一种厌氧条件下生物复合降解剂及其应用的制作方法

本发明涉及一种生物复合降解剂，具体涉及一种厌氧条件下生物复合降解剂及其应用。

背景技术：

水是人类重要资源以及一切生物生存的基本物质之一，随着工业化进程的推进，社会经济的不断发展，水体污染越来越令人堪忧。其中，氨氮是水污染的主要污染源之一，污水中氨氮的含量高低直接影响水质的好坏以及水臭程度，根据gb8978-1996《污水综合排放标准》第二类污染物的规定，最高允许排放氨氮含量的二级标准限值应小于50mg/l，现在大多数研究中氨氮的起始浓度一般为100、500或1000mg/l，人为规定氨氮含量在500mg/l以上的废水称为高氨氮废水。目前，对于500mg/l以下的低氨氮浓度降解的研究最多，可以降解到90％～100％，一般达到污水的二级排放标准；但是对于500mg/l以上的高氨氮浓度降解的研究并不是很多，迄今为止研究的最大浓度为1500mg/l，降解效率只有30％，并没有达到污水排放二级标准；而对于1500mg/l以上浓度的氨氮降解情况的研究，尤其是对2000或3000mg/l更高浓度的氨氮研究更是少之又少。

传统理论认为，菌的生长环境应该是28℃摇床中好氧培养，或者通过增加曝气量来降解氨氮，菌在28℃，160r/min条件下培养18～24小时就能生长，但是厌氧环境下2～3天才能生长，好氧条件下的降解效率也比厌氧条件下降解效率高。同时，传统理论认为，硝化反应与反硝化反应是两个不同的生物反应过程，硝化反应是指在微生物作用下将nh4⁺中n氧化为no2^-中n(亚硝化作用)，再进一步氧化为no3^-中n(硝化作用)的过程，反硝化反应是将no3^-中n经微生物作用还原为n2的过程，硝化作用在好氧条件下进行，反硝化作用在厌氧下进行。因此，若能制备得到一种可在厌氧条件下降解污水及渗滤液中高浓度氨氮以及臭气中高含量氨气的微生物菌剂，同步硝化反硝化将有效解决污水和渗滤液恶臭及臭气污染，为环境治理做出贡献。

技术实现要素：

本发明的目的是通过以下技术方案实现的，发明人筛选了一株细菌，分类学命名为柠檬酸杆菌citrobactersph5-xj，保藏编号为cgmccno.13504；还筛选了一株真菌，分类学命名为地霉galactomycessph5-zj，保藏编号为cgmccno.13378；均已于2016年12月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为cgmcc，保藏单位地址：中国·北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101。

本发明进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种厌氧条件下生物复合降解剂，所述生物复合降解剂包含一株细菌菌株h5-xj和一株真菌菌株h5-zj(优选细菌菌株h5-xj和真菌菌株h5-zj的比例为1:1～2)。

本发明进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种厌氧条件下生物复合降解剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将纯化的细菌菌株h5-xj和真菌菌株h5-zj同时接种到筛选培养基中，控制温度25～35℃，调节ph6.5～8.5，发酵时间36～72小时，制得生物复合降解剂母液；

(2)将生物复合降解剂母液按照0.5～1％的比例加入到发酵培养基中，控制温度25～30℃，ph6.5～8.5，发酵时间36～72小时，制备得到生物复合降解剂。

进一步，步骤(1)中，所述筛选培养基由以下含量组分配制而成：红糖19.02～57.06g/l，柠檬酸钠8.17～24.51g/l，k2hpo414g/l，kh2po46g/l，(nh4)2so44.72～14.16g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，微量元素2ml/l，其余为水。

进一步，所述筛选培养基中的c/n比为9～11:1，红糖和柠檬酸钠的添加比例为3～5:1，氨氮降解效果最佳，红糖和柠檬酸钠的结合在提供碳源的基础上，对培养基的酸碱度还起一个调节作用，使得ph维持在7左右。

进一步，所述微量元素由以下含量组分配制而成：edta·2na5～57.1g/l，znso4·7h2o3.9g/l，cacl2·2h2o7g/l，mncl2·4h2o5.1g/l，feso4·7h2o5g/l，(nh4)6mo7o24·4h2o1.1g/l，cuso4·5h2o1.6g/l，cocl2·6h2o1.6g/l，其余为水。

进一步，步骤(2)中，所述发酵培养基由以下含量组分配制而成：红糖19.02～57.06g/l，柠檬酸钠8.17～24.51g/l，k2hpo414g/l，kh2po46g/l，(nh4)2so44.72～14.16g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，微量元素2ml/l，其余为水。

本发明进一步的目的是通过以下技术方案实现的，一种厌氧条件下生物复合降解剂在治理污水、渗滤液及臭气污染中的应用。

进一步，所述厌氧条件下生物复合降解剂在降解污水和渗滤液中的氨氮及臭气中的氨气的应用，将生物复合降解剂以0.5～1％接种量投入到污水及臭气洗涤液中。

本发明的优点在于生物复合降解剂能在厌氧条件下降解高浓度氨氮，没有亚硝态氮和硝态氮积累，同步进行硝化与反硝化，使氨氮降解效率达到90％以上。

附图说明

图1为细菌系统发育树。

图2为真菌系统发育树。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

实施例1

1、生物复合降解剂中细菌、真菌的分离纯化

取北京市南宫垃圾堆肥场垃圾渗滤液10ml，接种于装有100ml灭菌后的富集培养基的250ml三角瓶中，充分摇匀，在温度28℃、转速160r/min的条件下振荡培养，富集7天，每隔1天补充(nh4)2so4，以淘汰不能利用nh4⁺-n的微生物，其中富集培养基的配制如下：红糖19.02～29.68g/l，k2hpo414g/l，kh2po46g/l，(nh4)2so44.72～6g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，微量元素2ml/l，其余为水。

将富集培养基中的菌液取1ml涂布在分离培养基平板上，于28℃培养箱倒置培养，挑取平板上长出的单菌落进行重复分离纯化，得到两株单一菌株，一株为细菌，一株为真菌，其中分离培养基的配制如下：红糖19.02～29.68g/l，k2hpo414g/l，kh2po46g/l，(nh4)2so44.72～6g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，微量元素2ml/l，琼脂20g/l，其余为水。

2、生物复合降解剂的制备

(1)将纯化的细菌菌株h5-xj和真菌菌株h5-zj按照1:1的比例同时接种到筛选培养基中，控制温度25～35℃，调节ph6.5～8.5，发酵时间36～72小时，制得生物复合降解剂母液；其中筛选培养基配制如下：红糖19.02～57.06g/l，柠檬酸钠8.17～24.51g/l，k2hpo414g/l，kh2po46g/l，(nh4)2so44.72～14.16g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，微量元素2ml/l(edta·2na5～57.1g/l，znso4·7h2o3.9g/l，cacl2·2h2o7g/l，mncl2·4h2o5.1g/l，feso4·7h2o5g/l，(nh4)6mo7o24·4h2o1.1g/l，cuso4·5h2o1.6g/l，cocl2·6h2o1.6g/l，其余为水)，其余为水。

(2)将生物复合降解剂母液按照0.5～1％的比例加入到发酵培养基中，控制温度25～30℃，ph6.5～8.5，发酵时间36～72小时，制备得到生物复合降解剂，其中发酵培养基配制如下：红糖19.02～57.06g/l，柠檬酸钠8.17～24.51g/l，k2hpo414g/l，kh2po46g/l，(nh4)2so44.72～14.16g/l，mgso4·7h2o0.2g/l，微量元素2ml/l，其余为水。

3、细菌、真菌及其生物复合降解剂的菌落特征

生物复合降解剂中的细菌(柠檬酸杆菌citrobactersph5-xj)具有下述形态特征：乳白色偏黄，在平板上凸起生长，边缘整齐，菌体湿润，正反颜色相同，较易挑出，生长后期有淡黄色色素积累，在液体培养基中生长较快，培养基混浊，将细菌h5-xj进行革兰氏染色，为革兰氏阴性细菌，无芽孢的中等大小的直杆菌，多散在，单个或成对存在，不产生荚膜。

生物复合降解剂中的真菌(地霉galactomycessph5-zj)具有以下形态特征：菌体白色有地衣状纤维毛，生长较为缓慢，不易用接种环挑出，有质感，生长过程中无色素积累，在液体培养基中漂浮在培养基表面。

生物复合降解剂具有下述形态特征：真菌覆盖于细菌之上生长，生长速度较快，凸起生长，正面乳白色，菌体粉状，有质感，菌落边缘有地衣状纤维毛，反面乳白色，生长后期反面偏浅黄色，在液体培养基中生长较快，培养基浑浊，有少量培养基粘附在壁上。

4、细菌分子鉴定

挑取纯化的细菌单菌落h5-xj接种于筛选培养基中，在温度为30℃、摇床180r/min的条件下振荡培养24小时，然后以其菌液为模板做pcr扩增菌株的16srdna序列，进行测序，筛选的细菌h5-xj的16srdna序列如sedidno：1，长度为1411bp，将细菌进行dna测序，并将测序结果与相应的数据库进行比对，经过序列测定和在http://archive-dtd.ncbi.nlm.nih.gov/网站上进行序列比对，发现该细菌的基因序列与已登记柠檬酸杆菌(citrobactersp)的序列同源性最高，达到99％。

5、细菌菌株系统发育分析

用mega5.0做其发育树见图1，从该菌16srrna构建的系统发育树上看，细菌h5-xj与柠檬酸杆菌citrobactersp发育关系最近，分在同一类群中，序列同源性为99％。因此，基于系统发育树和16srrna同源性角度，细菌h5-xj是柠檬酸杆菌citrobactersp属中的一个新成员，将筛选得到的细菌菌株命名为柠檬酸杆菌citrobactersph5-xj。

6、真菌分子鉴定

挑取纯化的真菌单菌落h5-zj接种于筛选培养基中，在温度为30℃、摇床180r/min的条件下振荡培养24小时，然后以其菌液为模板做pcr扩增菌株的its序列，进行测序，筛选的真菌h5-zj的its序列如sedidno：2，长度为341bp，将真菌进行dna测序，并将测序结果与相应的数据库进行比对，经过序列测定和在http://archive-dtd.ncbi.nlm.nih.gov/网站上进行序列比对，发现该真菌的基因序列与已登记地霉(galactomycessp)的序列同源性最高，达到98％。

7、真菌菌株系统发育分析

用mega5.0做其发育树见图2，从该菌its构建的系统发育树上看，真菌h5-zj与地霉(galactomycessp)发育关系最近，分在同一类群中，序列同源性为98％。因此，基于系统发育树和its同源性角度，真菌h5-zj是地霉(galactomycessp)属中的一个新成员，将筛选得到的真菌菌株命名为地霉galactomycessph5-zj。

实施例2：生物复合降解剂降解高浓度氨氮的实验验证

将实施例1制备的生物复合降解剂接于100ml灭菌后的3000mg/l的初始氨氮浓度的筛选培养基的三角瓶中(2个平行样，1个对照)，在温度28℃，ph值7，转速160r/min的摇床中好氧培养，最高降解24％，其降解效果并不是很理想；但是在温度30℃的培养箱中进行厌氧培养，每天用纳氏试剂比色法对3瓶液体培养基的氨氮进行连续监测，最高降到90％以上。

实施例3：生物复合降解剂的应用

将北京市南宫生物除臭塔的大塔和小塔取回的样品进行氨氮指标测定：大塔臭气洗涤液的氨氮含量为1713mg/l，ph值6.30，出气口处氨气含量为8.26mg/m³，小塔臭气洗涤液的氨氮含量为2471mg/l，ph值6.24，出气口处氨气含量为8.95mg/m³。

将生物复合降解剂按1％的接种量加入南宫大生物除臭塔和小生物除臭塔的臭气洗涤液中，32℃厌氧环境下培养5～10d，大生物除臭塔臭气洗涤液的氨氮降解到133.23mg/l，ph值7.16，出气口处氨气含量为1.84mg/m³，小生物除臭塔臭气洗涤液的氨氮降解效率达到90％以上，ph值7.16，出气口处氨气含量为2.30mg/m³。

实施例4：生物复合降解剂的应用

取北京市南宫垃圾堆肥场垃圾渗滤液1000ml，对其进行各项污染指标的测定：nh4⁺-n1986.34mg/l，cod18170mg/l，ph值8.62，颜色深黑色，原始渗滤液散发臭味。

将生物复合降解剂按接种量1％接于1000ml渗滤液中，在温度30℃的培养箱中进行厌氧培养，每天用纳氏试剂比色法对其氨氮进行连续监测，氨氮降解到126.27mg/l，其降解率达到90％以上，cod降到5570mg/l，ph值8.55，颜色偏棕黄色，臭味消失。

实施例5：按接种量1％加入的应用

对北京市阿苏卫垃圾堆肥场生物除臭塔臭气洗涤液取回的水样以及生物除臭塔采集的进气口和出气口处氨气进行指标测定：臭气洗涤液氨氮含量为2170mg/l，ph值6.15，生物除臭塔的进气口处氨气含量为21.36mg/m³，出气口处氨气含量为11.27mg/m³。

将生物复合降解剂按1％的接种量投入阿苏卫除臭塔臭气洗涤液中，30℃厌氧环境下培养5～10d，臭气洗涤液的氨氮降解效率达到90％以上，ph值7.16，进气口处氨气含量依然为21.36mg/m³，但出气口处氨气含量为1.17mg/m³，氨气降解效率从47.24％增加到94.52％。

综上，生物复合降解剂在厌氧条件下可降解高浓度氨氮，其厌氧条件的优势降低了大型污水以及渗滤液脱氮处理的曝气问题；可降解高浓度氨氮的优势也减少了污水和渗滤液处理的成本问题。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为依据。

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<110>北京环氧环保科技发展有限公司/北京农学院

<120>一种厌氧条件下生物复合降解剂及其应用

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