功能多肽及其制药用途的制作方法

本发明属于化学生物学领域，具体涉及一种功能多肽及其制药用途，尤其涉及：(一)利用功能多肽对上述两类核糖核酸的包裹、靶向性细胞内运输；(二)利用功能多肽运输上述两类核糖核酸实现的核糖核酸干扰治疗；(三)利用功能多肽实现的核糖核酸干扰治疗效果的实时评估。

背景技术：

核糖核酸干扰(rnainterference,rnai)是近年来发现的针对体内特定靶基因进行调节的生物过程。在rnai过程中，小分子非编码rna，如内源性的微小核糖核酸(microrna,mirna)和外源性的小干扰核糖核酸(smallinterferingrna,sirna)可通过碱基互补配对的原则使它们的靶信使核糖核酸(mrna)被降解或抑制它们的翻译。rnai不仅与体内生理过程紧密相关，并且在众多疾病的发生发展中也有着举足轻重的作用。因而，sirna和mirna近年来已经被视为可通过rnai实现治疗目的的一类新型的先导药物。然而，由于sirna和mirna本身的负电性及在血清等复杂生理环境中的不稳定性，sirna和mirna的运输仍然需要额外的载体实现，这就要求所用的载体需要具有优良的生物相容性、可降解性及运输操作过程的简便性。另外，在rnai治疗过程中仍有两个需要解决的关键问题：运输过程中如何实现sirna和mirna的靶向运输以提高rnai治疗的效率；运输过程中如何实现rnai治疗效果的实时成像以用于评估rnai治疗的效率。

多肽是一类具有优良生物相容性的化学分子，其可通过化学手段轻易修饰各类不同的功能基团，具有良好的生物应用潜力。在本发明中，发明人发明了可在阳离子九聚精氨酸的两端通过特定化学方法引入靶向细胞膜表面受体的分子，以及可对rnai治疗效果评估的成像探针，利用得到的功能多肽可实现小干扰核糖核酸和微小核糖核酸的细胞内靶向运输、治疗以及治疗效果的实时成像。

技术实现要素：

解决的技术问题：本发明提供一种功能多肽及其制药用途，可实现小干扰核糖核酸和微小核糖核酸的细胞内靶向运输、治疗以及治疗效果的实时成像。

技术方案：功能多肽，结构如下所示：

其中r代表l-构型的精氨酸，x为连接基团，yy为靶向分子，pyr为吡唑啉荧光团，z为可被不同蛋白酶识别剪切的短肽，quencher为对应于pyr的荧光淬灭基团；y或pyr-z-quencher可分别连接在九聚精氨酸的n端或c端。

上述x为含一至十个碳的烷基、低聚或多聚乙二醇、二硫键、酰胺键、酯键、醚键或三氮唑。

上述y为叶酸、透明质酸、链状rgd肽、环状rgd肽、rvg肽、tat肽、mpg肽、eb1肽、egfr抗体或her2抗体。

上述z为蛋白酶底物肽段devd、plgvr、gpgpnq或kk。

上述quencher为dabcyl、qsy21或bhq。

上述pyr为光点击化学反应荧光产物吡唑啉，化学结构特征如下：

其中x或z可以连接在任意位置上，ar1和ar2分别为苯环或萘环。

功能多肽的优选结构如fa-r9-fpcas3所示：

上述功能多肽在制备核糖核酸干扰诊疗药物中的应用。

上述功能多肽在筛选核糖核酸干扰诊疗药物中的应用。

有益效果：本发明提供的功能多肽及其制药用途，可用于sirna和mirna细胞内靶向运输、治疗及诊断。能够实现小干扰核糖核酸和微小核糖核酸的细胞内靶向运输、治疗以及治疗效果的实时成像。适用于制备核糖核酸干扰诊疗药物，及筛选核糖核酸干扰诊疗药物。

附图说明

图1为fa-r9-fpcas3的质谱图；

图2为凝胶电泳分析图；

图3为纳米颗粒尺寸及电位趋势图；

图4为hela细胞内mir-34a运输定量分析图；

图5为hepg2、mcf-7、a549细胞内mir-34a运输定量分析图；每组柱状数据自左往右依次为blank、mirnc-nc、mirnc-34a、lipo-34a。

图6为hela细胞内荧光素酶实验结果图；

图7为hela细胞内sirt1、caspase-3蛋白表达测试结果图；

图8为hela细胞凋亡结果图；

图9为hela细胞内mir-34a的功能实时成像结果图；

图10为hela细胞内caspase-3蛋白量随时间变化结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是，应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神下，可以对技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

(一)功能多肽与sirna或mirna的纳米复合物的制备

将功能多肽与sirna或mirna以一定比例稀释于高糖培养基或磷酸盐缓冲液中，混匀后置于室温放置30分钟。

(二)sirna和mirna的靶向运输

选取细胞膜表面富含上述靶向基团受体的细胞系，将上述得到的rna纳米复合物加入到细胞内，一定时间后，提取细胞内rna并用定量rt-pcr对细胞内sirna或mirna的表达量进行测定。

(三)荧光素酶实验

通过功能多肽运输的sirna和mirna刺激细胞内的荧光素酶信号变化判断其生物活性，具体流程如下：

(1)构建含有sirna或mirna结合位点的荧光素酶质粒；

(2)将质粒转染到测试细胞内后，用功能多肽运输相应的sirna或mirna；

(3)72小时后测定细胞内荧光素酶信号。

(四)蛋白印迹实验

利用功能多肽运输相应的sirna或mirna到细胞内，在培养不同时间后，提取细胞内的总蛋白，利用sds-page进行分离，并将蛋白转印到pvdf膜上后利用相应抗体进行检测。

(五)流式细胞凋亡测试

利用功能多肽运输相应的sirna或mirna到细胞内。在培养不同时间后，收集细胞，利用细胞凋亡检测试剂盒对凋亡细胞进行染色，并用流式细胞仪进行定量分析。

(六)共聚焦荧光成像

利用功能多肽运输相应的sirna或mirna到细胞内。在培养不同时间后，利用pyr的荧光对运输的sirna或mirna在细胞内的功能进行直接成像。

实施例1、fa-r9-fpcas3的合成

1、pa-r(pbf)9的合成

通过标准固相合成方法，以氯三苯甲基氯树脂为固相载体合成九聚精氨酸，最后在末端通过o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu)连接丁炔酸，随后加入1％三氟乙酸(tfa)/二氯甲烷(体积比)从树脂上切除，再用hplc分离得到pa-r(pbf)9。

2、1b的合成

通过标准固相合成方法，以氨基树脂为固相载体合成devdk序列，最后在末端通过hbtu连接3-马来酰亚胺基丙酸，随后加入tfa切除保护基团，再用hplc分离得到中间产物。将37mg中间产物(0.049mmol)与18mgdabcylnhs酯(0.049mmol，百灵威)(溶解在dmso中，加入87μln，n-二异丙基乙胺(dipea，0.5mmol)，室温反应过夜，随后用hplc分离得到1b(31mg，62.9％)。

3、tet-nh2的合成

将175mg化合物1a(1mmol)溶解在二氯甲烷中，随后在冰浴条件下加入205mg氯甲酸异丁酯(1.5mmol)以及152mg4-甲基吗啉(1.5mmol)，室温搅拌4小时后加入237mg化合物1b(1mmol)。室温下继续反应4小时后，柱层析分离得到283mg1c(71％)。将1c溶解于二氯甲烷中，加入50％(体积比)tfa，室温反应1小时后，蒸干溶剂后得到196mgtet-nh2(92.8％)。

其中1b的合成方法:

(1)化合物1b-1(1.5g，10mmol)和对甲基苯磺酰肼(1.86g，10mmol)溶于甲醇(50ml)及水(50ml)中，室温搅拌5分钟，析出大量白色固体，过滤得1b-23g(产率93％)。

(2)苯胺重氮盐是通过将2ml冷的亚硝酸钠溶液(5mmol)在5℃以下倒入含有1.3ml浓盐酸的苯胺(5mmol)的50wt.％乙醇水溶液中制备得到。将重氮盐滴加到30ml溶有1b(1.6g，5mmol)的吡啶溶液中，控制反应温度在-10℃至-15℃。滴加完全后继续反应3小时后，用二氯甲烷和水萃取反应，有机层合并后用稀盐酸洗涤并用无水硫酸钠干燥。减压蒸馏去除溶剂后，通过柱层析提出得到黄色粉末1b-30.7g(产率53％)。

(3)1b-3(0.6g，2.5mmol)溶解于dioxane(10ml)中，加热回流(80℃)na2s(3g，7.5mmol)的水溶液(5ml)滴加到dioxane中。继续加热回流2小时，二氯甲烷和水萃取反应，有机层合并后用无水硫酸钠干燥。减压蒸馏去除溶剂后，通过柱层析提出得到黄色粉末1b0.5g(产率80％)。

4、fa-n3的合成

将44mg叶酸(2a，0.1mmol)溶解于dmso中，加入51mg二环己基碳二亚胺(dcc，0.2mmol)以及22mgn-羟基琥珀酰亚胺(nhs，0.2mmol)。室温反应过夜后，滤去沉淀，加入44mg氨基三聚乙二醇叠氮(2b，0.2mmol，tci)以及61mg4-二甲氨基吡啶(dmap，0.5mmol)，室温反应4小时以后，用hplc分离得到fa-n3(15mg，23.4％)。

5、1a的合成

将175mg的pa-r(pbf)9(0.046mmol)与14mg的氨基修饰的四氮唑分子(tet-nh2)(0.046mmol)溶解在二氯甲烷中，随后加入30mg的hbtu(0.08mmol)以及28μl的n，n-二异丙基乙胺(dipea，百灵威)(0.016mmol)。混合液在室温下搅拌过夜，蒸去溶剂后，加入tfa切除保护基团，随后用hplc分离得到1a(41mg，50.1％)。

5、r9-fpcas3的合成

将18mg的1a(0.01mmol)与20mg的1b(0.02mmol)溶解在乙腈/pbs的混合溶液中(ch3cn/pbs，体积比1/1)，随后用发射波长为302nm的手提紫外灯光照30分钟，随即用hplc分离得到r9-fpcas3(18mg，65％)。

6、fa-r9-fpcas3的合成

将10mg的r9-fpcas3(0.0036mmol)与5mg的fa-n3(0.0072mmol)溶解在dmso/h2o的混合溶液中(dmso/h2o，体积比2/1)，随后加入200mg抗坏血酸钠，3.2mg的硫酸铜，50mg的thpta，在30℃反应4小时。随后用hplc分离得到fa-r9-fpcas3(3.6mg，29.4％)。分子量理论值为3398.7425，实际测量值为3399.4939(图1)。

fa-r9-fpcas3对mir-34a的包裹

将100pmolemir-34a溶解于100μldmem中，后将0.2μl，0.4μl，0.6μl，0.8μl的5mmfa-r9-fpcas3分别加入到dmem中，得到几组不同摩尔比的混合液，将混合液置于室温中放置30分钟。

凝胶电泳分析

配制2％琼脂糖凝胶，分别取上述混合液进行电泳分析，并用溴化乙锭对mir-34a进行显色。如图2所示，在fa-r9-fpcas3的比例逐渐增加时，游离的mir-34a逐渐消失，表明两者的纳米复合物逐渐生成，且复合物的大小和电位也随之变化(图3)。

靶向细胞内运输

将hela细胞种入12孔板中，24小时后，将mir-34a或阴性对照nc与fa-r9-fpcas3的混合液加入到细胞培养基中，mir-34a或阴性对照nc的终浓度为100nm，培养24小时后，用trizol提取细胞内rna。如图4所示，当fa-r9-fpcas3的摩尔比例逐渐增加时，进入细胞内的mir-34a的量也逐渐增加，当摩尔比例为30/1时达到最佳转运效果，该比例的复合物定义为mirnc-34a，阴性对照为mirnc-nc，且转运效率与商业化的试剂lipofectamine2000相当。

取叶酸受体阴性的hepg2、mcf-7、a549细胞作为对照，进行上述相同实验。如图5所示，mirnc-34a向阴性细胞中转运mir-34a的效率较低，验证了靶向运输的能力。

mirna表达量的测定

取出1μg的rna进行逆转录反应制备相应的cdna样品。具体逆转录反应10μl体系为：

5×amvbuffer(takara)2μl

amv(takara)0.5μl

rtprimer(abi)0.5μl

dntpmixture(takara)1μl

depch2o5μl

rna1μl

反应程序为：16℃30min，42℃30min，85℃5min，4℃保存。制备好的cdna再用探针法(taqman)pcr对mir-122进行实时定量。

20μltaqmanpcr反应体系为：

10×buffer(takara)2μl

mgcl2(25mm)(takara)1.2μl

taq(takara)0.3μl

dntpmixture(10mm)0.4μl

probe(abi)0.33μl

cdna1μl

distilledh2o14.77μl

pcr反应程序为95℃5min，95℃15s后60℃1min40个循环扩增，实时荧光信号均在每个循环的60℃采集。

荧光素酶实验

(1)报告质粒的构建

使用hindiii和spel(itakara)内切酶剪切luciferase报告质粒(promega)的3’utr端，将得到的片断进行电泳分离纯化。mir-34a的互补序列分别通过dna连接酶，t4ligase(takara)，插入到纯化得到的luciferase报告质粒中，并转化到感受态大肠杆菌内，再通过含有氨苄的筛选平板筛选得到可能的阳性质粒。最终将该报告质粒进行测序确认其正确性(invitrogen)。

(2)荧光素酶分析

鉴定后的报告质粒通过转染进入hela细胞中。首先将细胞种到24孔板中，当细胞密度达到70-80％时，将0.25μgmir-34a报告质粒和0.15μgβ-galactosidase内参质粒用lipofectamine2000试剂转染进细胞，转染操作遵循invitrogen产品说明。在转染4小时后，将mir-34a或阴性对照nc用fa-r9-fpcas3运输到细胞中(摩尔比1/30)，mir-34a或阴性对照nc的终浓度为100nm，继续培养72小时后，测定luciferase和β-galactosidase内参信号。如图6所示，mirnc-34a向细胞内运输的mir-34a仍然具有抑制靶基因表达的功能。

蛋白印迹实验

将hela细胞种入6厘米培养皿中，24小时后，将mir-34a或阴性对照nc与fa-r9-fpcas3的混合液(摩尔比1/30)加入到细胞培养基中，mir-34a或阴性对照nc的终浓度为300nm，培养24小时到72小时后，提取蛋白裂解液。将蛋白裂解液与1×sdsloadingbuffer混匀后，根据蛋白的大小选择不同浓度(一般10％)的sds-page对样品进行蛋白分离。蛋白成功分离后，将蛋白湿转到pvdf膜上，再用含有5wt.％脱脂奶粉的tbst/tween-20缓冲液进行1小时封膜，然后用一抗4℃过夜孵育，tbst/tween-2010min洗涤四次，二抗室温孵育1小时，再用tbst/tween-2010min洗涤四次，最后用ecl试剂显影蛋白条带。如图7所示，相比于空白细胞或mirnc-nc处理的细胞，mirnc-34a处理的细胞内mir-34a的直接靶标sirt1的表达量显著下降，而下游的caspase-3表达量显著上升，表明mir-34a具有调控功能。

流式凋亡检测实验

将hela细胞种入6孔板中，24小时后，将mir-34a或阴性对照nc与fa-r9-fpcas3的混合液(摩尔比1/30)加入到细胞培养基中，mir-34a或阴性对照nc的终浓度为300nm，培养24小时到72小时后，收集细胞并用流式凋亡检测试剂盒进行染色，随后用流式细胞仪式进行定量检测。如图8所示，相比于空白细胞或mirnc-nc处理的细胞，mirnc-34a处理的细胞凋亡显著上升。

细胞内mir-34a功能实时成像实验

将hela细胞种入35毫米共聚焦培养皿中，24小时后，将mir-34a与fa-r9-fpcas3的混合液(摩尔比1/30)加入到细胞培养基中，mir-34a的终浓度为300nm，培养24小时到72小时后，在共聚焦荧光显微镜下直接观察pyr的荧光，细胞核选用draq5染色。如图9所示，在mirnc-34a处理后，对应于激活caspase-3表达量的pyr荧光也随孵育时间逐渐增强，而细胞表型也提示细胞逐渐凋亡。而蛋白印迹结果也验证了成像结果(图10)。

上述具体实施方式不以任何形式限制本发明的技术方案，凡是采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案均落在本发明的保护范围。