一种猪非典型瘟病毒RT‑PCR检测特异性引物、试剂盒及检测方法与流程

本发明属于属于动物病毒学及分子生物学
技术领域：
，具体涉及一种猪非典型瘟病毒RT-PCR检测特异性引物、试剂盒及检测方法。
背景技术：
：瘟病毒属属于黄病毒科，是有囊膜高度变异的RNA病毒，其基因组长度约12.3kb。目前已确定的有4个种：牛病毒性腹泻1型病毒(BVDV-1)，牛病毒性腹泻2型病毒(BVDV-2)，猪瘟病毒(CSFV)和边界病毒(BDV)。另外还有几种未确定的非典型瘟病毒，包括长颈鹿瘟病毒，羚羊瘟病毒，HoBi样病毒和Bungowannah病毒。2015年美国学者在对一份PRRSV阳性样本做宏基因组学分析时，发现其中有片段与瘟病毒CSFV、BVDV及菊头蝠瘟病毒(RaPV)预期值(E)从8e-6-1e-88，并具有68％-98％同一性(identity)。他们将这种病毒暂时命名为“Atypicalporcinepestivirus，APPV”(BenM.Hause,EmilyA.Colin,LalithaPeddireddietal,2015.DiscoveryofanovelputativeatypicalporcinepestivirusinpigsintheUSA.JournalofGeneralVirology,96,2994-2998.)。2016年，德国学者从先天性震颤的仔猪小脑以及外周神经检测到APPV核酸，而健康仔猪未检测到，从而提出新生仔猪先天性震颤可能与APPV存在一定关联。另一篇德国学者的研究表明，APPV在德国猪群中有较高的感染率，并且在一株特殊的PK-15细胞上可以检测到病毒复制(M.Beer,K.wernike,C.etal.2016.HighPrevalenceofHighlyVariableAtypicalPorcinePestivirusesFoundinGermany.TransboundandEmergDiseases，doi:10.1111/tbed.12532.)。这些发现可能有助于对仔猪先天性震颤发病原因的理解，国外多采用PCR方法对该病毒进行检测，但该病毒属于RNA病毒，基因序列变异快，不同毒株间基因序列差异大，NCBI目前登陆序列同源性也仅88.1％-90.9％，国外建立的PCR方法在国内适用性不强，且国内尚无针对该病毒的检测方法出现。由此可见，现有技术还存在较大不足。技术实现要素：鉴于此，有必要针对上述问题提供一种猪非典型瘟病毒PCR检测特异性引物、试剂盒及检测方法，对猪非典型瘟病毒进行快速、准确地鉴别。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种猪非典型瘟病毒RT-PCR检测特异性引物，核苷酸序列如下：上游引物F：ctcacyagtgatgggtggga(SEQIDNO:1)，其中，y代表：c或者t；下游引物R：cctatyttcttcatgaayaccatggc(SEQIDNO:2)，其中，y代表：c或者t。一种猪非典型瘟病毒的检测试剂盒，，包括所述的猪非典型瘟病毒RT-PCR检测特异性引物。进一步的，所述试剂盒还包括：一步法RT-PCR试剂(均来自市售)：PrimeScript1step酶混合物，2×1step缓冲液，无核酸酶水。进一步的，所述引物或试剂盒应用于猪非典型瘟病毒的检测。一种猪非典型瘟病毒的PCR检测方法，包括：(1)待检样本RNA提取；(2)利用所述的特异性引物，采用一步法RT-PCR扩增步骤(1)中所得的样本RNA；(3)取步骤(2)中所得PCR反应产物进行电泳鉴定；(4)结果判定。进一步的，所述步骤(2)中一步法RT-PCR反应体系为：进一步的，所述步骤(2)中一步法RT-PCR扩增条件为：进一步的，所述步骤(1)中的样本可以是离体血清、肺脏样本和淋巴结样本等。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供了一组PCR的引物，该引物特异性和灵敏度都较高，且能够检测出猪非典型瘟病毒，可以对各种临床样本进行检测、鉴别，从而可以快捷地对临床样本进行检测，操作简单、实用。附图说明图1为本发明对样本扩增的电泳图，其中泳道1为阳性样本，泳道2为阴性对照。图2为本发明特异性检验结果。其中泳道1为阳性样本，泳道2-7分别为猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒，8为阴性对照。图3为本发明灵敏度结果，1、2、3、4、5、6代表的RNA浓度分别为1.22μg/μL、0.122μg/μL、0.0122/μLμg、1.22ng/μL、0.122ng/μL、0.0122ng/μL。图4实施例1检测结果，泳道1为阳性血清样品，泳道2为病料样本1，泳道3为病料样本2，泳道4为DMEM。具体实施方式为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本
发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。实施例1一种猪非典型瘟病毒PCR检测引物、检测试剂盒及检测方法1、一种猪非典型瘟病毒PCR检测引物根据NCBI登陆的猪非典型瘟病毒的毒株序列，登录号：KU194229、KX929062、LT594521、KU041638、KU041639、KU041637、KX929063、KX929069等提供的信息，运用DNAMAN6.0进行比对分析，设计了以下PCR的引物：上游引物F：ctcacyagtgatgggtggga(SEQIDNO:1)，其中，y代表：c或者t；下游引物R：cctatyttcttcatgaayaccatggc(SEQIDNO:2)，其中，y代表：c或者t；使用上述引物进行PCR扩增，可以对猪非典型瘟病毒进行鉴别，快速、准确。2、一种猪非典型瘟病毒PCR检测试剂盒一种猪非典型瘟病毒检测试剂盒，包括以上所述的猪非典型瘟病毒PCR引物SEQIDNO:1和SEQIDNO:2；还包括一步法RT-PCR试剂(来自市售)：PrimeScript1step酶混合物，2×1step缓冲液，无核酸酶水；3、一种猪非典型瘟病毒PCR检测方法(1)待检样本RNA提取：临床阳性血清样本和2份病料(病料1为淋巴结样本，病料2为肝脏样本，来源于不同的猪只)样本各200μL作为待检样本、200μLDMEM细胞培养基样本作为阴性对照，分别进行以下操作：病料样本加入1mLPBS缓冲液进行充分研磨，-20℃反复冻融3次，8000rpm离心10min，取上清液200μL，用AXYGENAxyPepTMBodyFluidViralDNA/RNAMiniprepkit进行RNA抽提，抽提按照试剂盒说明书进行，最后加40μL的TE进行洗脱，洗脱后的RNA放于-80℃保存。所述阳性血清样本测序结果为：ctcactagtgatgggtgggaaatactaggccctggcaggatcccaaaaatcactaacgtagagtccgctaagatggacctactatctaaactaatgacattcctggggattgaaagttcgagggtccctagaaccccagtccactccactaggaaactactgaagatagtaagaggcatggaaactgggtgggggtacactcatgccggaggaattagtagtgcgaggcatgtcaccggtgagaagaacctaatgacacacatggagggcaggaagggcaagtatatcctgcagtctcaagaacatggtgctgatgaggtggaatatggggtgaagactgaccagaaagcacccgacaatgcattgtgctattgttttaatcctgaagctactaatataaagggagagacaggggccatggtattcatgaagaagatagg。(2)将提取的RNA分别加入到一步法RT-PCR反应体系中于PCR管内进行PCR扩增。其中，一步法RT-PCR反应体系为：(3)将步骤(2)的PCR管置于PCR仪上进行扩增反应。扩增条件为：(4)分别取5μLPCR反应产物在1％(质量比)的琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定。(5)结果判定：如果扩增出的片段大小在439bp左右的为阳性，无条带或条带大小不符的为阴性。电泳图见图4，检测结果见表1。表1待检样本检测结果待检样本扩增结果判定血清样本阳性病料样本1阳性病料样本2阴性DMEM细胞培养基阴性实施例2特异性检验以检测阳性的血清样本RNA作为阳性对照，以无菌蒸馏水为阴性阴性对照，分别按实施例1步骤(2)、(3)扩增，按步骤(4)方法做电泳鉴定，结果如图1所示。以检测阳性的血清样本作为阳性对照，猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒的培养液进行特异性检测，使用实施例1的方法与引物，结果除阳性对照外均没有扩增，阳性病料经过PCR扩增分别在439bp处有条带(见图2)。实施例3灵敏度检验用实施例1中血清样本提取得到的RNA用RNaseFreeH2O做10倍的梯度稀释，RNA含量分别为1.22μg/μL、0.122μg/μL、0.0122μg/μL、1.22ng/μL、0.122ng/μL、0.0122ng/μL作为模板，每个稀释度各取8μL作为模板，按实施例1方法进行检测，观察阳性条带，以出现阳性预期条带所用模板量的最高稀释度计算其敏感性，结果表明最小检出量为0.976ng，即0.122ng/μL梯度。(见图3)。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。<110>广东温氏食品集团股份有限公司<120>一种猪非典型瘟病毒RT-PCR检测特异性引物、试剂盒及检测方法<160>2<170>DNAMAN6.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>1ctcacyagtgatgggtggga20<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>2cctatyttcttcatgaayaccatggc26当前第1页1 2 3