一组用于检测牛白血病病毒的引物及试剂盒的制作方法

本发明涉及牛白血病病毒检测技术领域，尤其涉及一组用于检测牛白血病病毒的引物及试剂盒。

背景技术：

牛白血病是由牛白血病病毒引起的牛的一种慢性肿瘤性疾病。病的特征为淋巴样细胞恶性增生、进行性恶病质和全身淋巴结肿大，病死率高。目前用于牛白血病病毒检测的技术有电镜检测、血清学检测、分子生物学检测等。

但电镜检测操作繁琐，需要固定、脱干、垫入、分割和染色等一系列步骤，耗时相对较长。同时由于微生物种类繁多，有一定的主观性，对于操作人员要求较高，并且需要特殊仪器，不易在基层和大规模的检测。

血清学检测方法抗原上必须存在与所用抗体结合的抗原决定簇，使抗原抗体能够产生特异性的结合反应。基因突变，核苷酸相位改变等因素会导致某些位点的不表达或者结合位点的阻断，影响抗体与抗原的结合，造成假阴性结果。抗原抗体结合遵循一定的量比关系，只有当二者浓度比例适当时才出现可见反应，并且会受外界因素影响。操作过程中对样品要求较高，需要及时分离血清，溶血也会对结果造成不利影响。血清学实验的假阳性和假阴性是不能完全避免的，灵敏度并不高并且检测耗时长、操作复杂。

PCR是目前在病原检测中最常用的方法。但普通PCR和巢式PCR都需要结合琼脂糖凝胶电泳试验进行结果的判定，操作较为繁琐且耗时较长，无法达到快速检测的效果。实时荧光定量PCR对仪器要求较高，无法大规模的推广。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一组用于检测牛白血病病毒的引物及试剂盒。本发明提供的检测牛白血病病毒的引物及试剂盒能够实现牛白血病病毒的高特异性、高灵敏度检测，操作简单、结果肉眼可测。

本发明提供了一组用于检测牛白血病病毒的引物，包括外引物对、内引物对和环引物对；所述外引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述内引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述环引物对的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

本发明还提供了一种基于上述技术方案所述引物的试剂盒，包括：8000U/mLBst 2.0DNA聚合酶；5×Buffer；10mM dNTPs；上述技术方案所述引物；钙黄绿素荧光显色剂；牛白血病病毒阳性DNA模板；

所述5×Buffer包括：100mM且pH值为8.8的Tris-HCl、250mM的氯化钾、50mM的硫酸铵、40mM的硫酸镁和体积百分浓度为0.1％的吐温-20；

所述钙黄绿素荧光显色剂包括钙黄绿素和锰离子。

优选的是，100次规格的试剂盒包括2mL 5×Buffer，1.2mL上述技术方案所述引物；0.4mLBst 2.0DNA聚合酶，1.4mL 10mM dNTPs，0.4mL钙黄绿素荧光显色剂、0.4mL牛白血病病毒阳性DNA模板。

本发明提供了一组用于检测牛白血病病毒的引物。本发明提供的检测牛白血病病毒的引物能与牛白血病病毒保守区域的不同部位结合，特异性高，单个反应可扩增10个拷贝的牛白血病病毒。本发明的引物结合试剂盒应用在环介导恒温扩增反应中能够实现牛白血病病毒的高特异性、高灵敏度检测，操作简单、结果肉眼可测。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的LAMP方法特异性检测结果图；

图2为本发明实施例1提供的LAMP方法灵敏度验证电泳结果图；

图3为本发明实施例1提供的显色反应检测结果图；

图4为本发明对照例1提供的LAMP方法与常规实时荧光定量PCR方法敏感性对比结果图。

具体实施方式

本发明提供了一组用于检测牛白血病病毒的引物，包括外引物对、内引物对和环引物对；所述外引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述内引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述环引物对的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

在本发明中，所述外引物对(F3和B3)、内引物对(FIP和BIP)和环引物对(LF和LB)的组合能够缩短环介导恒温扩增(LAMP,Loop-mediated isothermal amplification)反应时间，提高扩增效率。在具体应用中，所述外引物、内引物和环引物的反应终浓度优选分别为0.2μM、1.6μM和0.8μM。本发明对所述引物的制备方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的生物公司对引物进行人工合成即可。

本发明还提供了一种基于上述技术方案所述引物的试剂盒，包括：8000U/mLBst 2.0DNA聚合酶；5×Buffer；10mM dNTPs；上述技术方案所述引物；钙黄绿素荧光显色剂；牛白血病病毒阳性DNA模板；

所述5×Buffer包括：100mM且pH值为8.8的Tris-HCl、250mM的氯化钾、50mM的硫酸铵、40mM的硫酸镁和体积百分浓度为0.1％的吐温-20。

本发明对所述Bst 2.0DNA聚合酶、dNTPs、钙黄绿素荧光显色剂的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的Bst 2.0DNA聚合酶、dNTPs和钙黄绿素荧光显色剂常规市售产品即可。在本发明中，所述钙黄绿素荧光显色剂包括钙黄绿素和锰离子；本发明对钙黄绿素和锰离子的摩尔比没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的钙黄绿素和锰离子的摩尔比即可，如1：(10～12)。本发明对所述牛白血病病毒阳性DNA模板的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的牛白血病阳性病毒市售产品即可。在本发明中，所述牛白血病病毒阳性DNA模板优选采用全核酸提取试剂盒从牛白血病阳性病毒中提取，所述全核酸提取试剂盒优选采用美国Roche公司的High-Pure PCRTemplate PreparationKit。

在本发明中，所述5×Buffer包括：100mM且pH值为8.8的Tris-HCl、250mM的氯化钾、50mM的硫酸铵、40mM的硫酸镁和体积百分浓度为0.1％的吐温-20。本发明对所述Tris、氯化钾、硫酸铵、硫酸镁和吐温-20的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的Tris、氯化钾、硫酸铵、硫酸镁和吐温-20的市售产品即可。在本发明中，用于溶液配制的水均选用无菌双蒸水。

本发明对所述试剂盒的规格没有特殊的限定，所述试剂盒的使用次数包括10次、50次、100次或200次。100次规格的试剂盒包括2mL 5×Buffer，1.2mL上述技术方案所述引物；0.4mL Bst 2.0DNA聚合酶，1.4mL 10mM dNTPs，0.4mL钙黄绿素荧光显色剂、4mL牛白血病病毒阳性DNA模板。

在本发明中，所述试剂盒的使用方法为采用环介导恒温扩增反应；所述使用方法为：将上述技术方案所述试剂盒中的组分按比例混匀，加入待检样品DNA，在65℃反应45min，将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，出现特异梯状条带则为阳性，没有条带出现则为阴性。在本发明中，所述环介导恒温扩增反应体系优选为：每25μl反应体系包括5μL 5×Buffer，3μL上述技术方案所述引物；1μLBst 2.0DNA聚合酶，3.5μL 10mM dNTPs，1μL钙黄绿素荧光显色剂，10μL待检样品DNA，1.5μL灭菌双蒸水。阳性对照将待检样品DNA替换为牛白血病病毒阳性DNA模板，阴性对照将待检样品DNA替换为灭菌双蒸水；所述外引物、内引物和环引物反应的终浓度优选分别为0.2μM、1.6μM和0.8μM。

在本发明中，所述琼脂糖凝胶中琼脂糖的质量分数为2％。

在本发明中，所述待检样品DNA优选采用全核酸提取试剂盒对牛血样样品进行提取。本发明对所述全核酸提取试剂盒的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的全核酸提取试剂盒的市售产品即可，如美国Roche公司的High-Pure PCRTemplate PreparationKit。

环介导恒温扩增方法(LAMP,Loop-mediated isothermal amplification)通常是针对待检测基因的6个特异性区域设计4条扩增引物，由一对外引物(F3、B3)和一对内引物(FIP、BIP)所组成，在本发明中，为了缩短反应时间，提高扩增效率，在此基础上还增加一对环引物(LF、LB)。在本发明中，通过利用链置换型DNA聚合酶(Bst2.0DNA聚合酶)，在恒温环境65℃下，45分钟以内高效扩增出靶序列。双链DNA在65℃时会处于动态平衡的状态。任何引物与双链DNA互补部分进行碱基配对延伸时，另一条链会脱落成为单链。内引物FIP与单链的模板DNA上互补区段接合，与模板DNA链互补。外引物F3通过置换型DNA聚合酶的作用，一边将刚才由FIP引物合成的DNA链剥离，一边合成新的DNA链。剥离的DNA单链由于在5’末端含有互补的区段，通过自我碱基配对形成环状结构。内引物BIP和外引物B3同上述原理类似，此时剥离的单链DNA在3’与5’末端均有互补区段，整条链形成如同哑铃状的结构，作为扩增的起始结构。哑铃状结构的DNA链，以自身为模板进行DNA合成延伸，一边不断形成这种哑铃状结构的DNA链，一边周而复始地扩增，形成大量反向重复的环状结构和哑铃状结构化的靶基因DNA片段所组成的混合物。在此基础上，在环状结构的5’末端的环状单链部分导入具有互补序列的环引物LB和LF，增加DNA合成的起点。

下面结合具体实施例对本发明提供的一组用于检测牛白血病病毒的引物及试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

1、准备反应引物2×oligo：

在340μL双蒸水中加入外引物上下游(F3/B3)各10μL，内引物上下游(FIP/BIP)各80μL和环引物上下游(LF/LB)各40μL。所述引物序列如表1所示：

表1引物序列

2、LAMP反应体系组分配制

(1)5×Buffer：包含100mM Tris-HCl(pH 8.8，25℃)、250mM氯化钾、50mM硫酸铵、40mM硫酸镁、体积百分浓度为0.1％的吐温-20。

(2)8000U/mLBst2.0DNA聚合酶；

(3)10mM dNTPs；

(4)LAMP引物组(所述步骤1的外引物、内引物和环引物)，各组引物加入后的终浓度分别为：外引物浓度为0.2μM，内引物浓度为1.6μM，环引物浓度为0.8μM；

(5)反应指示剂：钙黄绿素荧光显色剂；

(6)灭菌双蒸水；

(7)阳性对照：牛白血病病毒阳性的DNA模板。

(8)阴性对照：灭菌双蒸水。

3、LAMP检测反应体系如表2所示。

表2 LAMP反应体系

将反应体系配制于PCR管中，同时设置阳性对照和阴性对照；

LAMP反应条件：将含反应体系的PCR管混匀后离心，置于恒温环境65℃反应45min，取出。

特异性试验

选取本实验室研究所确定的牛白血病病毒阳性样品B1195、B1256、B1384、B1412、B1413和已确定的阴性样品B762、B1402、B1408、B1432、B1440进行LAMP检测方法的特异性试验，以验证本研究检测方法的特异性。使用2％浓度琼脂糖凝胶电泳检测，阳性则可呈现典型的特异梯状条带，阴性则无此现象。LAMP方法特异性检测结果如图1所示。其中，泳道M为DL-100DNA Marker；泳道1-5为PCR鉴定牛白血病病毒阳性样品分别为B1195、B1256、B1384、B1412、B1413；泳道6-10为PCR鉴定牛白血病病毒阴性样品B762、B1402、B1408、B1432、B1440；泳道11为阴性对照。通过图1的结果可知，标准阳性模板呈阳性，阴性对照呈阴性，空白孔呈阴性，本方法可以特异性的检测出牛白血病病毒DNA。

将样品B1360进行PCR扩增并进行切胶回收，经核酸浓度测算，含量约2×10¹⁰拷贝/μL的模板DNA进行10倍梯度稀释，做出标准曲线。将样品B1349进行荧光定量PCR进行扩增，根据标准曲线测算出核酸浓度，为80拷贝/μL，将此模板进行稀释，分别稀释为10拷贝/μL，1拷贝/μL，0.1拷贝/μL。每个稀释度的基因组DNA作为模板，分别进行LAMP检测反应的敏感性试验，同时，将其用本实验室所建立的实时荧光检测方法进行检测，作为敏感性对照试验。本发明浑浊度检测结果如表3所示：

表3浑浊度检测结果

LAMP方法灵敏度验证电泳结果图如图2所示，其中，泳道M为DL-100DNAMarker；泳道1-4的样品浓度分别为80拷贝数/μL、10拷贝数/μL、1拷贝数/μL、0.1拷贝数/μL；泳道5为阴性对照。由图2可知，80拷贝数/μL、10拷贝数/μL、1拷贝数/μL三个稀释梯度的阳性模板能被检出，最低检测限为1拷贝数/μL。

显色试验

LAMP反应后，可用肉眼观察，如液体变混浊，说明待检样品中为牛白血病病毒阳性。或观察颜色变化，颜色变为绿色，则说明样品中含有牛白血病病毒基因；颜色仍为橙色，说明样品为阴性。显色反应检测结果如图3所示，图中反应孔1、2、3、4、5分别80拷贝数/μL、10拷贝数/μL、1拷贝数/μL、0.1拷贝数/μL浓度模板以及阴性对照。如图所示，反应孔1、2、3颜色变为绿色，则为阳性，说明中80拷贝数/μL、10拷贝数/μL、1拷贝数/μL浓度模板中含有牛白血病病毒基因；反应孔4颜色为橙色，说明0.1拷贝数/μL浓度模板无法检测出牛白血病病毒基因；反应孔5颜色为橙色，则为阴性，说明阴性对照无牛白血病病毒基因。

对照例1

采用实施例1LAMP方法与常规实时荧光定量PCR方法进行敏感性对比实验。敏感性对比结果如图4所示。

由图4可知，在LAMP试验中，1拷贝/μL即10拷贝/反应可以确保检测出。0.1拷贝/μL即单拷贝/反应有一定概率出现。而实时荧光定量PCR检测结果同LAMP相同，1拷贝/μL即10拷贝/反应可以确保检测出。0.1拷贝/μL即单拷贝/反应有一定概率出现，有时曲线会跳孔。结果表明，本研究LAMP方法检测灵敏度跟实时荧光定量PCR方法要在同一个数量级。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 镇江威特药业有限责任公司

<120> 一组用于检测牛白血病病毒的引物及试剂盒

<130> 2017

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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