用于检测FOXL2基因编码区的PCR引物及反应体系的制作方法

本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种用于检测FOXL2基因编码区的PCR引物及反应体系。

背景技术：

Sanger法测序-PCR扩增产物，是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。DNA的复制需要：DNA聚合酶，单链DNA模板，带有3'-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP(dATP、dGTP、dTTP和dCTP)。聚合酶用模板作指导，不断地将dNTP加到引物的3'-OH末端，使引物延伸，合成出新的互补DNA链。如果加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，因它在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键。如，存在ddCTP、dCTP和三种其他的dNTP(其中一种为α-32P标记)的情况下，将引物、模板和DNA聚合酶一起保温，即可形成一种全部具有相同的5'-引物端和以ddC残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离制得的放射性自显影区带图谱将为新合成的不同长度的DNA链中C的分布提供准确信息，从而将全部C的位置确定下来。类似的方法，在ddATP、ddGTP和ddTTP存在的条件下，可同时制得分别以ddA、ddG和ddT残基为3‘端结尾的三组长短不一的片段。将制得的四组混合物平行地点加在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。

毛细管电泳技术-VNTR产物，毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。基本机构包括进样系统、毛细管、检测系统、高压电源、清洗系统、温控系统等。它是以高压电场为驱动力,以毛细管为分离通道,依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。在高电压作用下,带电粒子在毛细管内电解质溶液中迁移,迁移速度等于电泳和电渗流(EOF)的矢量和。中性粒子的电泳速度为零,其迁移速度相当于EOF的速度。各种粒子因迁移速度的不同而实现分离。

数目可变串联重复序列(VariableNumberofTandemRepeats，VNTR)又称小卫星DNA(MinisatelliteDNA)，是一种重复DNA小序列，为10到几百核苷酸，拷贝数10一1000不等。VNTR基本原理与RFLP大致相同，只是对限制性内切酶和DNA探针有特殊要求：(1)限制性内切酶的酶切位点必须不在重复序列中，以保证小卫星或微卫星序列的完整性。(2)内切酶在基因组的其他部位有较多酶切位点，则可使卫星序列所在片段含有较少无关序列，通过电泳可充分显示不同长度重复序列片段的多态性。(3)分子杂交所用DNA探针核苷酸序列必须是小卫星序列或微卫星序列，通过分子杂交和放射自显影后，就可一次性检测到众多小卫星或微卫星位点，得到个体特异性的DNA指纹图谱。

FOXL2基因编码区全长共1131bp，属于高GC含量序列，在PCR过程中有一定难度，同时PCR过程中的单链易形成茎环结构。由于FOXL2基因编码区存在基因突变的情况且突变情况复杂，目前已知的突变位点有200余个，对PCR体系及引物都有较高要求。因而需要一套高效准确的引物和反应体系以准确确定FOXL2基因编码区的基因突变位点。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供用于FOXL2基因编码区进行PCR复制和扩增的引物及PCR反应体系和程序，以确定FOXL2基因编码区的基因突变位点。

为实现上述目的，本发明采用的检测策略如图1所示,检测策略概括如下：采集血液样本并提取基因组DNA，对样本进行FOXL2基因编码区VNTR检测①，检测到VNTR突变的样本可确认样本存在FOXL2编码区c.672_701dup30突变，对未检测到VNTR突变的样本进入步骤②，也就是对样本进行FOXL2编码区全长的检测，存在FOXL2编码区大段缺失的样本使用DNAStar软件分析，对于无FOXL2编码区大段缺失的样本进入步骤③，也就是对样本进行FOXL2基因编码区分段检测，未发现点突变的样本在FOXL2编码区无突变，发现FOXL2编码区点突变使用DNAStar软件分析。

用于检测FOXL2基因编码区的PCR引物，所述引物包括用于检测数目可变串联重复序列的VNTR引物，用于检测FOXL2基因编码区全长的扩增引物，用于检测FOXL2基因编码区分段长度的扩增引物。优选地，所述用于检测数目可变串联重复序列的VNTR引物包括：

FOXL2-F4:5'-TGCTTCATCAAGGTGCCG-3'(SEQ ID NO 1)；

FOXL2-R4:5'-GCACAAGCGAACTGCAGG-3'(SEQ ID NO 2)。

优选地，所述用于检测FOXL2基因编码区全长的扩增引物包括：

FOXL2-F3:5'-CGCAGTCTCCAGAAGTTTGA-3'(SEQ ID NO 3)；

FOXL2-R3:5'-GAGGGTGTGAGGTCAGGCT-3'(SEQ ID NO 4)；

优选地，所述用于检测FOXL2基因编码区分段长度的扩增引物包括：

FOXL2-1F 5'-CGCAGTCTCCAGAAGTTTGA-3'(SEQ ID NO 5)；

FOXL2-1R 5'-GCAGGAGGCATAGGGCAT-3'(SEQ ID NO 6)；

或

FOXL2-2F 5'-CATGAAGAGGCCCTTCCG-3'(SEQ ID NO 7)；

FOXL2-2R 5'-GCCCAGAGGGTGTGAGGT-3'(SEQ ID NO 8)。

优选地，所述体系包括用于检测数目可变串联重复序列的PCR体系，用于检测FOXL2基因编码区全长的PCR体系，用于检测FOXL2基因编码区分段长度的PCR体系。

优选地，所述用于检测数目可变串联重复序列的PCR体系以15μL计为：

10×Buffer I，1.5μL；2.5mM dNTP，1.2μL；5μM荧光引物，0.8μL；TAKARA HS Taq酶，0.1μL；DNA,1.2μL；ddH₂O，9.2μL，总反应体系为15μL。

优选地，用于检测FOXL2基因编码区全长的PCR体系以20μL计为：

10×Buffer I，2μL；2.5mM dNTP，1.6μL；5μM引物FOXL2-F3，0.6μL；5μM引物FOXL2-R3，0.6μL；Taq Hot Start酶(5U/μL)，0.2μL；DNA,2.0μL；ddH₂O，补齐至20μL；总反应体系为20μL。

优选地，用于检测FOXL2基因编码区分段长度的PCR体系以50μL计为：

DNA模板，1μL；引物FOXL2-1F，1μL；引物FOXL2-1R，1μL；10mM dNTP，1μL；Taq Buffer，5μL；25mM MgCl₂，5μL；Taq酶(5U/μL)，0.5μL；水，35.5μL；

或

DNA模板，1μL；引物FOXL2-2F，1μL；引物FOXL2-2R，1μL；10mM dNTP，1μL；Taq Buffer，5μL；25mM MgCl₂，5μL；Taq酶(5U/μL)，0.5μL；水，35.5μL。

优选地，检测数目可变串联重复序列的PCR体系的PCR反应条件为：

95℃，5min，1个循环；95℃，30s，60℃，30s，72℃，30s，40个循环；最后72℃延伸12min，1个循环,16℃保存。

优选地，检测FOXL2基因编码区全长的PCR体系的PCR反应条件为：

95℃，5min，1个循环；95℃，30s，60℃，30s，72℃，30s，40个循环；最后72℃延伸12min，1个循环,16℃保存。

优选地，检测FOXL2基因编码区分段长度的PCR体系的PCR反应条件为：

95℃预变性5min；94℃变性30s；55-60℃退火35s；72℃延伸40-50s；72℃修复延伸5-8min；35个循环。

本发明的有益效果如下：

通过建立FOXL2基因编码区检测的检测策略及检测体系，可以快速检测到FOXL2基因编码区的重复序列，同时避免被测DNA在检测中形成二级结构影响测序的准确性。本发明的检测策略不仅节约检测成本，同时提高了检测准确性，缩短检测时间。通过反复实践，摸索到FOXL2基因编码区的检测反应条件，在科研或临床应用中，能得到相近的检测成功率及准确率，节约了宝贵的科研经费。

附图说明

图1为本发明方法检测策略流程示意图；

图2为实施例1中S1样本VNTR检测结果图；

图3为用GeneMapper V3.5软件观看到的实施例1中S1样本VNTR检测结果；

图4为实施例1中S2样本检测到FOXL2编码区大片段缺失的结果图；

图5a为实施例1中S3样本检测到FOXL2编码区点突变的结果图；

图5b为实施例1中S4样本检测到FOXL2编码区点突变的结果图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

FOXL2基因编码区全长共1131bp，属于高GC含量序列，在PCR过程中有一定难度，同时PCR过程中的单链易形成茎环结构，本发明的发明人发现，运用有效的PCR检测策略及检测体系和合适的引物，可以高效的确定FOXL2基因编码区的基因突变位点。

检测策略为先用VNTR引物进行数目可变串联重复序列的检测①，如果没有发现有重复序列，则进行FOXL2基因编码区全长的检测②，如果FOXL2编码区无大片段缺失，则进行FOXL2基因编码区分段长度的检测③。

①对FOXL2基因编码区进行VNTR检测：

用于VNTR检测的引物序列如下：

FOXL2-F4:5'-TGCTTCATCAAGGTGCCG-3'(SEQ ID NO 1)；

FOXL2-R4:5'-GCACAAGCGAACTGCAGG-3'(SEQ ID NO 2)。

通常情况下，PCR扩增后的产物长度为713bp。

进行VNTR检测的体系如表1所示，反应程序如表2所示。

PCR体系(15μL体系)：

表1

PCR反应程序

表2

②当FOXL2基因编码区进行VNTR检测后，没有检测出重复序列，则对FOXL2基因编码区的全长进行检测；

用于检测FOXL2基因编码区全长的扩增引物序列如下：

FOXL2-F3:5'-CGCAGTCTCCAGAAGTTTGA-3'(SEQ ID NO 3)；

FOXL2-R3:5'-GAGGGTGTGAGGTCAGGCT-3'(SEQ ID NO 4)；

通常情况下，PCR扩增后的长度为1355bp。

对FOXL2基因编码区全长进行PCR扩增的体系情况如表3所示，PCR反应程序如表4所示。

PCR体系(20μL体系)：

表3

PCR反应程序：

表4

③当FOXL2基因编码区未发现VNTR及大片段缺失后，则对FOXL2基因编码区进行分段长度检测；

用于检测FOXL2基因编码区分段长度的扩增引物包括：

FOXL2-1F 5'-CGCAGTCTCCAGAAGTTTGA-3'(SEQ ID NO 5)；

FOXL2-1R 5'-GCAGGAGGCATAGGGCAT-3'(SEQ ID NO 6)；

通常情况下，PCR扩增后的产物长度为773bp；

或

FOXL2-2F 5'-CATGAAGAGGCCCTTCCG-3'(SEQ ID NO 7)；

FOXL2-2R 5'-GCCCAGAGGGTGTGAGGT-3'(SEQ ID NO 8)。

通常情况下，PCR扩增后的产物长度为798bp。

对FOXL2基因编码区分段长度进行PCR扩增的体系情况如表5所示，PCR反应程序如表6所示。

PCR体系(50μL体系)：

表5

PCR反应程序：

表6

实施例1

现选取4例在FOXL2编码区存在基因突变的例子(S1、S2、S3、S4)，具体阐述检测过程如下：

将S1、S2、S3、S4样本进行①数目可变串联重复序列检测：

用于VNTR检测的引物序列如下：

FOXL2-F4:5'-TGCTTCATCAAGGTGCCG-3'(SEQ ID NO 1)；

FOXL2-R4:5'-GCACAAGCGAACTGCAGG-3'(SEQ ID NO 2)。

PCR扩增后的产物长度为713bp。

PCR体系以15μL计为：

10×Buffer I，1.5μL；2.5mM dNTP，1.2μL；5μM荧光引物，0.8μL；TAKARA HS Taq酶，0.1μL；DNA,1.2μL；ddH₂O，9.2μL，总反应体系为15μL。

PCR反应程序：

95℃，5min，1个循环；95℃，30s，60℃，30s，72℃，30s，40个循环；最后72℃延伸12min，1个循环,16℃保存。

由步骤①所得结果发现S1存在VNTR(即存在FOXL2编码区c.672_701dup30突变)，S2、S3、S4样本未发现此突变，此三个样本进入②对FOXL2基因编码区的全长进行检测。

②检测FOXL2基因编码区全长：

扩增引物序列如下：

FOXL2-F3:5'-CGCAGTCTCCAGAAGTTTGA-3'(SEQ ID NO 3)；

FOXL2-R3:5'-GAGGGTGTGAGGTCAGGCT-3'(SEQ ID NO 4)；

PCR扩增后的长度为1355bp。

PCR体系以20μL计为：

10×Buffer I，2μL；2.5mM dNTP，1.6μL；5μM引物FOXL2-F3，0.6μL；5μM引物FOXL2-R3，0.6μL；Taq Hot Start酶(5U/μL)，0.2μL；DNA,2.0μL；ddH₂O，补齐至20μL；总反应体系为20μL。

PCR反应程序：

95℃，5min，1个循环；95℃，30s，60℃，30s，72℃，30s，40个循环；最后72℃延伸12min，1个循环,16℃保存。

由步骤②检测发现S2样本存在FOXL2编码区大片段缺失(即c.17_93del),S3、S4样本未发现编码区大片段缺失，此两样本进入③FOXL2基因编码区进行分段长度检测。

③检测FOXL2基因编码区分段长度：

扩增引物序列如下：

FOXL2-1F 5'-CGCAGTCTCCAGAAGTTTGA-3'(SEQ ID NO 5)；

FOXL2-1R 5'-GCAGGAGGCATAGGGCAT-3'(SEQ ID NO 6)；

PCR扩增后的产物长度为773bp；

PCR体系以50μL计为：

DNA模板，1μL；引物FOXL2-1F，1μL；引物FOXL2-1R，1μL；10mM dNTP，1μL；Taq Buffer，5μL；25mM MgCl₂，5μL；Taq酶(5U/μL)，0.5μL；水，35.5μL；

PCR反应程序：

95℃预变性5min；94℃变性30s；55-60℃退火35s；72℃延伸40-50s；72℃修复延伸5-8min；35个循环。

和

扩增引物序列如下：

FOXL2-2F 5'-CATGAAGAGGCCCTTCCG-3'(SEQ ID NO 7)；

FOXL2-2R 5'-GCCCAGAGGGTGTGAGGT-3'(SEQ ID NO 8)；

PCR扩增后的产物长度为798bp；

PCR体系以50μL计为：

DNA模板，1μL；引物FOXL2-2F，1μL；引物FOXL2-2R，1μL；10mM dNTP，1μL；Taq Buffer，5μL；25mM MgCl₂，5μL；Taq酶(5U/μL)，0.5μL；水，35.5μL。

PCR反应程序：

95℃预变性5min；94℃变性30s；55-60℃退火35s；72℃延伸40-50s；72℃修复延伸5-8min；35个循环。

由步骤③发现S3、S4样存在FOXL2编码区点突变(即c.907C>T及c.931C>T)，检测流程结束。由于测序所得序列篇幅较长无法完全呈现于此，我们现展示S1、S2、S3、S4样本检测的突变位点的信息，结果如下：

S1样本VNTR检测结果：

由Chromas软件可见检测到的VNTR结果如图2所示：

如图3所示，由GeneMapper V3.5软件可直观看到箭头所示的VNTR结果。

S2样本检测到FOXL2编码区大片段缺失(即c.17_93del)结果如图4所示；图中采用Chromas软件显示结果，箭头所示上半部分为S2样本缺失的检测结果，下图为FOXL2编码区不存在突变的相同位置的检测结果。

S3、S4样本检测到FOXL2编码区点突变(即c.907C>T及c.931C>T)，的结果如图5a和5b所示，图5a为S3检测结果，图5b为S4检测结果；图5a和图5b中，图中上部分箭头所示为样本突变点，下部分箭头所示为该位点不存在突变的该位点信息。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

<110> 中国医学科学院整形外科医院

<120> 用于检测FOXL2基因编码区的PCR引物及反应体系

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

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tgcttcatca aggtgccg 18

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gcacaagcga actgcagg 18

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<212> DNA

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cgcagtctcc agaagtttga 20

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<212> DNA

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gagggtgtga ggtcaggct 19

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<212> DNA

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cgcagtctcc agaagtttga 20

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<212> DNA

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gcaggaggca tagggcat 18

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<212> DNA

<213> 人工序列

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catgaagagg cccttccg 18

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gcccagaggg tgtgaggt 18