一种检测猪瘟猪丹毒猪肺疫三联活疫苗抗原菌含量的选择性培养基及其制备方法和应用与流程

本发明属于动物医学的微生物生产领域，具体公开了一种检测猪瘟猪丹毒猪肺疫三联活疫苗抗原菌含量的选择性培养基及其制备方法和应用。

背景技术：

猪丹毒(Swine erysipelas,SE)是由猪丹毒杆菌(Erysipelothrix rhusiopathiae,ER)引起的一种急性热性传染病，其主要特征为高热、急性败血症、皮肤疹块(亚急性)、慢性疣状心内膜炎及皮肤坏死与多发性非化脓性关节炎(Wood R.L.,Erysipelas,in:Leman,et al.(Eds.),Diseases of swine,Iowa State University Press,Ames,Iowa,1992,pp.475–486)。从这些症状的猪体内分离到的猪丹毒杆菌大多为血清1型(1a亚型和1b亚型)和2型(Takashi et al.,Protection Effect of NaOH-Extracted Erysipelothrix rhusiopathiae J.Vet.Med.Sci.60(1):9-14.1998)。本病曾经被称为我国“三大传染病”之一，近年来，随着养猪集约化发展猪丹毒逐渐淡出人们的视野，但该病并没有完全被净化，在全国各地区一直都有零星出现，给养猪户造成了严重的经济损失(龚平阳，王连想，阳志香.广东地区猪场猪丹毒的发病特点及综合防控措施[J].畜禽业总，2010(11)：11－12.)。

目前预防该疾病主要采用猪丹毒杆菌弱毒疫苗来进行免疫防控，我国采用的疫苗主要为猪丹毒弱毒疫苗株G4T10株，该疫苗株是由江苏省农业科学院和南京生物药品厂在20世纪70年代联合研制而成，猪丹毒弱毒株G4T10是强毒株经豚鼠370代和在含有0.01％～0.04％吖啶黄血液琼脂培养基上传10代获得的。

为了简化多次疫苗注射，在中国兽药监察所主持下，华东农业科学研究所，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，南京、成都、郑州和兰州等生药厂(1974-1978)年共同参与研制成了猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联活疫苗。联合疫苗中所用的菌、毒株为猪丹毒G4T10株、猪肺疫EO630及猪瘟兔化弱毒。三种菌、毒液按一定比例混合后分装冻干而成。也可根据实际防疫血药配制二联苗。联苗接种免疫猪所产生的抗各个病原的免疫力，与各个单苗接种引起的免疫力在强度上基本一致，说明三者之间无相互干扰现象。并且本实验室前期实验结果显示三联苗免疫能分别抵抗猪瘟和猪丹毒温氏分离株的攻击。

目前，生产上常用猪瘟猪丹毒猪肺疫三联活疫苗对猪瘟猪丹毒猪肺疫三种疾病进行免疫防控，猪瘟猪丹毒猪肺疫三联活疫苗对养殖业的贡献不可小窥，其免疫效果直接关系广大养殖户的利益。公知的，疫苗的免疫效果最根本的决定因素是疫苗中有效抗原的含量，但现有技术中并没有一种有效的方法能对疫苗中猪丹毒抗原进行很好地监测。

由此可见，现有技术存在很大不足。

技术实现要素：

有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种检测猪瘟猪丹毒猪肺疫三联活疫苗抗原菌含量的选择性培养基及其制备方法，以及将该选择性培养基应用于实验室检测的方法；该选择性培养基及检测方法在商品化猪瘟猪丹毒猪肺疫三联苗中猪丹毒和猪肺疫混合在一起的情况下，仍旧能够对猪丹毒抗原菌进行准确测定，重复性好，准确度高，为生产中监测疫苗质量稳定提供依据。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种检测猪瘟猪丹毒猪肺疫三联活疫苗抗原菌含量的选择性培养基，包括下列组分：TSA(胰蛋白胨大豆琼脂)29-40mg/ml，牛血清3％～5％，卡那霉素20～80μg/mL，无菌双蒸水适量。

进一步的，所述选择性培养基，包括下列组分：TSA(胰蛋白胨大豆琼脂)30mg/ml，牛血清5％，卡那霉素50μg/mL，无菌双蒸水适量。

进一步的，所述选择性培养基的制备方法包括：称取TSA粉末溶于适量灭菌双蒸水中，于121℃高压16～21min，待其自然放凉至45-55℃，加入牛血清和卡那霉素，搅拌均均即可。

进一步的，所述选择性培养基的制备方法包括：称取TSA粉末溶于适量灭菌双蒸水中，于121℃高压16min，待其自然放凉至50℃，加入牛血清和卡那霉素，搅拌均均即可。

进一步的，所述选择性培养基，在准确测定猪瘟猪丹毒猪肺疫三联活疫苗中抗原菌含量中的应用。

进一步的，所述选择性培养基应用于测定猪瘟猪丹毒猪肺疫三联活疫苗中猪丹毒抗原菌含量的方法，包括以下操作：

1)按所述配比备料，用所述制备方法制备选择性培养基，待用；

2)待检样本处理：将样本三联疫苗用无菌生理盐水稀释成1mL/头份，取100μL稀释于900μL无菌生理盐水中；重复上述操作，连续稀释6次，取最后一次稀释液(即第6管)100μL接种于步骤1)制备的选择性琼脂平皿中，置于37℃培养24～48h；

所述样本三联苗浓度为(3-20)×10⁸稀释6次后平板上生长菌落数为30～200，是便于准确计数的最佳菌落数。

3)对步骤2)所得的菌落进行计数；

所述三联苗中猪瘟和猪丹毒抗原含量用普通培养基按现有方法计数即可。

进一步的，所述单联疫苗或三联疫苗抗原的检测方法中所述步骤2)中培养时间为36h。

进一步的，所述三联苗中猪丹毒抗原为猪丹毒G4T10株抗原株；所述猪肺疫抗原为猪肺疫为EO630株。

本发明有益效果：

本发明提供的选择性培养基，组成组分及结构简单，制备便捷易操作；增加的卡那霉素可以抑制三联苗中猪肺疫EO630的生长而不抑制猪丹毒G4T10株的生长，从而能够分别准确测定三联苗中猪丹毒和猪肺疫两种细菌抗原含量；同时，卡那霉素还能防止一些常见菌的干扰。本发明提供的选择性培养基的测定方法对三联苗中猪丹毒G4T10株和猪肺疫EO630株分别进行准确测定，重复性好，准确度高，为生产中监测疫苗质量稳定提供依据，也有利于在采购中监测疫苗的质量从而保证免疫效果到位。

商品化猪瘟猪丹毒猪肺疫三联苗中猪丹毒菌和猪肺疫菌混合在一起，用普通培养基培养猪肺疫菌会竞争性抑制猪丹毒菌生长，故只能对猪瘟和猪肺疫菌进行计数，无法对猪丹毒菌进行准确计数。本发明发现并且利用猪肺疫生长速度快且菌落形态较猪丹毒大这一特性，提供了所述的选择性培养基和检测方法在商品化猪瘟猪丹毒猪肺疫三联苗中猪丹毒和猪肺疫混合在一起的情况下，仍旧能够对猪丹毒抗原菌进行准确测定，重复性好，准确度高，为生产中监测疫苗质量稳定提供依据。弥补了之前无法将三联苗中两种细菌抗原分别计数的缺陷，这也解决了临床使用中对三联苗进行质量监控的长期问题。

附图说明

图1为猪肺疫EO630单价苗稀释后接种普通琼脂平皿后计数情况。

图2为猪丹毒G4T10单价苗稀释后接种普通琼脂平皿后计数情况。

图3为猪丹毒G4T10单价苗和猪肺疫EO630单价苗混合后稀释后接种普通琼脂平皿后计数情况。

图4为猪丹毒G4T10单价苗和猪肺疫EO630单价苗混合后稀释后接种选择性琼脂平皿后计数情况。

具体实施方式

为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用试剂均为市售商品，牛血清购自武汉三利公司，TSA购自美国BD公司，卡那霉素购自Sigma公司；猪瘟猪丹毒猪肺疫三联活疫苗，猪丹毒G4T10单价活疫苗，猪肺疫EO630单价活疫苗均购自中牧实业股份有限公司。

实施例1 准确性检验

(1)琼脂平皿的制备：

普通琼脂平皿制备：称取30gTSA粉末溶于1000mL灭菌双蒸水中，于121℃高压16min，待其凉至50℃，加入5％牛血清；

选择性琼脂平皿制备：称取30gTSA粉末溶于1000mL灭菌双蒸水中，于121℃高压16min，待其凉至50℃，加入5％牛血清和30mg卡那霉素。

(2)将猪丹毒G4T10单价活疫苗，猪肺疫EO630单价活疫苗分别用无菌生理盐水稀释成1mL/头份，并分别取100μL稀释于900μL无菌生理盐水中，并分别连续进行6次，分别取第6次稀释液中100μL接种于无卡那霉素的普通琼脂平皿中，置于37℃培养36h，并对菌落进行计数。

(3)将猪丹毒G4T10单价活疫苗，猪肺疫EO630单价活疫苗混合后用无菌生理盐水稀释成分别含有猪丹毒和猪肺疫1mL/头份，并取100μL稀释于900μL无菌生理盐水中，连续进行6次，并分别取第6次稀释液中100μL接种于无卡那霉素的普通琼脂平皿和含有卡那霉素的选择性琼脂平皿中，置于37℃培养36h，并对普通平皿中大菌落很小菌落形态菌落分别进行鉴别计数，以及对选择性琼脂所有菌落进行计数。

鉴别依据：在普通培养基中猪肺疫菌生长速度较猪丹毒菌快，其菌落形态较大，直径为3-4μm，而猪丹毒则较小直径为1-2μm；而在选择性培养基中，猪肺疫菌基本被抑制，不可见。

(4)计数结果：如表1所示，步骤(2)的计数结果分别为117和70，表明猪丹毒G4T10单价活疫苗猪丹毒细菌含量为11.7×10⁸，猪肺疫EO630单价活疫苗细菌含量为7×10⁸；步骤(3)中普通平皿大菌落数为69，小菌落数为90，表明原猪肺疫EO630单价活疫苗中猪肺疫细菌含量为6.9×10⁸，表明原猪丹毒G4T10单价活疫苗中猪丹毒细菌含量为9×10⁸，步骤(3)中选择性琼脂计数结果为113，表明原猪丹毒G4T10单价活疫苗中猪丹毒细菌含量为11.3×10⁸，结果表明普通琼脂平皿可以准确测定混合后猪肺疫抗原含量，而猪丹毒抗原含量则需在选择性平皿中计数。检测结果如图1、图2、图3和图4所示。

表1实施例1实验数据

本实例中主要体现本发明选择性培养基和方法的准确性，将同一厂家的(选择同一厂家即是为了保证抗原含量的一致性)三联苗对应的猪丹毒单苗和猪肺疫单苗分别计数即为两种单苗的实际含量，然后我们人为将这两个已知抗原含量的猪丹毒单苗和猪肺疫单苗混在一起，并分别用本专利发明的方法和常规的计数方法进行对比，对比结果可以看出本专利发明的方法和两种单苗的实际含量是一致的，即本发明选择性培养基和检测方法所检测到的混合疫苗中的各单抗原的量最接近实际含量。

实施例2 重复性检验

(1)按实施例1的步骤(1)制备普通琼脂平皿和选择性琼脂平皿，将猪瘟猪丹毒猪肺疫三联苗稀释成1mL/头份，并取100μL稀释于900μL无菌生理盐水中，连续进行6次，并分别取第6次稀释液中100μL接种于无卡那霉素的普通琼脂平皿和含有卡那霉素的选择性琼脂平皿中，置于37℃培养36h，并对普通平皿中大菌落很小菌落形态菌落分别进行计数，以及对选择性琼脂所有菌落进行计数，普通平皿中大菌落数即作为猪肺疫抗原含量，选择性平皿中菌落数即为猪丹毒抗原含量。按上述操作进行2次重复。

(2)将两次重复的结果进行对比，重复一：普通琼脂平皿中大菌落数为78，小菌落数为76，则三联苗中猪肺疫抗原含量为7.8×10⁸，猪丹毒抗原含量为7.6×10⁸，选择性琼脂平皿中菌落数为108，则三联苗中猪丹毒抗原含量为10.8×10⁸；重复二：普通琼脂平皿中大菌落数小菌落数72，则三联苗中猪肺疫抗原含量为7.2×10⁸，猪丹毒抗原含量为8.3×10⁸，选择性琼脂平皿中菌落数为112，则三联苗中猪丹毒抗原含量为11.2×10⁸。检测结果见表2。

表2待检样品检测结果

结果表明两次重复相同培养时间，由于普通平皿中猪丹毒菌落生长速度慢被生长速度快的猪肺疫菌落覆盖从而导致普通平皿对猪丹毒抗原含量计数重复性不好且不准确，而选择性琼脂平皿则准确而且重复性好。

实施例3 对不同批号猪瘟猪丹毒猪肺疫三联活疫苗的检测

试验组：对三个不同批次的猪瘟猪丹毒猪肺疫三联活疫苗分别按照本发明实施例2中步骤(1)方法进行稀释，接种，培养，然后计数，普通平皿中大菌落数即作为猪肺疫抗原含量，选择性平皿中菌落数即为猪丹毒抗原含量。

对照组：按实施例1的步骤(1)制备普通琼脂平皿和选择性琼脂平皿，将猪瘟猪丹毒猪肺疫三联苗稀释成1mL/头份，并取100μL稀释于900μL无菌生理盐水中，连续进行6次，并分别取第6次稀释液中100μL接种于无卡那霉素的普通琼脂平皿和中，置于37℃培养36h，并对普通平皿中大菌落很小菌落形态菌落分别进行计数，普通平皿中大菌落数即作为猪肺疫抗原含量，普通平皿中小菌落数即为猪丹毒抗原含量。

上述两组实验结果如表3所示：

表3不同批次三联苗中细菌抗原含量测定结果

表3中可以看出，本发明的方法对猪瘟猪丹毒猪肺疫三联活疫苗细菌抗原含量的测定较现有技术的测定方式更接近实际含量，即更为准确。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。