一株胶原酶生产菌株及其胶原酶基因序列与应用的制作方法

本发明属于工业微生物筛选应用
技术领域：
，具体涉及一株生产胶原酶的菌株，同时涉及一种胶原酶编码基因colc及其氨基酸序列，以及其编码胶原酶在胶原蛋白降解过程中的应用。
背景技术：
：胶原蛋白，又名胶原，英文名collagen，作为一种结构蛋白存在于细胞外的基质中，是一种白色、不透明、无支链的纤维型蛋白质，其分子量约为300kda。它以不溶性纤维的形式广泛存在于动物骨、脚、软骨、皮肤及其它结缔组织中，约占哺乳动物总蛋白量的三分之一，相当于体重的6%。在动物体内，其主要功能是维持皮肤和组织器官的形态和结构，起到支撑器官和保护机体的功能，因此胶原蛋白广泛应用于护肤、护发产品、美容整形品和医药品材料等。除此之外，胶原蛋白也是动物体内蛋白质结构最特殊者，它由三条多肽链构成三股螺旋结构，三条多肽链的每条都左旋形成左手螺旋结构，再以氢键相互咬合形成牢固的右手超螺旋结构。由于其具有独特的三股超螺旋结构，使其性质十分稳定，一般的加工温度及短时间加热都不能使其分解，以及其高分子量，从而造成胶原蛋白大分子消化吸收困难，不易被人体充分利用。胶原酶的化学名为胶原蛋白水解酶（collagenase），它能在生理ph和温度条件下特异性的水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构，而不损伤其他蛋白质的组织。其特异水解胶原蛋白的产物胶原三肽，相比大分子的胶原蛋白则在消化吸收、营养、功能特性等方面都会得到显著的提高。它不仅具有可以直接补充人体的胶原蛋白，达到延缓皮肤衰老达到美容养颜的功效，并且具有更易消化吸收、保护胃黏膜及抗溃疡、抗过敏、降血压、抗氧化、降胆固醇、抗衰老、促进伤口愈合、增强骨强度和预防骨质疏松、预防关节炎、促进角膜上皮损伤的修复和促进角膜上皮的生长等多种生理活性。另外，通过水解将大分子的胶原蛋白转化成主要含有短肽和氨基酸的水解物，可以改善胶原蛋白的水溶性，方便加工，有利于开拓其食品用途，使其产品更利于机体的吸收，因此胶原酶使得胶原蛋白在食品、医药、化妆品等领域有着更为广阔的市场和前景。技术实现要素：本发明的目的是提供一株能胞外产胶原酶的蜡样芽胞杆菌（bacilluscereus）col15，现保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号为cgmcc11167，保藏时间为2015年8月4日。该菌株来源于天津肉联厂附近土壤样品，通过富集培养、透明圈初筛、复筛分离、筛选得到，经形态、生理生化特征、16srdna鉴定，本发明的胶原酶生产菌株为蜡样芽孢杆菌（bacilluscereus），将其命名为蜡样芽胞杆菌（bacilluscereus）col15。其中菌株col15的16srdna具体序列详见序列表seqidno.1，其genbank的编号为kt726339。通过茚三酮显色反应测定胶原酶酶活，本发明菌株所产胶原酶的酶活力为26.7±1.9u/ml。其中本发明对胶原酶酶活的定义为：在37℃，ph7.5条件下，每分钟水解胶原蛋白产生相当于1μg甘氨酸的酶量为1个酶活力单位（u）。本发明的另一个目的是提供一种利用该蜡样芽胞杆菌（bacilluscereus）col15制备、纯化分子量大小约100kda胶原酶的方法。首先，对该菌株产酶的发酵培养基成分进行了优化，其最适碳源为葡萄糖，最适氮源为胰蛋白胨，优化后发酵培养基成分为：葡萄糖20g/l，酵母粉1.5g/l，胰蛋白胨15g/l，cacl20.05g/l，mgcl2·6h2o0.165g/l，k2hpo4·3h2o2.5g/l，nah2po4·2h2o0.5g/l，调整ph7.5。对该菌株产酶的发酵条件进行优化后发现，发酵最适温度为37℃，ph值的最适范围为6.0-9.0。然后，通过离心取得发酵上清液，即胶原酶的粗酶液，将该上清液经由0.22μm的中空纤维膜过滤，滤液于截留分子量为30kda的切向流超滤器进行浓缩，制得的浓缩液于阴离子交换柱进行分离纯化。根据以上制备步骤，从蜡样芽胞杆菌（bacilluscereus）col15中制备出纯化的胶原酶，经sds-page确定，其分子量约为100kda。最终经发酵、制备出的胶原酶sds-page如图2所示。以上利用蜡样芽胞杆菌（bacilluscereus）col15制备胶原酶的过程相对简单，周期相对短暂，操作环节简便，工作量小，并且利用该制备方法尽可能降低了蛋白的损失，使得胶原酶的收率较高。本发明的第三个目的是针对现有蜡样芽胞杆菌（bacilluscereus）col15生产胶原酶的产量相对较低，不利于其应用到批量生产中，因此提供一种蜡样芽胞杆菌胶原酶的编码基因colc以及该基因的异源表达及纯化方法。该蜡样芽胞杆菌（bacilluscereus）col15胶原酶基因colc，其核苷酸序列如seqidno.2所示，在genbank的编号为kt593866，其所编码的氨基酸序列如seqidno.3所示。根据16srdna的同源性比对结果，选取与蜡样芽胞杆菌（bacilluscereus）col15亲缘关系最近菌株的胶原酶基因设计引物，通过pcr方式克隆得到该菌株的胶原酶基因colc，并将其连接到表达载体，转化到大肠杆菌中，获得异源表达胶原酶的重组大肠杆菌菌株。经摇瓶发酵、iptg诱导、高压破碎获得该重组蛋白的粗酶液，粗酶液经镍柱亲和层析和强阴离子交换柱纯化得到重组胶原酶纯化产物。本发明的蜡样芽孢杆菌（bacilluscereus）col15具有培养时营养要求简单、生长快速，生产制备纯品胶原酶的过程简单等优点，所产胶原酶酶活力高，且具有对大多数金属离子不敏感、ph适用范围广泛、温度耐受能力较强等特点，较适合用于产业化放大生产。同时本发明提供编码该菌株胶原酶的基因colc，并建立该基因异源表达和制备的方法，弥补了蜡样芽孢杆菌（bacilluscereus）col15产酶量较低等弊端。异源表达的胶原酶与原始菌col15发酵生产的胶原酶，其降解胶原蛋白的酶活力相当，对比现有报道胶原酶的酶活力，属胶原酶酶活力较高的蛋白酶。以上优点使得该蜡样芽孢杆菌（bacilluscereus）col15发酵所产胶原酶或者异源表达的胶原酶在降解胶原蛋白以及在利用胶原蛋白水解产物等方面具有更广泛的应用前景。附图说明图1为本发明胶原酶产生菌col15菌落形态图；图2为本发明制备纯化胶原酶sds-page检测；图3为大肠杆菌异源表达纯化重组胶原酶的sds-page检测；图4为葡萄糖浓度对菌株col15产酶的影响；图5为胰蛋白胨浓度对菌株col15产酶的影响；图6为培养基初始ph对菌株col15产酶的影响；图7为培养温度对菌株col15产酶的影响；图8为重组胶原酶最适反应温度；图9为重组胶原酶最适反应ph；图10为不同金属离子对重组胶原酶酶活的影响；图11为重组胶原酶的温度稳定性。具体实施方式以下结合具体的实施例对本发明进行详细的描述。实施例1菌株col15的筛选、鉴定与产酶性质一、产胶原酶菌株col15的筛选申请人以天津肉联厂附近采集的土样样品作为基质，按照一定比例分别以无菌水和鸡蛋清混匀后，再加入小片的猪皮和鱼皮，于25~30℃条件下富集培养；然后稀释后涂布到含有2%明胶的lb平板，经酸性汞试剂透明圈复筛后，再把初筛菌株经摇瓶后，分别测定酶活，最终获得了本发明的菌株。二、产胶原酶菌株col15的鉴定1、产胶原酶菌株col15的形态特征本发明中的产胶原酶菌株col15菌落为白色（菌落中央有微量红点），不透明，表面光滑，边缘整齐；菌体为杆状，产芽孢，孢子中生或近中生，孢子囊无明显膨大。2、产胶原酶菌株col15的理化性质参考《伯杰氏细菌鉴定手册》对该产胶原酶菌株col15的生理生化特征进行分析，其生理生化实验结果如下表1：表1：产胶原酶菌株col15生理生化实验检测项目col15菌株革兰氏反应+芽孢＋明胶液化＋淀粉水解－酪素水解－柠檬酸利用－v.p反应－葡萄糖＋/产碱乳糖＋/产碱蔗糖＋/产碱木糖＋/产碱甘露醇＋/产碱阿拉伯糖＋/产碱5%nacl＋10%nacl＋ph5.7＋ph7.5＋ph9.0+其中，“+”表示蜡样芽胞杆菌col15菌株呈阳性反应、能利用或能生长；“-”表示呈阴性反应、不能利用或不能生长。3、产胶原酶菌株col15的16srdna基因分析设计通用引物，通过pcr方式获得该菌株col15的16srdna基因，测序结果进行同源性比对分析（blast），结果发现该菌株的16srdna基因与蜡样芽孢杆菌相似性达到99%。结合形态及生理生化分析结果，初步将该菌株col15鉴定为蜡样芽孢杆菌（bacilluscereus）。三、蜡样芽胞杆菌col15菌株所产胶原酶的制备及活性测定1、胶原酶的制备使用种子培养基（种子培养基组分：牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，调ph7.5）在37℃，200rpm对该菌进行扩大培养24h小时后停止培养，制得种子液。以1%接种量将种子液接种到1l发酵培养基中（发酵培养基成分为：葡萄糖20g/l，酵母粉1.5g/l，胰蛋白胨10g/l，cacl20.05g/l，mgcl2·6h2o0.165g/l，k2hpo4·3h2o2.5g/l，nah2po4·2h2o0.5g/l，调整ph7.5），于37℃，200rpm培养54h小时，然后离心收集发酵上清液，即制得胶原酶粗酶液。上清液经0.22μm中空纤维膜进一步除去菌体后，以30kda切向流超滤器（vivaflow50）对上清液进行浓缩，直至将体积浓缩到约20ml；以去离子水对浓缩后的发酵液透析24h；使用强阴离子交换柱（source15q）对透析后的浓缩液进行分离，洗脱液为50mmol/ltris-hcl（含5mmol/lcacl2）ph7.5的缓冲液，收集不同的组分进行胶原酶活分析；将具有胶原酶活的组分进行sds-page，最终分子量约为100kda的纯品蛋白即为制得的具有胶原裂解活性的蛋白酶。2、胶原酶活性测定方法以0.01mol/l乙酸溶液充分溶解ⅰ型胶原蛋白，再将溶解后的胶原蛋白加入50mmol/ltris-hcl（含5mmol/lcacl2）ph7.5的缓冲液中，制得终浓度为5mg/ml的ⅰ型胶原蛋白溶液。取0.3ml含ⅰ型胶原的缓冲液和0.01ml胶原蛋白粗酶液，在37℃水浴中反应30min，添加0.3ml30%三氯乙酸以终止反应，混匀后采用茚三酮法依次加入0.6ml2mol/l乙酸缓冲液和0.6ml茚三酮显色液，混匀后于沸水浴中煮沸15min，再利用自来水将试管冷却，加入1.8ml60%乙醇稀释反应液，混匀后于570nm处比色，测定反应所释放出的水溶性氨基酸、短肽的量，空白为加热失活的粗酶液。酶活力单位定义为：37℃，ph7.5条件下，每分钟每毫升发酵液水解胶原产生相当于1μg甘氨酸的酶量为1个酶活力单位（u/ml）。实施例2菌株col15的发酵优化研究通过单因素实验分别对菌株col15发酵生产胶原酶的发酵培养基和发酵条件进行优化。在250ml三角瓶中加入50ml发酵培养基，121℃高压蒸汽灭菌30min，并且将培养基中的单糖分开灭菌，灭菌冷却后再加入培养基中。所有实验设计三次平行，并且前一步的优化结果用于后续的实验设计。（1）培养基最适碳源的确定配制培养基时分别加入2%的不同碳源外，其它成分不变。经摇瓶发酵培养54h后测定酶活力，结果表明，col15菌株的最适碳源为葡萄糖，其它碳源如甘露糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖对菌株的产酶均无明显的提高。以葡萄糖为唯一碳源，在50ml发酵培养基中分别加入不同浓度的葡萄糖，而其它成分不变。经摇瓶发酵培养54h后测定酶活力，结果如图4，col15菌株的最适葡萄糖浓度为2.0%。（2）培养基最适氮源的确定在发酵培养基中，分别以1%的添加量加入胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、明胶、尿素、(nh4)2so4以及胰蛋白胨与酵母粉的组合培养基，其它成分不变。经摇瓶发酵培养54h后测定酶活力，结果如表2.2所示，其中col15菌株的最适氮源为胰蛋白胨。以胰蛋白胨做为唯一氮源，分别加入不同浓度的胰蛋白胨，而其它成分不变。经摇瓶发酵培养54h后测定酶活力，结果如图5示，其中col15菌株的最适胰蛋白胨浓度为1.5%：（3）培养基最适ph的确定调节发酵培养基的ph为5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0，摇瓶发酵54h后测定酶活力，结果如图6，col15菌株ph值的适应范围很广泛，为6.0-9.0，其中最适ph7.5。（4）培养基最适温度的确定调节发酵温度为30、37、40、45、50℃，摇瓶发酵54h后测定酶活力，结果见图7，发现col15菌株最适温度为37℃。通过以上优化，培养基配方为：葡萄糖20g/l，酵母粉1.5g/l，胰蛋白胨15g/l，cacl20.05g/l，mgcl2·6h2o0.165g/l，k2hpo4·3h2o2.5g/l，nah2po4·2h2o0.5g/l，调整ph7.5。利用以上优化后的培养条件，培养得到的蜡样芽胞杆菌（bacilluscereus）col15酶活力为65.81±2.06u/ml，相比较未优化前的菌株酶活力26.7±1.9u/ml，虽未能明显提高菌株col15的产酶能力，但可表明该菌株具有较宽泛的产酶条件，以此证明该菌株有利于应用到生产的潜力。实施例3菌株col15鱼皮降解实验将菌株col15复苏活化后，37℃200rpm发酵培养54h，以5500rpm离心30min，收集上清液即得菌株col15粗酶液，以未培养菌种col15的培养基作为对照。将鳕鱼皮以自来水解冻，除去多余的碎肉及鱼鳞等组织，剪成5mmx5mm的碎片，充分沥干后称重并等分成两份，分别将沥干等分的鱼皮加入到含50ml粗酶液和对照培养基的三角瓶中，于37℃120rpm水浴摇床反应48h，参考对照，即可明显看到鳕鱼皮发生了降解。实施例4大肠杆菌bl21/pet21a-colc表达制备胶原酶colc该胶原蛋白裂解酶基因colc是以蜡样芽孢杆菌（bacilluscereus）col15提取的基因组dna为模板，用pcr的方法克隆得到的。同时在pcr引物上设计合适的酶切位点saci和xhoi，将该基因重组到表达载体pet21a中，获得重组质粒pet21a-colc。将该构建好的质粒以化转的方式整合到大肠杆菌bl21感受态细胞中，以此获得了整合重组质粒的重组表达菌株bl21/pet21a-colc。将此重组表达菌株bl21/pet21a-colc接种到含amp的lb培养基中，经37℃200rpm摇瓶发酵到od600=0.6~0.8时，此时菌株处于对数期，添加iptg诱导过夜表达重组蛋白。诱导后的发酵液经离心收集菌体，高压破碎后14000rpm30min高速离心收集菌体上清，即得该重组蛋白的粗酶液。该粗酶液经镍柱亲和层析和强阴离子交换柱纯化得到重组蛋白纯化产物，并以sds-page检测纯化的重组胶原蛋白。结果表明，经过两次纯化即可得到纯度在90%以上的胶原酶。通过对比大肠杆菌bl21异源表达的胶原酶与原始菌col15表达的胶原酶，其胶原蛋白降解酶活力相当，分别为7615.0±78.7u/mg和7133.5±53.6u/mg，对比现有报道胶原酶的酶活力，属胶原酶酶活力较高的蛋白酶。实施例5重组胶原酶colc的酶学性质研究（1）酶活反应最适温度按照实施例1中的酶活检测方法，在0.3ml浓度为5mg/ml的胶原蛋白底物中，加入0.005ml浓度为0.2mg/ml的重组胶原酶，设置不同的反应温度，并且每个反应温度均设置三组平行实验，水浴反应30min后终止反应，分别测定其胶原酶的相对酶活。结果如图8表明，该酶的最适酶活反应温度为40℃左右。（2）酶活反应最适ph分别以不同的无机盐，配置ph分别为4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的缓冲液，并最终以不同的缓冲液配制5mg/ml的胶原蛋白底物。每个实验设计三次平行，分别测定重组胶原酶的酶活力。结果如图9表明，该重组胶原酶的ph适用范围广泛，其中在ph7.0-8.0之间具有较好的酶活力。（3）金属离子对酶活反应的影响如实施例1中所示，分别在反应体系中加入不同的金属离子，配置终浓度为5mg/ml的胶原蛋白底物，并以不加任何金属离子的反应体系作为对照，每种金属离子设计三个平行实验，于37℃水浴反应30min，反应终止后分别测定胶原酶的酶活力。结果如图10所示，除cu2+对该重组胶原酶的酶活有抑制作用外，该胶原酶对多数金属离子不敏感。（4）重组胶原酶的温度稳定性分别设置40℃、50℃、60℃三个温度梯度，将重组胶原酶分别在不同的温度下保温一段时间后，再按实施例1中所述的酶活检测方法，以终浓度为5mg/ml的胶原底物分别反应，同样设计三组平行实验，反应结束后分别测定胶原酶的酶活力，结果如图11所示，该胶原酶在50℃以下仍能保留较好的酶活力，在60℃时即能在短时间内迅速失活。对大肠杆菌异源表达的蜡样芽孢杆菌（bacilluscereus）col15的胶原酶的酶学性质进行初步的研究，表明该胶原酶具有对大多数金属离子不敏感、ph适用范围广泛、温度耐受能力较强等特点，较适合用于产业化放大生产。序列表sequencelisting<110>李星硕<120>一株胶原酶生产菌株及其胶原酶基因序列与应用<130>3<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>1438<212>dna<213>bacilluscereus<400>1gtcacttaggcggctggctccaaaaaggttaccccaccgacttcgggtgttacaaactct60cgtggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcatgctgatc120cgcgattactagcgattccagcttcatgtaggcgagttgcagcctacaatccgaactgag180aacggttttatgagattagctccacctcgcggtcttgcagctctttgtaccgtccattgt240agcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcct300ccggtttgtcaccggcagtcaccttagagtgcccaacttaatgatggcaactaagatcaa360gggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccat420gcaccacctgtcactctgctcccgaaggagaagccctatctctagggttttcagaggatg480tcaagacctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgt540gcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagccttgcggccgtactccccaggcggagtg600cttaatgcgttaacttcagcactaaagggcggaaaccctctaacacttagcactcatcgt660ttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcgcctcag720tgtcagttacagaccagaaagtcgccttcgccactggtgttcctccatatctctacgcat780ttcaccgctacacatggaattccactttcctcttctgcactcaagtctcccagtttccaa840tgaccctccacggttgagccgtgggctttcacatcagacttaagaaaccacctgcgcgcg900ctttacgcccaataattccggataacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggca960cgtagttagccgtggctttctggttaggtaccgtcaaggtgccagcttattcaactagca1020cttgttcttccctaacaacagagttttacgacccgaaagccttcatcactcacgcggcgt1080tgctccgtcagactttcgtccattgcggaagattccctactgctgcctcccgtaggagtc1140tgggccgtgtctcagtcccagtgtggccgatcaccctctcaggtcggctacgcatcgttg1200ccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatgcgacgcgggtccatccataagtgac1260agccgaagccgcctttcaatttcgaaccatgcggttcaaaatgttatccggtattagccc1320cggtttcccggagttatcccagtcttatgggcaggttacccacgtgttactcacccgtcc1380gccgctaacttcataagagcaagctcttaatccattcgctcgactgcatgtattaggc1438<210>2<211>2895<212>dna<213>bacilluscereus<400>2atgaacaagaaatcaaagatcaataaagtgatgcttagcattagtacaatggctttatcg60ttaggcgcacttcaaactcatgcagcagcggaagaaaaagtaccttataacgtgttaaaa120acgaaaccggttggaattgaaaagtcggtagatgaagttggacatatttcaaaagttgat180gaaactttatcatttcaagaacgtttaaaagtaggagatttttcacaacgaccagcatct240attacgaagaaaactgcagtaaagcaggttaaagaaagctattcaatggctgatttaaac300aaaatgaatgaccaagaattagttgaaacgttaggcagtattaaatggcaccaaattaca360gacttattccagtttaatgaagatgcaaaggctttttataaagataaaggaaaaatgcaa420gtcattatagatgaattagctcatagaggtagtacatttacgaaagatgattcaaaagga480attcaaacgtttactgaagtgctgcgttcagctttttatcttgcattttataatagtgaa540ttaagcgacttaaatgaaagaagcttccaggataaatgtttacctgctttaaaagcaatc600gcaaaaaatccaaactttaagcttggtacagttgaacaagatacagtcgtatctgcgtac660ggtaaattaattagtaatgcttcaagcgatgttgaaacggttcaatatgcatcgaatatt720ttaaagcaatacaatgataattatactacttatgtaaatgatcgaatgaagggacaagca780atatacgatattatgcaaggtattgactatgatatgcagtcgtacttaactgaggctcgt840aaagaagcgaatgaaacgatgtggtatggaaaagtagatgggtttattaatgaaataaat900cgtattgctcttctaaatgaagtaacgccagaaaataaatggctcgttaataatggcatt960tattttgctagccgtttagggaagtttcatagcaatccaaataaaggattagaggttgtt1020acacaagcaatgcatatgtacccgcgcttaagtgaaccgtattttgttgcggtagaacaa1080attacaacaaattataatggtaaagattatagcgggaatacagtagatttagagaaaata1140cgtaaagaaggaaaagagcaatacctaccaaaaacgtatacattcgacgatggatcaatt1200gtgttcaaaacaggag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