形成类癌(lodatof,azzarolif,turcol,etal.adverseeffectsofprotonpumpinhibitors.bestpractice&researchclinicalgastroenterology,2010,24:193-201)。另外，不可逆型ppis由于起效慢，导致胃食管反流病(gerd)症状缓解较慢，夜间抑酸能力不足，难以克服夜间酸突破，发挥作用需要浓集和酶的活化，多次给药后才能发挥最大抑酸作用。而可逆型ppis具有亲脂性、弱碱性、在低ph值时稳定的特点。人和动物口服后能迅速吸收达到血浆浓度的峰值，不需要集中于胃壁细胞的微囊和微管，起效更快，升高ph的作用更强，并且离解后酶活立即恢复，具有更好的安全性(luoh-j,dengw-q,zouk.protonatedform:thepotentformofpotassium-competitiveacidblockers.plosone,2014,9(5):e97688)。
本发明以合理药物设计为指导，通过广泛筛选得到(r)-或(s)-4-[(3-氨基-1-吡咯烷基)羰基]-n-(3-异噁唑基甲基)苯磺酰胺为新型高活性可逆型质子泵抑制剂，其盐酸盐半数抑制浓度ic50值分别为7nm(r构型)、29nm(s构型)。本专利通过苯磺酰胺化、酰胺化和水解反应制备此种化合物，利用hplc-ms、nmr、ir等现代波谱技术鉴定了产物的化学结构，并测定了对质子泵(h+,k+-atp酶)的抑制活性以及抗胃溃疡活性。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种新型高活性可逆型质子泵抑制剂(r)-或(s)-4-[(3-氨基-1-吡咯烷基)羰基]-n-(3-异噁唑基甲基)苯磺酰胺，该化合物的结构式为：
该药物还包括药学上可接受的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐、富马酸盐、甲磺酸盐或草酸盐等。
所述的(r)-或(s)-4-[(3-氨基-1-吡咯烷基)羰基]-n-(3-异噁唑基甲基)苯磺酰胺盐酸盐的制备方法，包括如下步骤：
(1)将3-氨甲基异噁唑盐酸盐溶入dmf中，加入三乙胺、4-(氯磺酰基)苯甲酸，搅拌反应。反应结束后，将dmf蒸干，过滤，水洗，烘干，得到黑色固体产品(中间体1)。
(2)将中间体1溶于dmf中，加入(r)-或(s)-3-(boc-氨基)吡咯烷，搅拌反应(tlc监测)。反应达终点后，将dmf蒸干，加入ch2cl2和水，过滤，滤液经萃取出有机层，用水洗、饱和食盐水洗，经无水硫酸钠干燥后用活性炭脱色，过滤除去活性炭，滤液蒸干，得到淡黄色液体(中间体2)。
(3)将中间体2溶入1,4-二氧六环，加入盐酸，升温至回流后保温。反应结束后，蒸干溶剂，用反相柱分离后得到白色固体产品。
工艺流程如下：
制备步骤(1)中，3-氨甲基异噁唑盐酸盐、4-(氯磺酰基)苯甲酸的摩尔比为1：1-3。反应温度10-90℃。
步骤(2)中，中间体1、(r)-或(s)-3-(boc-氨基)吡咯烷的摩尔比为1：1-3。反应温度10-100℃。
步骤(3)中，盐酸浓度2-8m，水解时间1.5-20h。
(r)-或(s)-4-[(3-氨基-1-吡咯烷基)羰基]-n-(3-异噁唑基甲基)苯磺酰胺盐酸盐的结构鉴定如下：
1hnmr(400mhz,d2o)δ8.32(d,j＝9.9hz,1h),7.78(dd,j＝8.1,3.8hz,2h),7.55(d,j＝8.1hz,2h),6.21(t,j＝12.7hz,1h),4.70(s),4.25(s,2h),4.07(s,1h),3.95(m,1h),3.69(m,2h),3.45(m,2h),2.37(m,1h),2.07(ddd,j＝29.9,19.3,11.1hz,1h).13cnmr(125mhz,d2o)δ169.95,160.19,159.66,140.43,139.39,127.74,127.29,104.03,52.17,50.25,49.50,47.14,29.54.ir(kbr)ν(cm-1):2957,1616,1446,1330,1160,1092,844,594.msm/z:351.1[m+h].[α]20＝-9.7°(r),+9.7°(s)(水)。
(r)-或(s)-4-[(3-氨基-1-吡咯烷基)羰基]-n-(3-异噁唑基甲基)苯磺酰胺盐酸盐的质子泵(h+,k+-atp酶)抑制活性以及抗胃溃疡活性，实验如下：
新鲜猪胃用清水清洗内容物，将胃粘膜表面浸入饱和nacl溶液中，刮下胃粘膜悬浮于0.25m蔗糖、20mmtris·hcl(ph7.4)缓冲溶液中，均质后所得匀浆采用密度梯度离心，得到h+,k+-atp酶。在50mmhepes-tris缓冲液(5mmmgcl2，10mmkcl，10μm缬氨霉素，ph6.1)中加入2.5μg/mlh+,k+-atp酶，加入不同浓度的抑制剂(25nm，50nm，100nm，200nm)，混合物37℃培育30min，然后加入2mmatp溶液37℃反应20min。用孔雀石绿溶液中止反应，室温放置15min显色，620nm处测定吸光度值。不添加kcl，按同样方法测定吸光度值。两者之差即为h+,k+-atp酶的活性。由此可计算出抑制剂的抑制率及半数抑制浓度ic50。
取昆明种小鼠，随机分成生理盐水组、瑞伐拉赞组、抑制剂组(剂量3.5mg/kg)，每组10只，雌雄各半。试验组每天灌胃给予相应药物共14天，末次给药后禁食不禁水，1h后，灌胃阿司匹林-乙醇溶液(将阿司匹林200mg/kg用40％的乙醇溶解)，4h后处死小鼠，将小鼠沿胃大弯处剪开，翻转后用清水洗去内容物，于解剖显微镜下观察胃溃疡点，根据病变程度记分。局部充血发红为1分，点状出血或糜烂各为1分，线状糜烂1个为3分，总计后作为溃疡指数。根据溃疡指数对抑制剂的抗溃疡活性进行评价。
(r)-和(s)-4-[(3-氨基-1-吡咯烷基)羰基]-n-(3-异噁唑基甲基)苯磺酰胺盐酸盐抑制h+,k+-atp酶的ic50值分别为7nm(r构型)、29nm(s构型)，阳性对照药瑞伐拉赞ic50值为0.39μm。空白组、模型组、瑞伐拉赞组、(r)-和(s)-抑制剂组的溃疡指数分别为1.20±0.27，10.29±1.11，3.80±0.94，1.35±0.55，1.56±0.98。
结论：(r)-和(s)-4-[(3-氨基-1-吡咯烷基)羰基]-n-(3-异噁唑基甲基)苯磺酰胺是一类新型高效可逆型质子泵抑制剂，其抑制活性远高于市售的可逆型质子泵抑制剂瑞伐拉赞，具有较好的抗胃溃疡活性。采用该工艺可以简便高效地制备此类可逆型质子泵抑制剂的光学异构体，总收率为20％。
附图说明
图1为小鼠胃黏膜组织形态学切片，a：正常组；b：模型组；c：(r)-抑制剂治疗组。
具体实施方案：
实施例1：
将1.6g3-氨甲基异噁唑盐酸盐溶入200mldmf中，加入3g三乙胺、6.6g4-(氯磺酰基)苯甲酸，60℃搅拌反应4h。反应结束后，将dmf蒸干，过滤，水洗，烘干，得到黑色固体产品1.52g(中间体1)，收率45.3％。
将1.52g中间体1溶于200mldmf中，加入2g(r)-或(s)-3-(boc-氨基)吡咯烷，60℃搅拌反应8h。反应达终点后，将dmf蒸干，加入足量ch2cl2和水，过滤，滤液经萃取出有机层，用水洗、饱和食盐水洗，经无水硫酸钠干燥后用活性炭脱色，过滤除去活性炭，滤液蒸干，得到2.3g淡黄色液体(中间体2)，收率95％。
将2.3g中间体2溶入100ml1,4-二氧六环，加入20ml的5m盐酸，升温至回流后保温5h。反应结束后，蒸干溶剂，用反相柱分离后得到0.81g白色固体产品，收率45.5％。
实施例2：
将1.6g3-氨甲基异噁唑盐酸盐溶入200mldmf中，加入2.4g三乙胺、5.28g4-(氯磺酰基)苯甲酸，50℃搅拌反应6h。反应结束后，将dmf蒸干，过滤，水洗，烘干，得到黑色固体产品1.36g(中间体1)，收率40.52％。
将1.36g中间体1溶于200mldmf中，加入1.8g(r)-或(s)-3-(boc-氨基)吡咯烷，50℃搅拌反应10h。反应达终点后，将dmf蒸干，加入足量ch2cl2和水，过滤，滤液经萃取出有机层，用水洗、饱和食盐水洗，经无水硫酸钠干燥后用活性炭脱色，过滤除去活性炭，滤液蒸干，得到2.1g淡黄色液体(中间体2)，收率96.76％。
将2.1g中间体2溶入100ml1,4-二氧六环，加入20ml的8m盐酸，升温至回流后保温4h。反应结束后，蒸干溶剂，用反相柱分离后得到0.9g白色固体产品，收率50.61％。
实施例3：
将1.6g3-氨甲基异噁唑盐酸盐溶入200mldmf中，加入2g三乙胺、2.64g4-(氯磺酰基)苯甲酸，55℃搅拌反应8h。反应结束后，将dmf蒸干，过滤，水洗，烘干，得到黑色固体产品1.5g(中间体1)，收率36.8％。
将1.5g中间体1溶于200mldmf中，加入1.5g(r)-或(s)-3-(boc-氨基)吡咯烷，45℃搅拌反应12h。反应达终点后，将dmf蒸干，加入足量ch2cl2和水，过滤，滤液经萃取出有机层，用水洗、饱和食盐水洗，经无水硫酸钠干燥后用活性炭脱色，过滤除去活性炭，滤液蒸干，得到2.2g淡黄色液体(中间体2)，收率92.3％。
将2.2g中间体2溶入100ml1,4-二氧六环，加入30ml的2m盐酸，升温至回流后保温16h。反应结束后，蒸干溶剂，用反相柱分离后得到0.94g白色固体产品，收率50.5％。
图1为小鼠胃黏膜组织形态学切片(a：正常组；b：模型组；c：(r)-抑制剂治疗组)，模型组小鼠胃组织切片可见大部分区域胃黏膜上皮细胞大量脱落，胃底腺结构紊乱，黏膜层及黏膜下层微血管明显扩张。用(r)-或(s)-4-[(3-氨基-1-吡咯烷基)羰基]-n-(3-异噁唑基甲基)苯磺酰胺盐酸盐治疗后，可见胃组织切片大部分区域结构清晰，无血管扩张和上皮细胞脱落，治疗效果明显。