辣木叶黄酮提取物的降糖、胰岛保护活性试验方法及其用途与流程

本发明涉及生物医药技术领域，尤其是辣木叶黄酮提取物的降糖、胰岛保护活性试验方法及其用途。

背景技术：

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。目前尚无根治糖尿病的方法，但通过多种治疗手段可以控制好糖尿病。天然植物降血糖的研究已经越来越热门，研究显示辣木叶粉也具有降血糖的作用。辣木(morigaoleifera)属辣木科、辣木属，起源于印度北部的亚喜马拉雅山地带。印度和非洲国家常用于治疗糖尿病、高血压、心血管病、肥胖症等疾病。近年来，辣木在我国广东、云南、海南和四川等都有引种栽培。2012年辣木叶被批准为新资源食品，各种辣木产品开发火热，广泛应用于食品、保健品、水质净化、化妆品等领域。

陈瑞娇等用AB-8大孔树脂纯化过的辣木叶黄酮(TFM)用于糖尿病模型小鼠，进行降糖活性观察，最终发现，TFM有显著的降糖活性，还能增加血清SOD含量，降低MDA含量，且对非糖尿病小鼠的血糖无影响。还有研究表明，在使用辣木叶提取物3h内能有效降低血糖水平，并且随着剂量的增加功效也提高，但其有效性要低于标准的降血糖药。辣木适应性广、耐粗放栽培，辣木叶营养价值丰富、保健功能多样，在我国开展辣木种植及辣木叶产品的市场和商业前景广阔。现对辣木叶资源的开发尚，处于起步阶段，但已通过大量的检测和实验证明辣木叶是一种安全健康的绿色食品，且2012年辣木已被中国卫生部批准为中国新资源食品。辣木叶被报道的成分以黄酮类化合物为主，是目前辣木叶开发中研究最多的化合物，其主要活性表现为抗氧化、降血糖、保护肝脏等。如今全球糖尿病患者数量猛增的形势下，对该病的天然防治药物需求大大增加，而辣木叶黄酮正因其具有降血糖效果的同时，营养成分丰富、副作用小、改善糖尿病并发症等优势，且辣木叶黄酮原料具备采集方便、资源丰富，提取工艺简单等特点，使辣木叶黄酮具有了成为防治糖尿病药物的潜力，这可能是辣木叶的进一步发展方向。但目前还没有辣木叶黄酮提取物的降糖、胰岛保护活性试验具体指数及辣木叶黄酮提取物相关应用的报道，判断出辣木叶黄酮提取物的降糖、胰岛保护活性指数。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种辣木叶黄酮提取物的降糖、胰岛保护活性试验方法及其用途，能够判断辣木叶黄酮提取物的降糖、胰岛保护活性。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：辣木叶黄酮提取物的降糖、胰岛保护活性试验方法，它包含以下步骤：

S1、黄酮提取物的制备：称取辣木叶黄酮粉末80-100mg，定容至1mL，混匀，经0.22um滤器滤过，分装成5个等量样品，待用；

S2、葡萄糖摄取试验：将试验用HepG2细胞溶液用0.25％胰蛋白酶液消化后，接种于培养板中，然后一起置于CO₂培养箱中培养，其中，HepG2细胞溶液的细胞浓度为0.8-1.5×10⁵个/mL，待细胞贴壁后，弃去原培养液，用葡萄糖试剂盒测定各孔培养液中初始葡萄糖的浓度，计为G₁，换无血清培养液，饥饿10-12h，加入DMEM高糖培养液160-200μL，再分别加入20-50μL样品，孵育24-28h后用葡萄糖试剂盒测定各孔培养液中葡萄糖的浓度，计为G₂，采用以下公式计算葡萄糖的消耗量G_C，其中，n为培养板中试验的孔数，根据葡萄糖摄取活性系数K，判断样品葡萄糖摄取活性，G₀为同体积的异槲皮苷试验样品进行葡萄糖摄取试验得到的葡萄糖消耗量，异槲皮苷试验样品中异槲皮苷的含量为0.0156mg/mL，葡萄糖摄取活性系数K大于等于1，则标记该样品的葡萄糖摄取活性为优，葡萄糖摄取活性系数K小于1，则标记该样品的葡萄糖摄取活性为良，葡萄糖摄取活性系数K小于0.5，则标记该样品的葡萄糖摄取活性为不佳；

S3、糖脂代谢活性试验：取用人工诱导2型糖尿病大鼠模型样品组和对照组各10只，其中，人工诱导2型糖尿病大鼠模型的标准为空腹血糖大于7.8mmol/L或餐后2h血糖大于11.1mmol/L，样品组和对照组按样品组的剂量给予等量的生理盐水，于确定大鼠成模当天统一开始灌胃给药，连续灌胃21天，每天8：00AM-9:00AM定时空腹给药一次，灌胃后再给予等量的饲料与饮水，21天后取分别取各组大鼠的血糖变化率，大鼠血脂指标含量，大鼠血清SOD与MDA含量的测定以及胰岛素指数的计算；

血糖变化率，大鼠血脂指标含量，大鼠血清SOD与MDA含量的测定以及胰岛素指数的计算需要经过大鼠的血样采集，具体操作为大鼠最后一天灌胃后，禁食不禁水过夜。以乙醚麻醉动物，眼静脉丛采血，于37℃放置1h后，4℃冰箱过夜，以3000r/min离心10min，收集血清，-20℃保存备用。采血完毕后处死大鼠，取肝脏、胰脏于波恩氏液中固定，做组织切片备用。取肝脏于pH7.0的4℃PBS，流式细胞术检测细胞凋亡与周期备用。取肝脏、胰脏于RNA保护剂，-80℃保存，做荧光定量PCR备用。取肝脏、胰脏于戊二醛中，4℃保存，超微病理学观察备用。

按照试剂盒说明书的要求，对大鼠血清中的葡萄糖(Glu)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)、胰岛素(INS)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)进行测定。

根据测得的大鼠空腹血糖值与空腹胰岛素值，计算以下几个胰岛相关指数。

HOMA-IR＝FPG×FINS/22.5

HOMA-IS＝1/(FPG×FINS)

IAI＝Ln[1/(FPG×FINS)]

HOMA-β(％)＝20×FINS/(FPG-3.5)

FPG：空腹血糖值，mmol/L；FINS：空腹胰岛素水平，mIU/L。

HOMA(Homeostasis model assessment)，又称HOMA稳态模型，目前已成为广泛应用于临床的评价糖尿病人胰岛素敏感性，胰岛素抵抗水平与胰岛β细胞功能的常用指标。HOMA-IR(Homeostasis Model of Insulin Resistance)是用于评价个体的胰岛素抵抗水平的指标，正常个体的HOMA-IR指数为1，随着胰岛素抵抗水平升高的升高，HOMA-IR指数将高于1。HOMA-IS是用于评价个体的胰岛素敏感性的指标，HOMA-IS(Homeostasis Model of Insulin Secretion)指数随着胰岛素敏感性水平的升高而升高。该指数取自然对数后，可得到临床上评价胰岛素敏感性水平的另一指标胰岛素作用指数IAI(Insulin Affect Index)。HOMA-β是用于评价个体的胰岛β细胞功能的指标。正常个体的HOMA-β指数为100％。糖尿病人群中，HOMA-β(Homeostasis Model ofβ-cell Function)指数会因疾病进程不同而偏离正常值，胰岛β细胞功能降低则其数值降低，功能增强则其数值升高。赵文杰以桑白皮为研究对象，围绕胰岛素抵抗，采用立体细胞模型和整体动物模型，探讨桑白皮降低血糖的作用及其机理。

本发明的胰岛素指数表明，辣木叶黄酮灌胃21天后，与对照组相比均可降低HOMA-IR，提高HOMA-IS，降低IAI，提高HOMA-β，说明辣木叶黄酮的服用，可降低大鼠胰岛素抵抗水平，增强机体对胰岛素敏感性，提高胰岛素作用，增强胰岛β细胞功能的作用，辣木叶黄酮口服30mg/k。

其中，人工诱导2型糖尿病大鼠模型的饲料按照文献《2型糖尿病大鼠模型的建立及其在辅助降血糖功能评价中的应用》所记载的方法，选择最佳配方制备高脂高糖饲料，即基础饲料+10％猪油+20％蔗糖。将基础饲料、蔗糖粉碎，猪油微热融化后混匀，加水至合适的湿度，再制粒为直径约1.5cm、长5-8cm的圆柱形颗粒。制粒完成后，置于40℃恒温鼓风干燥箱中至干。制备好的高脂高糖饲料密封贮藏于避光、干燥处。每次制备量不超过大鼠饲喂一周量，防止饲料变质，一天未吃完的饲料经烘干后再饲喂。实验大鼠饲喂于550×400×200mm的笼中，光照周期12h：12h，饲喂间内通风，保持温度恒定约25℃。定期更换垫料，每次更换时消毒液消毒鼠笼，保证大鼠笼卫生。给予充足饮水与高脂高糖饲料饲喂30天。第31天，禁食不禁水24h。第32天以5‰STZ溶液(4℃预冷的0.1mM、pH4.5柠檬酸盐缓冲液新鲜配制，避光溶解)，按40mg/kg体重剂量一次性腹腔注射大鼠，全部大鼠在30min内全部注射完毕。此后给予饮水与饲料饲喂，每天定时投食，9：00与17:00，一天2次，根据大鼠尿量更换垫料，保持垫料干燥。

S4、胰岛保护活性试验：将糖脂代谢活性试验中样品组和对照组的大鼠胰脏用波恩氏液固定，经过脱水、透明、浸蜡后，用石蜡包埋，切片，厚度为4.5-5.5μm，30-45℃烘箱加热固定，对胰腺切片进行HE染色和醛复红染色，脱水，透明，封片，于显微镜下观察，并拍照记录，根据HE染色的胰腺切片中胰岛细胞的数量A₂与对照组中胰岛细胞数量A₁，计算胰岛细胞数量变化率M，其中A₂、A₁分别为样品组合对照组中HE染色的切片下的10只大鼠胰脏细胞数量的平均值，根据醛复红染色胰岛β细胞所代表的红色区域面积计算胰岛β细胞增长率N，其中，B₂、B₁分别为样品组合对照组中醛复红染色的切片下10只大鼠胰岛β细胞数量所代表的红色区域面积的平均值。

苏木精-伊红(Hematoxylin-EosinStaining，HE)染色法，是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着色紫蓝色，细胞质和细胞外基质的成分着红色，但是胰岛与胰腺细胞区别不明显，且胰岛的几种细胞难以区分。胰岛的β细胞是嗜碱细胞，醛复红对特殊的蛋白质及含硫酸根的粘多糖具有很强的亲和力，和弹性纤维结合很紧，另外对嗜碱细胞，能很好着色。利用醛复红染色对胰腺进行染色，使胰岛α、β细胞清晰可见，常用于观察胰岛细胞。

胰岛组织HE染色时，发现血糖较高组的胰岛发生病变较严重，尤其是胰岛中间部位，细胞数量减少，通过醛复红染色发现，减少的细胞大部分为胰岛β细胞，说明了大鼠出现高血糖可能是因为β细胞发生了凋亡，使胰岛素分泌减少，而异槲皮苷的服用产生了与磷酸西格列汀相似的作用，减少了β细胞凋亡的发生，从而保护胰岛β细胞，使糖尿病大鼠胰岛素分泌量增加，从而出现了血糖下降的现象。

目前国内外对辣木叶提取物的研究，证明了辣木叶黄酮类化合物有降低糖耐量、降血糖、降血脂等作用。已报道的辣木叶黄酮乙醇回流提取法，耗时长，效率较低，且仅采用正交法优化提取工艺。微波萃取用于黄酮类化合物提取，提取效率高、节省时间、节约溶剂、保护环境、节约成本。响应面法与正交法相比，能研究几种因素的交互作用，越来越广泛地运用在解决多变量问题。

所述的辣木叶黄酮粉末由以下方法制得：取辣木叶粉以50-60％v/v乙醇为溶剂，料液比为1:50-60g/ml，进行微波萃取，收集提取液，其中，微波功率为300-400W，提取时间为6-10min，然后提取液滤过，旋转蒸发仪减压浓缩，回收乙醇至干，无水乙醇复溶后静置12小时滤过，除去水溶性杂质，滤液再经旋转蒸发仪减压浓缩，除去乙醇，以蒸馏水稀释，高浓度黄酮溶液分装为2mL/管于15mL螺口带盖离心管，置于真空超低温冷冻干燥仪48h，黄酮完全冻干为粉末，取出后，密封，避光，-80℃保存。

以下是采用微波萃取法单因素实验，主要考虑乙醇浓度的影响、提取时间的影响、微波功率的影响、液料比的影响。

称取5份辣木叶粉，每份1g，于微波萃取仪中提取。分别加入50％、60％、70％、80％、90％乙醇，微波功率200w，提取时间6min，液料比50:1，结果见图1。由图1，乙醇体积分数在60％时，黄酮得率最大，高于60％后，得率持续下降。因此，作为优选的，选择乙醇体积分数为60％。

称取5份辣木叶粉，每份1g，加入60％乙醇，微波功率200w，液料比50:1，分别按提取时间6min、8min、10min、12min、14min于微波萃取仪中提取。结果见图2。由图2可见，随时间延长，总黄酮得率升高，当提取时间为8min时，达到最高，因此，作为优选的，选择提取时间为8min。

称取5份辣木叶粉，每份1g，加入60％乙醇，液料比50:1，微波功率分别为100w、200w、300w、400w、500w，提取8min。结果见图3。由图3可见，随着提取功率增加，总黄酮得率增加，功率达到400w时最高，高于400w时则下降。因此，作为优选的，选择提取功率为400w。

称取5份辣木叶粉，每份1g，分别按照30:1、40:1、50:1、60:1、70:1加入60％乙醇，微波功率400w，提取8min，于微波萃取仪中提取。结果见图4。由图4可见，随着液料比增大，黄酮得率也随之增加，当液料比为60:1时，总黄酮得率最高，大于60:1则出现下降。因此，选择液料比为60:1。

所述的葡萄糖摄取试验步骤中培养板的孔数为96孔。

所述的试验用HepG2细胞溶液是由以下方法制得：将HepG2细胞接种于细胞培养瓶中，加入1640培养液，置于37℃、饱和湿度的5％CO2培养箱中培养，每隔2d更换1次培养液，3d后传代，传代数1:4，取对数生长期的细胞进行试验。

根据通过葡萄糖摄取试验计算出葡萄糖摄取活性系数K，通过糖脂代谢活性试验测定出大鼠的血糖变化率，大鼠血脂指标含量，大鼠血清SOD与MDA含量的测定以及胰岛素指数，以及通过胰岛保护活性试验计算胰岛细胞数量变化率M及胰岛β细胞增长率N，综合判断出辣木叶黄酮提取物的降糖、胰岛保护活性指数，给辣木叶的利用与开发提供了一个定量的标准，其中，对于葡萄糖摄取活性系数K大于1、血糖变化率大于50％、大鼠血脂指标含量不超标、大鼠血清SOD增长率为10-20％，MDA减少率在7％以上、，HOMA-IR指数在1以上，计算胰岛细胞数量变化率M在6以上，胰岛β细胞增长率N在5以上的辣木叶黄酮提取物用于降低血糖、修复胰腺β细胞分泌胰岛素功能的药物及医药产品。

于小蓉等在HPLC测定新疆药桑叶中绿原酸、芦丁、异槲皮苷和槲皮素的研究中，各种成分出峰顺序为绿原酸、芦丁、异槲皮苷、槲皮素。郭炬亮等在HPLC测定糙枝金丝桃中绿原酸、芦丁、金丝桃苷、槲皮素和山奈酚的研究中，各种成分出峰顺序为绿原酸、芦丁、异槲皮苷、槲皮素。而本发明中辣木叶黄酮样品中异槲皮苷与槲皮素含量最高，分别为41.42％和21.97％，说明辣木叶黄酮中以异槲皮苷与槲皮素两种成分为主。这两种成分均属于黄酮醇类化合物，该类化合物是黄酮类化合物一重要分支，是许多中草药的有效成分之一，具有防治心血管疾病、清除自由基、抗癌、抗菌、抗炎等多种药理作用，成为化学合成研究的热点。上一章得到乙酸乙酯部位黄酮含量为71.80％，异槲皮苷占该部位的41.42％，即占黄酮成分的57.69％，由此推断，异槲皮苷为辣木叶黄酮的主要成分。

申请人多次的实验结果表明，辣木叶黄酮浓度为异槲皮苷浓度10倍时，对葡萄糖的消耗高于异槲皮苷，但差异不显著。这可能是因为辣木叶中不仅含有异槲皮苷，还含有槲皮素、绿原酸和山奈酚，这几种成分均具有抗氧化、抗炎的作用，可促进细胞的生长，提高葡萄糖消耗量，这些成分的协同作用，提高了辣木叶黄酮对葡萄糖的消耗。辣木叶黄酮具有体内降血糖活性，体外也表现出较高的葡萄糖消耗活性，其含量最高的成分异槲皮苷在体外也表现有降血糖活性，同时最近也有研究表明，异槲皮苷具有调节血糖及血脂改善胰岛细胞功能的作用。从而推断，异槲皮苷可能是辣木叶黄酮降血糖活性的主要成分。

本发明的有益效果是：通过葡萄糖摄取试验计算出葡萄糖摄取活性系数K，通过糖脂代谢活性试验测定出大鼠的血糖变化率，大鼠血脂指标含量，大鼠血清SOD与MDA含量的测定以及胰岛素指数，以及通过胰岛保护活性试验计算胰岛细胞数量变化率M及胰岛β细胞增长率N，综合判断出辣木叶黄酮提取物的降糖、胰岛保护活性指数，给辣木叶的利用与开发提供了一个定量的标准。

附图说明

图1为本发明乙醇浓度对黄酮得率的影响曲线图；

图2为本发明提取时间对黄酮得率的的影响曲线图；

图3为本发明微波功率对黄酮得率的的影响曲线图；

图4为本发明液料比对黄酮得率的的影响曲线图；

图5为本发明对照组HE染色的切片的显微放大图；

图6为本发明样品组HE染色的切片的显微放大图；

图7为本发明对照组醛复红染色的切片的显微放大图；

图8为本发明样品组醛复红染色的切片的显微放大图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。

实施例1

辣木叶黄酮提取物的降糖、胰岛保护活性试验方法，它包含以下步骤：

S1、黄酮提取物的制备：称取辣木叶黄酮粉末100mg，定容至1mL，混匀，经0.22um滤器滤过，分装成5个等量样品，待用；

S2、葡萄糖摄取试验：将试验用HepG2细胞溶液用0.25％胰蛋白酶液消化后，接种于培养板中，然后一起置于CO₂培养箱中培养，其中，HepG2细胞溶液的细胞浓度为1.0×10⁵个/mL，待细胞贴壁后，弃去原培养液，用葡萄糖试剂盒测定各孔培养液中初始葡萄糖的浓度，计为G₁，换无血清培养液，饥饿10h，加入DMEM高糖培养液180μL，再分别加入30μL样品，孵育24h后用葡萄糖试剂盒测定各孔培养液中葡萄糖的浓度，计为G₂，采用以下公式计算葡萄糖的消耗量G_C，其中，n为培养板中试验的孔数，根据葡萄糖摄取活性系数K，判断样品葡萄糖摄取活性，K＝1.2，G₀为同体积的异槲皮苷试验样品进行葡萄糖摄取试验得到的葡萄糖消耗量，异槲皮苷试验样品中异槲皮苷的含量为0.0156mg/mL；

S3、糖脂代谢活性试验：取用人工诱导2型糖尿病大鼠模型样品组和对照组各10只，其中，人工诱导2型糖尿病大鼠模型的标准为空腹血糖大于7.8mmol/L，样品组和对照组按样品组的剂量给予等量的生理盐水，于确定大鼠成模当天统一开始灌胃给药，连续灌胃21天，每天8：00AM-9:00AM定时空腹给药一次，灌胃后再给予等量的饲料与饮水，21天后取分别取各组大鼠的血糖变化率，大鼠血脂指标含量，大鼠血清SOD与MDA含量的测定以及胰岛素指数的计算，其中，对照组血糖从16.27增长到19.04，样品组从16.34下降到10.12，血糖变化率为55％、大鼠血脂指标含量不超标，具体为LDL-C2.36mmol/L，HDL-C0.34mmol/L，T-CHO2.11mmol/L，TG1.21mmol/L，大鼠血清SOD含量在对照组中为160.92U/mL，在样品组中为185.81U/mL，SOD变化率为15％，大鼠血清MDA含量在对照组中为30.68U/mL，在样品组中为28.45U/mL，MDA变化率为7.8％，HOMA-IR指数为1.2；

S4、胰岛保护活性试验：将糖脂代谢活性试验中样品组和对照组的大鼠胰脏用波恩氏液固定，经过脱水、透明、浸蜡后，用石蜡包埋，切片，厚度为4.5-5.5μm，30-45℃烘箱加热固定，对胰腺切片进行HE染色和醛复红染色，脱水，透明，封片，于显微镜下观察，并拍照记录，根据HE染色的胰腺切片中胰岛细胞的数量A₂与对照组中胰岛细胞数量A₁，计算胰岛细胞数量变化率M，如图5、图6所示，其中A₂、A₁分别为样品组合对照组中HE染色的切片下的10只大鼠胰脏细胞数量的平均值，A₁中有完整鼠胰脏细胞数量为接近2个，A₂中有完整鼠胰脏细胞数量为接近15-20个左右，胰岛细胞数量变化率M为6；

根据醛复红染色胰岛β细胞所代表的红色区域面积计算胰岛β细胞增长率N，其中，B₂、B₁分别为样品组合对照组中醛复红染色的切片下10只大鼠胰岛β细胞数量所代表的红色区域面积的平均值，B₂中红色区域面积(深色区域)为B₁中红色区域面积的6-7倍，胰岛细胞数量变化率N为5；。

所述的辣木叶黄酮粉末由以下方法制得：取辣木叶粉以60％v/v乙醇为溶剂，料液比为1:60g/ml，进行微波萃取，收集提取液，其中，微波功率为400W，提取时间为8min，然后提取液滤过，旋转蒸发仪减压浓缩，回收乙醇至干，无水乙醇复溶后静置12小时滤过，除去水溶性杂质，滤液再经旋转蒸发仪减压浓缩，除去乙醇，以蒸馏水稀释，高浓度黄酮溶液分装为2mL/管于15mL螺口带盖离心管，置于真空超低温冷冻干燥仪48h，黄酮完全冻干为粉末，取出后，密封，避光，-80℃保存。

所述的葡萄糖摄取试验步骤中培养板的孔数为96孔。

所述的试验用HepG2细胞溶液是由以下方法制得：将HepG2细胞接种于细胞培养瓶中，加入1640培养液，置于37℃、饱和湿度的5％CO2培养箱中培养，每隔2d更换1次培养液，3d后传代，传代数1:4，取对数生长期的细胞进行试验。

所述的辣木叶黄酮提取物用于降低血糖、修复胰腺β细胞分泌胰岛素功能的药物及医药产品。

实施例2

辣木叶黄酮提取物的降糖、胰岛保护活性试验方法，它包含以下步骤：

S1、黄酮提取物的制备：称取辣木叶黄酮粉末80mg，定容至1mL，混匀，经0.22um滤器滤过，分装成5个等量样品，待用；

S2、葡萄糖摄取试验：将试验用HepG2细胞溶液用0.25％胰蛋白酶液消化后，接种于培养板中，然后一起置于CO₂培养箱中培养，其中，HepG2细胞溶液的细胞浓度为0.8×10⁵个/mL，待细胞贴壁后，弃去原培养液，用葡萄糖试剂盒测定各孔培养液中初始葡萄糖的浓度，计为G₁，换无血清培养液，饥饿12h，加入DMEM高糖培养液160μL，再分别加入20μL样品，孵育28h后用葡萄糖试剂盒测定各孔培养液中葡萄糖的浓度，计为G₂，采用以下公式计算葡萄糖的消耗量G_C，其中，n为培养板中试验的孔数，根据葡萄糖摄取活性系数K，判断样品葡萄糖摄取活性，K＝1.05，G₀为同体积的异槲皮苷试验样品进行葡萄糖摄取试验得到的葡萄糖消耗量，异槲皮苷试验样品中异槲皮苷的含量为0.0156mg/mL；

S3、糖脂代谢活性试验：取用人工诱导2型糖尿病大鼠模型样品组和对照组各10只，其中，人工诱导2型糖尿病大鼠模型的标准为空腹血糖大于7.8mmol/L，样品组和对照组按样品组的剂量给予等量的生理盐水，于确定大鼠成模当天统一开始灌胃给药，连续灌胃21天，每天8:00AM-9:00AM定时空腹给药一次，灌胃后再给予等量的饲料与饮水，21天后取分别取各组大鼠的血糖变化率，大鼠血脂指标含量，大鼠血清SOD与MDA含量的测定以及胰岛素指数的计算，其中，血糖变化率为52％、大鼠血脂指标含量不超标，大鼠血清SOD变化率为13％，大鼠血清MDA变化率为8％，HOMA-IR指数为1.1；

S4、胰岛保护活性试验：将糖脂代谢活性试验中样品组和对照组的大鼠胰脏用波恩氏液固定，经过脱水、透明、浸蜡后，用石蜡包埋，切片，厚度为5μm，30-45℃烘箱加热固定，对胰腺切片进行HE染色和醛复红染色，脱水，透明，封片，于显微镜下观察，并拍照记录，根据HE染色的胰腺切片中胰岛细胞的数量A₂与对照组中胰岛细胞数量A₁，计算胰岛细胞数量变化率M，如图5、图6所示，其中A₂、A₁分别为样品组合对照组中HE染色的切片下的10只大鼠胰脏细胞数量的平均值，胰岛细胞数量变化率M为7；

根据醛复红染色胰岛β细胞所代表的红色区域面积计算胰岛β细胞增长率N，其中，B₂、B₁分别为样品组合对照组中醛复红染色的切片下10只大鼠胰岛β细胞数量所代表的红色区域面积的平均值，胰岛细胞数量变化率N为6；。

所述的辣木叶黄酮粉末由以下方法制得：取辣木叶粉以60％v/v乙醇为溶剂，料液比为1:55g/ml，进行微波萃取，收集提取液，其中，微波功率为400W，提取时间为8min，然后提取液滤过，旋转蒸发仪减压浓缩，回收乙醇至干，无水乙醇复溶后静置12小时滤过，除去水溶性杂质，滤液再经旋转蒸发仪减压浓缩，除去乙醇，以蒸馏水稀释，高浓度黄酮溶液分装为2mL/管于15mL螺口带盖离心管，置于真空超低温冷冻干燥仪48h，黄酮完全冻干为粉末，取出后，密封，避光，-80℃保存。

所述的试验用HepG2细胞溶液是由以下方法制得：将HepG2细胞接种于细胞培养瓶中，加入1640培养液，置于37℃、饱和湿度的5％CO2培养箱中培养，每隔2d更换1次培养液，3d后传代，传代数1:4，取对数生长期的细胞进行试验。

所述的辣木叶黄酮提取物用于降低血糖、修复胰腺β细胞分泌胰岛素功能的药物及医药产品。

实施例3

辣木叶黄酮提取物的降糖、胰岛保护活性试验方法，它包含以下步骤：

S1、黄酮提取物的制备：称取辣木叶黄酮粉末90mg，定容至1mL，混匀，经0.22um滤器滤过，分装成5个等量样品，待用；

S2、葡萄糖摄取试验：将试验用HepG2细胞溶液用0.25％胰蛋白酶液消化后，接种于培养板中，然后一起置于CO₂培养箱中培养，其中，HepG2细胞溶液的细胞浓度为1.5×10⁵个/mL，待细胞贴壁后，弃去原培养液，用葡萄糖试剂盒测定各孔培养液中初始葡萄糖的浓度，计为G₁，换无血清培养液，饥饿12h，加入DMEM高糖培养液200μL，再分别加入50μL样品，孵育26h后用葡萄糖试剂盒测定各孔培养液中葡萄糖的浓度，计为G₂，采用以下公式计算葡萄糖的消耗量G_C，其中，n为培养板中试验的孔数，根据葡萄糖摄取活性系数K，判断样品葡萄糖摄取活性，K＝1.3，G₀为同体积的异槲皮苷试验样品进行葡萄糖摄取试验得到的葡萄糖消耗量，异槲皮苷试验样品中异槲皮苷的含量为0.0156mg/mL；

S3、糖脂代谢活性试验：取用人工诱导2型糖尿病大鼠模型样品组和对照组各10只，其中，人工诱导2型糖尿病大鼠模型的标准为空腹血糖大于7.8mmol/L，样品组和对照组按样品组的剂量给予等量的生理盐水，于确定大鼠成模当天统一开始灌胃给药，连续灌胃21天，每天8：00AM-9:00AM定时空腹给药一次，灌胃后再给予等量的饲料与饮水，21天后取分别取各组大鼠的血糖变化率，大鼠血脂指标含量，大鼠血清SOD与MDA含量的测定以及胰岛素指数的计算，其中，血糖变化率为62％、大鼠血脂指标含量不超标，大鼠血清SOD变化率为17％，大鼠血清MDA变化率为9％，HOMA-IR指数为1.3；

S4、胰岛保护活性试验：将糖脂代谢活性试验中样品组和对照组的大鼠胰脏用波恩氏液固定，经过脱水、透明、浸蜡后，用石蜡包埋，切片，厚度为5μm，30-45℃烘箱加热固定，对胰腺切片进行HE染色和醛复红染色，脱水，透明，封片，于显微镜下观察，并拍照记录，根据HE染色的胰腺切片中胰岛细胞的数量A₂与对照组中胰岛细胞数量A₁，计算胰岛细胞数量变化率M，如图5、图6所示，其中A₂、A₁分别为样品组合对照组中HE染色的切片下的10只大鼠胰脏细胞数量的平均值，胰岛细胞数量变化率M为8；

根据醛复红染色胰岛β细胞所代表的红色区域面积计算胰岛β细胞增长率N，其中，B₂、B₁分别为样品组合对照组中醛复红染色的切片下10只大鼠胰岛β细胞数量所代表的红色区域面积的平均值，胰岛细胞数量变化率N为6.5；。

所述的辣木叶黄酮粉末由以下方法制得：取辣木叶粉以60％v/v乙醇为溶剂，料液比为1:60g/ml，进行微波萃取，收集提取液，其中，微波功率为300W，提取时间为8min，然后提取液滤过，旋转蒸发仪减压浓缩，回收乙醇至干，无水乙醇复溶后静置12小时滤过，除去水溶性杂质，滤液再经旋转蒸发仪减压浓缩，除去乙醇，以蒸馏水稀释，高浓度黄酮溶液分装为2mL/管于15mL螺口带盖离心管，置于真空超低温冷冻干燥仪48h，黄酮完全冻干为粉末，取出后，密封，避光，-80℃保存。

所述的试验用HepG2细胞溶液是由以下方法制得：将HepG2细胞接种于细胞培养瓶中，加入1640培养液，置于37℃、饱和湿度的5％CO2培养箱中培养，每隔2d更换1次培养液，3d后传代，传代数1:4，取对数生长期的细胞进行试验。

所述的辣木叶黄酮提取物用于降低血糖、修复胰腺β细胞分泌胰岛素功能的药物及医药产品。

实施例4

辣木叶黄酮提取物的降糖、胰岛保护活性试验方法，它包含以下步骤：

S1、黄酮提取物的制备：称取辣木叶黄酮粉末100mg，定容至1mL，混匀，经0.22um滤器滤过，分装成5个等量样品，待用；

S2、葡萄糖摄取试验：将试验用HepG2细胞溶液用0.25％胰蛋白酶液消化后，接种于培养板中，然后一起置于CO₂培养箱中培养，其中，HepG2细胞溶液的细胞浓度为1.2×10⁵个/mL，待细胞贴壁后，弃去原培养液，用葡萄糖试剂盒测定各孔培养液中初始葡萄糖的浓度，计为G₁，换无血清培养液，饥饿10h，加入DMEM高糖培养液200μL，再分别加入40μL样品，孵育24h后用葡萄糖试剂盒测定各孔培养液中葡萄糖的浓度，计为G₂，采用以下公式计算葡萄糖的消耗量G_C，其中，n为培养板中试验的孔数，根据葡萄糖摄取活性系数K，判断样品葡萄糖摄取活性，K＝1.12，G₀为同体积的异槲皮苷试验样品进行葡萄糖摄取试验得到的葡萄糖消耗量，异槲皮苷试验样品中异槲皮苷的含量为0.0156mg/mL；

S3、糖脂代谢活性试验：取用人工诱导2型糖尿病大鼠模型样品组和对照组各10只，其中，人工诱导2型糖尿病大鼠模型的标准为空腹血糖大于7.8mmol/L，样品组和对照组按样品组的剂量给予等量的生理盐水，于确定大鼠成模当天统一开始灌胃给药，连续灌胃21天，每天8：00AM-9:00AM定时空腹给药一次，灌胃后再给予等量的饲料与饮水，21天后取分别取各组大鼠的血糖变化率，大鼠血脂指标含量，大鼠血清SOD与MDA含量的测定以及胰岛素指数的计算，其中，血糖变化率为55％、大鼠血脂指标含量不超标，大鼠血清SOD变化率为12％，大鼠血清MDA变化率为7.9％,，HOMA-IR指数为1.12；

S4、胰岛保护活性试验：将糖脂代谢活性试验中样品组和对照组的大鼠胰脏用波恩氏液固定，经过脱水、透明、浸蜡后，用石蜡包埋，切片，厚度为5μm，30-45℃烘箱加热固定，对胰腺切片进行HE染色和醛复红染色，脱水，透明，封片，于显微镜下观察，并拍照记录，根据HE染色的胰腺切片中胰岛细胞的数量A₂与对照组中胰岛细胞数量A₁，计算胰岛细胞数量变化率M，如图5、图6所示，其中A₂、A₁分别为样品组合对照组中HE染色的切片下的10只大鼠胰脏细胞数量的平均值，胰岛细胞数量变化率M为8；

根据醛复红染色胰岛β细胞所代表的红色区域面积计算胰岛β细胞增长率N，其中，B₂、B₁分别为样品组合对照组中醛复红染色的切片下10只大鼠胰岛β细胞数量所代表的红色区域面积的平均值，胰岛细胞数量变化率N为5；。

所述的辣木叶黄酮粉末由以下方法制得：取辣木叶粉以60％v/v乙醇为溶剂，料液比为1:60g/ml，进行微波萃取，收集提取液，其中，微波功率为400W，提取时间为6min，然后提取液滤过，旋转蒸发仪减压浓缩，回收乙醇至干，无水乙醇复溶后静置12小时滤过，除去水溶性杂质，滤液再经旋转蒸发仪减压浓缩，除去乙醇，以蒸馏水稀释，高浓度黄酮溶液分装为2mL/管于15mL螺口带盖离心管，置于真空超低温冷冻干燥仪48h，黄酮完全冻干为粉末，取出后，密封，避光，-80℃保存。

所述的试验用HepG2细胞溶液是由以下方法制得：将HepG2细胞接种于细胞培养瓶中，加入1640培养液，置于37℃、饱和湿度的5％CO2培养箱中培养，每隔2d更换1次培养液，3d后传代，传代数1:4，取对数生长期的细胞进行试验。

所述的辣木叶黄酮提取物用于降低血糖、修复胰腺β细胞分泌胰岛素功能的药物及医药产品。

实施例5

辣木叶黄酮提取物的降糖、胰岛保护活性试验方法，它包含以下步骤：

S1、黄酮提取物的制备：称取辣木叶黄酮粉末80mg，定容至1mL，混匀，经0.22um滤器滤过，分装成5个等量样品，待用；

S2、葡萄糖摄取试验：将试验用HepG2细胞溶液用0.25％胰蛋白酶液消化后，接种于培养板中，然后一起置于CO₂培养箱中培养，其中，HepG2细胞溶液的细胞浓度为1.0×10⁵个/mL，待细胞贴壁后，弃去原培养液，用葡萄糖试剂盒测定各孔培养液中初始葡萄糖的浓度，计为G₁，换无血清培养液，饥饿12h，加入DMEM高糖培养液180μL，再分别加入25μL样品，孵育28h后用葡萄糖试剂盒测定各孔培养液中葡萄糖的浓度，计为G₂，采用以下公式计算葡萄糖的消耗量G_C，其中，n为培养板中试验的孔数，根据葡萄糖摄取活性系数K，判断样品葡萄糖摄取活性，K＝1.4，G₀为同体积的异槲皮苷试验样品进行葡萄糖摄取试验得到的葡萄糖消耗量，异槲皮苷试验样品中异槲皮苷的含量为0.0156mg/mL；

S3、糖脂代谢活性试验：取用人工诱导2型糖尿病大鼠模型样品组和对照组各10只，其中，人工诱导2型糖尿病大鼠模型的标准为空腹血糖大于7.8mmol/L，样品组和对照组按样品组的剂量给予等量的生理盐水，于确定大鼠成模当天统一开始灌胃给药，连续灌胃21天，每天8:00AM-9:00AM定时空腹给药一次，灌胃后再给予等量的饲料与饮水，21天后取分别取各组大鼠的血糖变化率，大鼠血脂指标含量，大鼠血清SOD与MDA含量的测定以及胰岛素指数的计算，其中，血糖变化率为54％、大鼠血脂指标含量不超标，大鼠血清SOD变化率为11.5％，大鼠血清MDA变化率为9％,，HOMA-IR指数为1.4；

S4、胰岛保护活性试验：将糖脂代谢活性试验中样品组和对照组的大鼠胰脏用波恩氏液固定，经过脱水、透明、浸蜡后，用石蜡包埋，切片，厚度为5μm，30-45℃烘箱加热固定，对胰腺切片进行HE染色和醛复红染色，脱水，透明，封片，于显微镜下观察，并拍照记录，根据HE染色的胰腺切片中胰岛细胞的数量A₂与对照组中胰岛细胞数量A₁，计算胰岛细胞数量变化率M，如图5、图6所示，其中A2、A1分别为样品组合对照组中HE染色的切片下的10只大鼠胰脏细胞数量的平均值，胰岛细胞数量变化率M为7；

根据醛复红染色胰岛β细胞所代表的红色区域面积计算胰岛β细胞增长率N，其中，B2、B1分别为样品组合对照组中醛复红染色的切片下10只大鼠胰岛β细胞数量所代表的红色区域面积的平均值，胰岛细胞数量变化率N为7；。

所述的辣木叶黄酮粉末由以下方法制得：取辣木叶粉以50％v/v乙醇为溶剂，料液比为1:60g/ml，进行微波萃取，收集提取液，其中，微波功率为400W，提取时间为10min，然后提取液滤过，旋转蒸发仪减压浓缩，回收乙醇至干，无水乙醇复溶后静置12小时滤过，除去水溶性杂质，滤液再经旋转蒸发仪减压浓缩，除去乙醇，以蒸馏水稀释，高浓度黄酮溶液分装为2mL/管于15mL螺口带盖离心管，置于真空超低温冷冻干燥仪48h，黄酮完全冻干为粉末，取出后，密封，避光，-80℃保存。

所述的试验用HepG2细胞溶液是由以下方法制得：将HepG2细胞接种于细胞培养瓶中，加入1640培养液，置于37℃、饱和湿度的5％CO2培养箱中培养，每隔2d更换1次培养液，3d后传代，传代数1:4，取对数生长期的细胞进行试验。

所述的辣木叶黄酮提取物用于降低血糖、修复胰腺β细胞分泌胰岛素功能的药物及医药产品。

结合诱导的2型糖尿病模型大鼠21天。对大鼠的各项指标进行测定后，最终发现：辣木叶黄酮具有改善糖尿病大鼠“三多一少”的症状，降低血糖、改善口服葡萄糖耐受量，减轻氧化应激、抑制炎性反应，降低胰岛素抵抗水平，增加胰岛素敏感性，增强胰岛β细胞功能，且其降低糖尿病心血管疾病风险作用。同时通过HE染色、醛复红染色对不同用药组大鼠的胰岛进行了观察。最终发现，辣木叶黄酮的对胰岛保护的效果较好。镜下表现为，胰岛结构较完整，胰岛组织与腺泡界限清晰可见，胰岛细胞较多，形态较好，排列整齐，胞浆丰富，胞核多数清晰，仅少量细胞变性或坏死，减少了糖尿病大鼠胰岛β细胞的病变。因此，异槲皮苷对糖尿病大鼠胰岛β细胞有保护的作用。基于以上试验数据申请人得出，对于葡萄糖摄取活性系数K大于1、血糖变化率大于50％、大鼠血脂指标含量不超标、大鼠血清SOD增长率为10-20％，MDA减少率在7％以上、，HOMA-IR指数在1以上，计算胰岛细胞数量变化率M在6以上，胰岛β细胞增长率N在5以上的辣木叶黄酮提取物用于降低血糖、修复胰腺β细胞分泌胰岛素功能的药物及医药产品。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。