MED6基因作为急性心肌梗死风险预测标记物中的用途的制作方法

本发明提供一种预测和诊疗急性心肌梗死的标记物，进一步讲是提供了MED6基因作为标记物表达产物和生物制剂在制备急性心肌梗死预测和诊疗药物中用途，属于基因诊断和生物医药领域。

背景技术：
：

冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称，冠心病CAD）是危害人类健康最常见的心血管疾病。尽管通过生活方式的改善，对高脂血症、高血压、糖尿病、代谢综合征、吸烟等主要危险因素的控制，冠心病的死亡率总体呈现下降趋势。但伴随着人口的增长和老龄化，预计到2030年冠心病仍将会是全球范围内巨大的健康和经济负担。因此，临床上需要有效的风险预测方法，对高危人群给予有效识别，从而更早的干预，来降低急性心血管事件的发生，改善病人预后。

冠心病的发生和发展是在遗传因素和环境因素基础上，多重危险因素共同作用的结果。近年来随着遗传学技术的进步，基因表达分析被广泛应用于疾病的研究。基于外周血的冠心病差异基因表达分析为冠心病的早期预防、诊断和治疗提供了新的视角。基因表达分析不仅有助于探索冠心病的复杂性，并且可以充分提供每个个体的遗传风险信息，从而实现对高危人群的早期预防。

外周血基因转录水平表达的变化可以在疾病过程中反应病人病理和生理状况的变化。然而，对于基因表达的调控是一个非常复杂的过程，转录调控的改变与许多疾病的发病相关。中介体复合物（MED）在真核生物的转录过程中起到至关重要的作用。尽管近期许多研究表明MED的结构和/或功能的改变与许多疾病相关，但主要研究领域为癌症和神经系统疾病等。MED6基因编码的中介体复合物亚基6蛋白是MED的重要组成部分，参与几乎所有的RNA聚合酶Ⅱ相关基因的转录调节，在现有研究中未见对MED6与心肌梗死的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种急性心肌梗死风险预测和诊断制剂，所述急性心肌梗死风险预测和诊断制剂检测MED6基因和或基因的表达产物。进一步的，所述的MED6基因和或基因的表达产物在急性心肌梗死外周血中低表达。进一步的，所述的MED6基因和或基因的表达产物的表达水平荧光定量检测方法。

本发明的目的在于所述急性心肌梗死风险预测和诊断制剂检测MED6基因和或基因的表达产物进一步的，采用荧光定量试剂盒、基因芯片、酶联免疫、抗体杂交方法外周血中基因的表达检测方法和相关的生物制剂。

本发明的目的在于所述急性心肌梗死风险预测和诊断制剂检测MED6基因和或基因的表达产物进一步的，包含本MED6基因和或表达产物用于急性心肌梗死风险预测和诊断的生物制剂。

本发明中荧光定量PCR检测中使用的引物对P，其序列如下：

上游引物序列：5’TGCAGAGGCTAACATTAGAACAC 3’；

下游引物序列：5’GCTGTTGCTTCCGAATGATGA 3’。

本发明中荧光定量PCR检测体系及反应条件：

荧光定量PCR反应体系：20ul反应体系，每个反应包括:10ul SYBR Premix Ex Taq TM，上、下游引物各0.5ul(浓度为10umol/L)，无核酸酶的双蒸水8ul，cDNA模板1ul。权利要求3中所述的荧光定量PCR反应条件：应用实时荧光定量PCR系统扩增。反应条件为95℃预变性10分钟；40个循环：95℃变性15秒, 60℃退火20秒, 72℃ 20延伸秒；溶解曲线和扩增曲线 95℃ 1 分钟，55℃ 30秒, 95℃ 30秒。以GAPDH基因为内参基因，所有样本至少重复测量三次，结果取均值。

本发明进行的外周血急性心肌梗死差异基因表达谱分析结果显示：在急性心肌梗死病人的外周血白细胞中存在着大量差异表达的基因。其中，MED6基因在急性心肌梗死病人外周血中呈现显著低表达。在发明人前期研究成果的基础之上，通过扩大样本量，来进一步验证MED6基因在急性心肌梗死发病过程中的差异表达，并利用RNA干扰降低大鼠心肌细胞中MED6表达水平，进一步分析MED6基因对表达水平与急性心肌梗死发病的作用机制。

本发明的积极效果在于：

提供了以MED6基因和或基因的表达产物一种新的急性心肌梗死风险预测和诊断治疗靶点，利用MED6基因及其表达产物制备急性心肌梗死风险预测标记物和诊断制剂，具有重要的临床应用意义和开发价值。

附图说明

图1为MED6基因RT-PCR扩增目的片段电泳图及MED6基因mRNA相对表达量，A为MED6基因RT-PCR扩增目的片段电泳图，其中，泳道1是DL500 DNA ladder marker，泳道2、3、4是RT-PCR产物；B为MED6基因mRNA相对表达量，其中**代表P<0.01，CAD代表冠心病组，Control代表对照组；

图2 为MED6基因相对表达量的ROC曲线；

图3为大鼠心肌细胞干扰后MED6基因相对表达量，A是大鼠心肌细胞干扰后MED6基因mRNA相对表达量，其中**代表P<0.01；B是大鼠心肌细胞干扰后MED6蛋白表达水平Western Blot检测结果，其中**代表P<0.01，样本编号为1、2为干扰组，样本编号为3、4为阴性对照组；

图4为大鼠心肌细胞MED6干扰后各时间点细胞培养基中甘油三酯浓度随转染时间变化趋势。

具体实施方式

结合实例具体实例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解，在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型。

本发明主要采用荧光定量PCR筛选出急性心肌梗死相关基因，结合分子生物学实验和临床病例关联分析，另一方面，采用RNA干扰技术降低基因表达水平，进一步验证基因的生物学功能，证实了MED6是急性心肌梗死诊治标志物。

病例的收集

依据2012年公布的心肌梗死全球统一定义。选取2014年11月-2016年7月于吉林大学中日联谊医院心血管内科住院治疗，明确诊断为急性心肌梗死的病人106例为急性心肌梗死组。非冠状动脉粥样硬化性心脏病者105例为对照组。并根据冠状动脉造影结果，按照Gensini评分系统对研究对象的冠状动脉血管病变严重程度进行评分，分值越高病变越严重。

通过以下试验表明本发明医疗效果

一、本发明医疗效果的排除标准：

1.因经皮冠状动脉介入治疗（PCI）或冠状动脉旁路移植术（CABG）引发的心肌梗死。

2.继发于供需失衡相关的心肌损伤：如冠脉内皮功能障碍无明显冠脉疾病、冠脉痉挛、冠脉栓塞、快速／缓慢型心律失常、严重贫血、重症呼吸衰竭、主动脉夹层或严重主动脉瓣疾病、肥厚型心肌病等。

3.非心肌缺血相关的心肌损伤：心脏挫伤、手术、消融、起搏、或除颤仪除颤、伴心脏受累的横纹肌溶解症、心肌炎、心脏毒性药物等。

4.多因素或不确定的心肌损伤：严重心力衰竭、应激性心肌病、严重肺栓塞或肺动脉高压、败血症和危重病人、肾功能衰竭、严重的急性神经系统疾病，如卒中、蛛网膜下腔出血等。

5.合并有严重感染性疾病、恶性肿瘤。

6.正在患有的、慢性的或复发性的传染性疾病史。

7.（活动性或潜伏性）结核感染史或证据。

8.患有免疫系统疾病和（或）正在服用激素。怀疑或证实处于免疫缺陷状态的患者。

9.临床资料或者冠脉造影资料不全者。

详细记录临床资料，包括：用药史、血脂水平、空腹血糖水平、静息血压、体质指数（BMI）、冠状动脉造影资料、冠心病家族史、吸烟史，以及合并其它临床疾病情况（如高血压、糖尿病）等。

二、急性心肌梗死患者组及对照组外周血中MED6基因表达情况：

1．外周血采集、总RNA提取及cDNA合成

留取各研究对象晨起空腹外周血4ml，加入EDTA抗凝管中，并于4℃保存，在样本采集2小时内进行后续总RNA提取实验。利用血液总RNA提取试剂盒（RNAsimple Total RNA Kit,天根生化科技有限公司，北京），依据试剂盒说明书对已获取的外周血进行总RNA提取，并利用1.5%琼脂糖电泳及分光光度计（Nanodrop 2000）对RNA的质量及浓度进行检测。选取RNA电泳显示28s、18s和5s条带清晰，且28s rRNA条带亮度约为18s rRNA的两倍，OD260/OD280比值为1.8-2.2的为合格样本进行后续实验。利用反转录试剂盒（TOYOBO Rever Tra Ace qPRC RT kit，上海），取总量为1ug已获取的总RNA进行反转录，得到cDNA样品保存于-20℃以便下一步进行实时荧光定量PCR。

2实时荧光定量PCR检测

将得到的cDNA样本稀释10倍后，利用SYBR荧光定量试剂盒（SYBR Premix Ex Taq TM，TaKaRa，大连）进行PCR扩增。采用20ul反应体系，每个反应包括：10ul SYBR Premix Ex Taq TM，上、下游引物各0.5ul（浓度为10umol/L），无核酸酶的双蒸水8ul，cDNA模板1ul。应用Mx3005P实时荧光定量PCR系统（Strata Gene）扩增。反应条件为95℃10分钟；40个循环：95℃ 15秒，60℃ 20秒，72℃ 20秒；95℃ 1 分钟，55℃ 30秒，95℃ 30秒。以GAPDH基因为内参基因，所有样本至少三个重复。每个样本所得循环阈值（Ct）以相对表达量2^-△Ct表示（△Ct=目的基因Ct-内参基因Ct）。冠心病组对于对照组的相对表达量以2^-△△Ct法进行统计分析。收集实时荧光定量PCR产物，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。所用PCR引物根据NCBI网站提供的基因序列，应用Primer Premier 6设计，并由上海生工生物技术有限公司合成，序列如下：

MED6

上游引物 5’-TGCAGAGGCTAACATTAGAACAC -3’

下游引物 5’- GCTGTTGCTTCCGAATGATGA-3’

GAPDH

上游引物 5’-ACGGATTTGGTCGTATTGGGCG-3’

下游引物 5’-CTCCTGGAAGATGGTGATGG-3’

三、MED6基因相对表达量与急性心肌梗死患者血脂，血糖等性状的相关性分析

1．统计学分析

数据使用SPSS 22.0软件进行统计学分析，计量资料服从正态分布的采用±S进行统计描述，组间差异比较采用独立T检验分析，不服从正态分布的采用四分位数间距进行统计描述，组间差异比较采用秩和检验；计数资料采用频数进行统计描述，组间差异采用卡方检验分析；急性心肌梗死相关危险因素采用二元Logistic回归分析；MED6基因相对表达量与心肌肌钙蛋白1和Gensini评分的相关性采用双变量相关分析。统计结果以双侧P<0.05认为有统计学差异。

四、shRNA干扰载体的构建及转染

1. MED6基因干扰载体的构建

根据NCBI网站公布的大鼠心肌细胞MED6基因序列设计特异性干扰载体。干扰载体（pGPU6/GFP/Neo-Med6-Rat-siRNA）由上海吉玛生物公司合成，靶序列为GTGGTAGTGTCCTGGATTACT。实验中以绿色荧光蛋白（GFP）标记的空载体（pGPU6/GFP/Neo-shNC）作为阴性对照。

2. 大鼠心肌细胞培养及细胞转染

实验用大鼠心肌细胞（Rat myocardial cell line, H9C2）购自上海复祥生物科技有限公司。于37℃ 5%CO₂培养箱中培养，培养基为达尔伯克必需基本培养基（Dulbecco’s minimum essential medium, DMEM/F12），并加入10%体积的胎牛血清及青-链霉素双抗100U/mL。转染前一天，将细胞接种于6孔板中，每孔细胞数约2×10⁵/mL。于不含有双抗的培养基中37℃ 5% CO₂培养至80%融合时进行转染。转染试剂采用FuGENE HD Transfection Reagent（Roche）。将待转染细胞分为干扰组（pGPU6/GFP/Neo-Med6-Rat-siRNA）和阴性对照组（pGPU6/GFP/Neo-shNC）分别进行转染。每组转染两个孔，并于转染前、转染后12小时、转染后24小时、转染后36小时、转染后48小时分别留取培养基上清于-80℃保存，以备后续实验用。

五、MED6表达水平及细胞培养基TG含量的检测与分析

1. 大鼠心肌细胞RNA及总蛋白的提取和检测

转染后48小时后，分别对干扰组和阴性对照组其中一个孔的H9C2细胞用Trizol法进行RNA提取。取总量为1ug已获取的总RNA进行反转录，得到cDNA样品稀释10倍后用于实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测。RT-qPCR反应的引物序列、反应体系及反应条件同外周血RNA的RT-qPCR检测。另一个孔的H9C2细胞利用RIPA裂解液（Beyotime，上海）进行总蛋白提取。BCA法利用分光光度计（Nanodrop 2000）对其进行浓度检测。使用经典的Western Blot方法进行检测，β-actin为内参基因。将得到的总蛋白样本取30ug进行SDS-PAGE凝胶电泳，后采用10V恒压，半干转（BIO-RAD）转膜10分钟。转膜后，将膜采用封闭缓冲液（TBS/0.1% Tween-20中加入5%脱脂奶粉）室温封闭1小时，进而用一抗4℃孵育过夜。一抗分别为：MED6多克隆抗体（按1:1000，封闭缓冲液稀释），β-actin多克隆抗体（按1:1000，封闭缓冲液稀释）。一抗孵育完毕后，将膜于二抗（羊抗兔IgG抗体1:5000稀释）中4℃孵育1小时。所有抗体均购自美国Abcam公司（ab84968；ab8227）。应用全自动化学发光图像分析仪（Tanon-5200）显影分析。

2. 转染后培养基上清中甘油三酯的检测

采用Elisa法分别对干扰组和阴性对照组转染前、转染后12小时、转染后24小时、转染后36小时和转染后48小时留取的培养基上清进行甘油三酯（TG）浓度的检测。所用的Elisa试剂盒购自长春百金生物科技有限公司，并根据试剂盒要求设置标准品孔、空白对照孔和待测样品孔，每个样本均设置至少3个复孔。采用酶标仪（上海精密仪器仪表有限公司）分别检测每孔的光密度值（OD值），根据标准品孔绘制标准曲线，读取待测样本所检测指标的浓度。

实验结果

1. 研究对象临床资料分析

研究对象的临床资料分析结果表明：在年龄、性别、BMI、高血压病史、吸烟史、收缩压、舒张压及总胆固醇（TC）等方面，两组未见明显统计学差异。而与对照组相比，冠心病组合并糖尿病情况及空腹血糖水平明显高于对照组；冠心病家族史比例明显高于对照组；血甘油三酯水平（TG）和低密度脂蛋白胆固醇水平（LDL-C）明显高于对照组；相反，高密度脂蛋白胆固醇水平（HDL-C）明显低于对照组，差别均有统计学意义。详见表1。

2. 外周血实时荧光定量PCR检测结果分析

外周血RNA实时荧光定量PCR检测结果显示，MED6基因溶解曲线呈现单一的溶解峰，扩增产物特异性较高。扩增曲线为显著的“S型”。收集扩增产物，取10ul用于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，结果如图1。电泳结果显示，PCR扩增产物呈现单一明亮条带，片段大小约102bp，与预期片段大小相一致。说明PCR扩增反应成功，产物特异性较好。RT-qPCR所得每个样本的ΔCt值均为单个样品重复3次所得均值。冠心病组2^-△Ct为0.013±0.012，对照组2^-△Ct为0.036±0.034，两组差别有显著统计学差异（t =-6.45，P=0.00）。MED6基因的相对表达量统计采用2-ΔΔCt方法。结果显示，在mRNA水平冠心病组外周血中MED6基因表达明显低于对照组，其相对表达量为0.37±0.36倍，见图2。

3. 采用Logistic回归分析MED6基因相对表达量及其它因素与冠心病的关系

为进一步分析MED6基因表达量降低是否为冠心病的危险因素，按MED6基因的相对表达量中位数将本研究纳入的211例研究对象分为MED6基因低表达组（2^-△Ct≤0.013）和高表达组（2^-△Ct＞0.013）。采用逐步Logistic回归分析MED6基因相对表达量的高低、年龄、性别、BMI、冠心病家族史、吸烟史、高血压、糖尿病、空腹血糖及血脂等因素与冠心病的相关性。结果显示：本研究资料中MED6基因高表达患冠心病的风险为低表达的0.15倍。MED6基因的低表达、糖尿病、LDL-C增高和HDL-C降低均是冠心病的独立危险因素，详见表2。

4. 双变量相关分析MED6基因的相对表达量与血糖、血脂等生化指标的相关性

对所有研究对象的血糖、血脂等生化指标检测结果与MED6基因的相对表达量进行双变量相关分析，结果显示：MED6基因的相对表达量与血糖、TC、LDL-C、HDL-C均无明显相关性，但与TG水平呈明显的负相关（rs=-0.41，P=0.00）。

5. MED6基因相对表达量与冠状动脉病变严重程度的相关性

根据冠状动脉造影结果，按照Gensini评分系统对冠心病组研究对象的冠状动脉病变严重程度进行评估。冠心病组Gensini评分结果为46.55±37.58，分值越高代表冠状动脉狭窄越重。对MED6基因的相对表达量和Gensini分值进行双变量相关分析，结果显示：MED6基因的相对表达量与Gensini分值呈显著负相关（rs=-0.65，P=0.00）。即，MED6基因的表达量越低，冠状动脉粥样硬化病变越重。

6. MED6基因相对表达量在冠心病诊断中的ROC曲线和cutoff值

根据冠心病组和对照组各样本实时荧光定量PCR所得MED6相对表达量的2-△Ct值绘制ROC曲线，见图3。从图3可知MED6基因的相对表达量对冠心病的发病有较好的诊断准确性，曲线下面积（AUC）为0.79±0.03（P=0.00）。以约登指数最大值确定的MED6基因相对表达量cutoff值为0.014。敏感度为76.40%，特异性为71.43%。阳性预测值为72.97%，阴性预测值为75.00%。

7. 大鼠心肌细胞转染后RT-qPCR结果分析

转染细胞荧光定量PCR检测结果显示，MED6基因溶解曲线呈现单一的溶解峰，扩增产物特异性较高。扩增曲线为显著的“S型”。扩增片段大小约102bp。RT-qPCR所得每个样本的ΔCT值均为单个样品重复3次所得均值。结果显示，干扰组2^-△CT为0.04±0.01，阴性对照组2^-△CT为0.11±0.01，两组差别有显著统计学差异（t=-9.44，P=0.00）。干扰组MED6基因相对于阴性对照组表达量采用2^-△△CT法进行统计。结果显示：在RNA水平干扰组MED6基因表达量表达明显低于阴性对照组，其相对表达量为0.33±0.07（P=0.00），见图4。达到预期的干扰效率。

8. 大鼠心肌细胞转染后Western Blot结果分析

本研究中以β-actin为内参基因，对转染后的大鼠心肌细胞进行蛋白水平的检测。Western Blot结果显示：干扰组与阴性对照组在β-actin蛋白表达上无明显差异，在MED6基因的表达上差异显著。干扰组MED6蛋白的表达为阴性对照组的0.32±0.02倍；此结果表明MED6干扰载体成功的干扰了大鼠心肌细胞MED6蛋白的表达。

9. 培养基上清中甘油三酯浓度Elisa检测

转染过程中分别留取干扰组和阴性对照组转染前、转染后12小时、转染后24小时、转染后36小时和转染后48小时的培养基上清进行TG浓度的检测。并按照时间顺序绘制成浓度变化曲线。比较结果显示：转染前两组间TG浓度无明显差别（t=0.19，P=0.86），随着转染时间的延长，干扰组TG浓度于转染后12小时呈明显增高趋势，后略呈下降趋势，但与阴性对照组相比，仍明显高于阴性对照组（F=3.73，P=0.04）；而阴性对照组TG浓度随时间的变化差别无统计学意义（F=0.59，P=0.67）。

总结：MED6基因在冠心病病人外周血中表达显著降低，MED6基因表达量降低是冠心病的独立危险因素，表达量越低，冠状动脉狭窄性病变可能越严重，细胞水平验证提示MED6基因对TG代谢的调节可能是其促进冠心病发病的机制之一，外周血中MED6基因的低表达可能作为冠心病早期预警的重要遗传学参考指标。

附表说明

表1为冠心病组与对照组临床资料比较[(±S)/n(%)]

表2为冠心病独立危险因素Logistic回归分析结果

SEQUENCE LISTING

<110> 吉林大学

<120> MED6基因作为急性心肌梗死风险预测标记物中的用途

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 102

<212> mRNA

<213> 人（Homo）

<400> 1

tgcagaggct aacattagaa cacttgaatc agatggttgg aatcgagtac atccttttgc 60

atgctcaaga gcccattctt ttcatcattc ggaagcaaca gc 102

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aagtggaatc tcaaactgag cc 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gatgcgaagt aaactgccga t 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acggatttgg tcgtattggg cg 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctcctggaag atggtgatgg 20