体外筛选具有改善记忆力的牡蛎活性肽的方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及体外筛选具有改善记忆力的牡蛎活性肽的方法。

背景技术：

随着现代生活节奏的加快以及学习、工作压力的增加，学习记忆及认知功能衰退等亚健康问题日益严重，因此，研究开发具有缓解人体精神压力，改善和提高学习记忆能力的天然活性物质具有重要意义。

乙酰胆碱酯酶(AchE)是生物神经传导中的一种关键性的酶，主要存在于神经肌肉接头与胆碱能神经系统中，其主要生理功能是将胆碱能突触间隙内的神经递质水解为乙酸和胆碱，终止兴奋刺激作用。目前判断活性物质改善记忆力的体外筛选方法是通过测定抑制AchE的活性来评价。传统方法是将AchE酶液、样品、显色剂和底物孵育一定时间，加入SDS终止反应并测定吸光值，计算样品对AchE的抑制率。然而市售的高纯度的AchE价格昂贵，不适用于样品的初期大量筛选。另一种测定方法是使用AchE试剂盒，然而该方法只适用于新鲜的样本组织，对于冷冻干燥的样品具有一定的局限性。

有部分研究集中在AchE的提取和纯化方面，申请号：201210144988X专利名称：一种从蚯蚓血清中纯化乙酰胆碱酯酶的方法，公开了一种AchE的制备方法：将蚯蚓在冰水浴下用磷酸缓冲溶液匀浆，离心得粗酶提取液，加入表面活性剂Triton X-114溶液和柠檬酸缓冲溶液定容到10mL，35℃水浴平衡9min，离心取下层，即为纯化后AchE制品。该方法操作简便，成本低，然而AchE的活性在纯化过程中是否发生变化则未有明确报道，另外，该AchE制品的来源与人体差异较大，也值得进一步研究和应用。

在人体中枢神经系统内，胶质细胞的数量几乎占90％，而星形胶质细胞是胶质细胞中体积最大的一种，现已证实星形胶质细胞在中枢神经系统的发育及病理生理过程中起重要作用，它还具有灭活和供给神经递质，抑制神经元过度兴奋的作用，参与学习和记忆等脑的高级功能活动。因此，综合考虑AchE的贮存条件和来源性，本发明通过培养星形胶质细胞并从该细胞中提取AchE来进行牡蛎活性肽的体外活性筛选。

牡蛎是一种著名的海产贝类，在我国沿海均有生长，牡蛎含有丰富的糖原、蛋白质、氨基酸、微量元素锌及维生素等，除食用外，牡蛎还是一种传统的海洋中药材，有“清热除湿、化痰软坚、止心脾气痛”等功效，其作为治病强身的海洋药物，吸引越来越多研究者的关注。随着现代医学的深入研究，发现牡蛎具有多种生物活性，如抗菌、抗氧化、降血压、抗肿瘤、提高机体免疫力、防衰老、对心血管具有保护作用等活性，但关于其在改善记忆力方面的研究鲜有报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种体外筛选具有改善记忆力的牡蛎活性肽的方法。

本发明实现目的的方案如下：体外筛选具有改善记忆力的牡蛎活性肽的方法，其特征在于，筛选步骤为：

(1)取对数生长期的星形胶质细胞，接种于24孔板，培养24h；

(2)待星形胶质细胞生长至孔板的80-90％后吸走星形胶质细胞原培养液，加入待筛选的牡蛎活性肽作用于星形胶质细胞24h；

(3)24h后再次吸走培养液，向星形胶质细胞中加入磷酸缓冲液，充分研磨星形胶质细胞，离心，取上清液测定AchE活力，根据AchE活力的大小，筛选出对AchE抑制率最高的牡蛎活性肽。

优选的；步骤(1)中所述星形胶质细胞接种密度为1×10⁵～10⁶个/mL，接种量为0.5～1.0mL。

优选的；步骤(2)中所述牡蛎活性肽浓度为10mg/mL，体积为0.5～1.0mL。

优选的；步骤(2)中所述牡蛎活性肽的制备方法为：取新鲜牡蛎，匀浆，按液固比1～3:1的比例加入去离子水，在45℃水浴中搅拌均匀，按照牡蛎与复合蛋白酶的质量比1000:8～16加入复合蛋白酶(1.0×10⁵U/g)，调节pH至7～8，保温3～10min后在45～65℃下酶解3～7h，酶解结束后，取酶解液于95～100℃加热10min钝化灭酶，直至酶解反应结束，离心，取上清液，冷冻干燥即得牡蛎活性肽冻干品。

优选的；步骤(3)中所述的磷酸缓冲液体积为0.5～1.0mL，pH为7.2～7.4，浓度为0.01M。

优选的；步骤(3)中所述的离心条件为：4℃环境下5000～8000r/min离心10～15min。

优选的；步骤(3)中所述上清液体积为0.4～0.5mL。

本发明的有益效果：本发明选用哺乳动物脑内分布最广泛的星形胶质细胞为模型，更直接、更准确的从星形胶质细胞中提取AchE用于牡蛎活性肽的体外活性筛选。此外，首次从基因水平分析牡蛎活性肽改善记忆力的作用机制，为实现海洋贝类高值化利用提供新的思路。

附图说明

图1为小鼠训练第5天，各组之间小鼠的游泳路线差异；

图2为各组间小鼠游泳路程的差异；

图3为各组间小鼠进入暗室潜伏期的差异；

图4为各组之间AchE和ChAT活力的差异；

图5为各组之间BDNF和NCAM含量的差异。

备注：图2-图5中，不同字母代表各组之间存在显著性差异(P<0.05)，差异从小到大依次为a、ab、b、c。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

牡蛎活性肽的制备：

分别取10份新鲜牡蛎各10g，匀浆，按液固比1～3:1的比例加入去离子水，在45℃水浴中搅拌均匀，按照牡蛎与复合蛋白酶的质量比1000:8～16加入复合蛋白酶(1.0×10⁵U/g，索莱宝科技有限公司)，调节pH至7～8，保温5min后在45～65℃下酶解3～7h，酶解结束后，取酶解液于95～100℃加热10min钝化灭酶，直至酶解反应结束，离心，取上清液，冷冻干燥即得10种牡蛎活性肽，将各牡蛎活性肽样品按酶解条件不同分别编号为牡蛎活性肽1-10。各牡蛎活性肽样品具体酶解条件见表1。

表1牡蛎活性肽酶解条件

实施例2

体外筛选具有改善记忆力的牡蛎活性肽：

分别取对数生长期的星形胶质细胞10份(编号为星形胶质细胞1-10)，接种于24孔板，接种密度1×10⁵个/mL，接种量0.5mL，培养24h，待星形胶质细胞生长至孔板的80％后吸走星形胶质细胞原培养液，依次加入实施例1中1-10号牡蛎活性肽(0.5mL，10mg/mL)作用于星形胶质细胞，24h后再次吸走培养液，分别向10份星形胶质细胞中加入0.5ml磷酸缓冲液(0.01M，pH为7.2)，充分研磨星形胶质细胞，4℃环境下5000r/min离心10min，取上清液0.4mL，使用AchE测试盒(南京建成生物工程研究所，货号：A024，检测方法参考说明书)测定其AchE的活力，筛选出对AchE抑制率最高的牡蛎活性肽。星形胶质细胞1-10号中的AchE活力见表2。

表2乙酰胆碱酯酶(AchE)活力

从表2中可知：经牡蛎活性肽10号作用的星形胶质细胞中的AchE活力最低，为0.417U/mL，因此实施例1中的牡蛎活性肽10号的AchE抑制率最高。

实施例3

体外筛选具有改善记忆力的牡蛎活性肽：

分别取对数生长期的星形胶质细胞10份(编号为星形胶质细胞1-10)，接种于24孔板，接种密度1×10⁶个/mL，接种量0.5mL，培养24h，待星形胶质细胞生长至孔板的90％后吸走星形胶质细胞原培养液，依次加入实施例1中1-10号牡蛎活性肽(0.5mL，10mg/mL)作用于星形胶质细胞，24h后再次吸走培养液，分别向10份星形胶质细胞中加入1.0mL磷酸缓冲液(0.01M，pH为7.4)，充分研磨星形胶质细胞，4℃环境下8000r/min离心15min，取上清液0.5mL，使用AchE测试盒(南京建成生物工程研究所，货号：A024，检测方法参考说明书)测定其AchE的活力，筛选出对AchE抑制率最高的牡蛎活性肽。星形胶质细胞1-10号中的AchE活力见表3。

表3乙酰胆碱酯酶(AchE)活力

从表3中可知：经牡蛎活性肽10号作用的星形胶质细胞中的AchE活力最低，为0.423U/mL，因此实施例1中的牡蛎活性肽10的AchE抑制率最高。

实施例4牡蛎活性肽对小鼠Morris水迷宫行为学实验的影响

本实施例中使用的牡蛎活性肽为实施例1中的牡蛎活性肽10号样品。

4.1、实验目的：明确牡蛎活性肽对小鼠Morris水迷宫行为学实验的影响。

4.2、实验材料：

4.2.1动物：昆明种小鼠(SPF级)，雄性，体重18-22g，实验动物使用许可证：SYXK(陕)2016-007，饲养温度：20-26℃，饲养湿度：40％-60％。

4.2.2仪器：Morris水迷宫圆形水池。

4.3、实验方法：

将60只小鼠随机分成5组，分别为空白组：灌胃给予蒸馏水；阳性对照组：灌胃石杉碱甲0.05mg/kg/d；牡蛎活性肽低剂量组：灌胃牡蛎活性肽150mg/kg/d；牡蛎活性肽中剂量组：灌胃牡蛎活性肽500mg/kg/d；牡蛎活性肽高剂量组：灌胃牡蛎活性肽1500mg/kg。每天灌胃一次，连续给予受试物30天后，实验前一天，小鼠自由游泳2min以熟悉环境，期间引导小鼠站上平台10s。次日开始训练，训练期间继续给样。

4.3.1定位航行试验：用于测量实验动物对水迷宫学习和记忆获得的能力。训练天数依据动物的学习能力确定，每完成4个象限的训练当做1个循环，动物每次从1个象限的入水点入水，将动物面向池壁放入水中，仪器自动记录动物寻找并爬上平台的路线图、动物从入水到找到水下隐蔽平台并站立其上所需时间(逃避潜伏期)及游泳总路程。如果动物在90s内未找到平台，则需将其引至平台，这时潜伏期以90s计，让动物在平台停留10s后，再放回笼中。如此重复完成4个象限的试验，象限选择和各实验组动物训练顺序应随机确定或交叉进行。直至80-90％以上的动物在规定时间内找到平台或至少完成3个循环的试验，可终止试验，连续训练5天。

4.4、实验结果：

如图1和图2所示，与空白组小鼠模型相比，阳性对照组和牡蛎活性肽高、中、低剂量组的游泳路程明显减少，差异有显著性，可判定为该项指标阳性。

实施例5牡蛎活性肽对小鼠避暗行为学实验的影响

本实施例中使用的牡蛎活性肽为实施例1中的牡蛎活性肽10号样品。

5.1、实验目的：明确牡蛎活性肽对小鼠避暗行为学实验的影响。

5.2、实验材料：

5.2.1动物：昆明种小鼠(SPF级)，雄性，体重18-22g，实验动物使用许可证：SYXK(陕)2016-007，饲养温度：20-26℃，饲养湿度：40％-60％。

5.2.2仪器：小鼠避暗仪。

5.3、实验方法：

将60只小鼠随机分成5组，分别为空白组：灌胃给予蒸馏水；阳性对照组：灌胃石杉碱甲0.05mg/kg/d；牡蛎活性肽低剂量组：灌胃牡蛎活性肽150mg/kg/d；牡蛎活性肽中剂量组：灌胃牡蛎活性肽500mg/kg/d；牡蛎活性肽高剂量组：灌胃牡蛎活性肽1500mg/kg。每天灌胃一次，连续给予受试物45天，末次给样后1h开始训练。实验时将小鼠面部背向洞口放入明室，同时启动计时器。动物穿过洞口进入暗室受到电击，计时器自动停止，取出小鼠，记录每只小鼠从放入明室至进入暗室遭电击所需的时间，此即潜伏期，训练5min，并记录5min内电击次数。24h或48h后重作测验，记录每只动物进入暗室的潜伏期和5min内的电击次数，并计算5min内进入暗室(错误反应)的动物百分率。以上实验步骤为记忆获得过程。停止训练5天后可以在不同的时间进行一次或多次记忆消退实验(即记忆再现过程)。

5.4、实验结果：

如图3所示，牡蛎活性肽剂量组的小鼠进入暗室的潜伏期明显长于对照组，差异有显著性，可判定为该项指标阳性。

实施例6牡蛎活性肽对小鼠体内相关生理生化指标的影响

本实施例中使用的牡蛎活性肽为实施例1中的牡蛎活性肽10号样品。

6.1、实验目的：明确牡蛎活性肽对小鼠体内相关生理生化指标的影响。

6.2、实验材料：AchE试剂盒，胆碱乙酰转移酶(ChAT试剂盒)，脑源性神经因子(BDNF)抗体，神经细胞粘附因子(NCAM)抗体。

6.3、实验方法：

将50只小鼠随机分成5组，分别为空白对照组：灌胃给予蒸馏水；阳性对照组：灌胃石杉碱甲0.05mg/kg/d；牡蛎活性肽低剂量组：灌胃牡蛎活性肽150mg/kg/d；牡蛎活性肽中剂量组：灌胃牡蛎活性肽500mg/kg/d；牡蛎活性肽高剂量组：灌胃牡蛎活性肽1500mg/kg。每天灌胃一次，连续给予受试物30天后，断头处死，取脑组织，冰冷的生理盐水洗去血液，滤纸拭干，按重量体积比例1:9加入冰生理盐水，冰水浴匀浆，3000rpm离心10min，取上清液。ELISA法定量检测BDNF、NCAM含量，AchE试剂盒测定AchE的活性，ChAT试剂盒测定ChAT的活性。

6.4、实验结果：

如图4和图5所示，与对照组相比，牡蛎活性肽各剂量组均能降低AchE的活性，且牡蛎活性肽高剂量组能够降低ChAT的活性，提高BDNF和NCAM的含量。说明牡蛎活性肽能够改善小鼠脑组织中与记忆能力相关的指标，提高小鼠的记忆能力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。