一种煤地质微生物形态和数量的检测方法与流程

本发明涉及一种微生物检测方法，具体属于一种煤地质微生物形态和数量的检测方法。

背景技术：

目前，在煤地质微生物形态观察和数量研究方面，多采用直接观察法和MPN计数法，该方法难以避免杂质的影响，同时，很多煤地质微生物不可培养，无法用MPN计数法计算数量，且不准确。不能真实反映微生物的形态和数量及其活性。使用荧光显微镜进行微生物数量和大小的观察计算是本领域的常用方法之一。主要操作方法是对微生物进行荧光染色，然后再利用荧光显微镜在一定波长下照射使其发光，然后进行计数。例如量取一定量的水样（1毫升），用吖啶橙（4-7滴）染色（3-5分钟），抽滤，将滤膜放置于荧光显微镜下检测，对所拍照片进行直接计数。对于普通的微生物，这种操作办法效果很好。但是对于长期存在于煤矿中的微生物，绝大多数都为厌氧微生物，在采样过程中要绝对避免接触氧气和其他环境，否则会引起这些厌氧微生物大量消失以及混入其他微生物，从而影响计数准确性。

技术实现要素：

本发明为解决煤地质微生物厌氧取样技术手段无法完全避免掺入杂质，对微生物样品观察检测造成干扰，难以区分样品杂质和微生物菌体等问题，提供一种煤地质微生物形态和数量的检测方法。

本发明的技术方案是，一种煤地质微生物形态和数量的检测方法，包括如下步骤：

1）煤样或水样采集,

2）微生物菌体的收集,

3）菌体前处理：厌氧条件下，将备用滤膜上菌体，用去氧无菌水洗下来，制成菌悬液。根据观察目的不同，加入特定荧光染色剂（DAPI），低速震荡培养，待染色剂与微生物反应,

（4）荧光显微镜分析：将反应好的微生物样品，适量滴在载玻片上，进行镜检,

（5）微生物形态分析：使用Image pro Plus软件测量菌体大小体积,

（6）微生物数量分析：将制备好的染色菌液，取适量滴入细胞计数板内，在荧光显微镜下镜检，统计计算出数量。

本发明通过水样或煤样的隔绝氧气的采集等加工手段，能够确保煤矿中的煤样或水样中的厌氧微生物不被破坏，且不混入地面的杂菌，因而能明显观察出样品中微生物的菌体形态，准确测量出其大小，较精确计算出其数量，在研究煤地质微生物菌体形态数量中有明显的优越性。适用于煤层、油气或页岩气地层等环境中微生物形态和数量的分析。

附图说明

图1为本发明检测方法的流程图；

图2为水样采样瓶的构造；

图3为煤样采样罐的构造；

图4为抽滤装置构造；

图中：1-出气液管、2-进气液管、3-瓶体、4-还原剂、5-瓶底、6-出气口、7-催化剂、8-罐盖、9-罐体、10-进气口一、11-进气口二、12-待滤样品瓶、13-夹子、14-联通器、15-锥形废液瓶、16-抽气口、17-微孔滤膜。

具体实施方式

如图1所示意，一种煤地质微生物形态和数量的检测方法，包括如下步骤：

1）煤样或水样采集,

2）微生物菌体的收集,

3）菌体前处理：厌氧条件下，将备用滤膜上菌体，用去氧无菌水洗下来，制成菌悬液。根据观察目的不同，加入荧光染色剂DAPI（即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。），低速震荡培养，待染色剂与微生物反应,

（4）荧光显微镜分析：将反应好的微生物样品，适量滴在载玻片上，进行镜检,

（5）微生物形态分析：使用Image pro Plus软件测量菌体大小体积,

（6）微生物数量分析：将制备好的染色菌液，取适量滴入细胞计数板内，在荧光显微镜下镜检，统计计算出数量。

所述步骤（1）中，

水样采集过程，使用水样取样瓶，取样前将取样瓶进行高温高压灭菌，在无菌工作台内，用氮气置换瓶体内空气，将配制好的新鲜还原剂溶液（还原剂为L-半胱氨酸和或碳酸氢钠）装入底部，然后从进液口灌入水样，将水样与还原剂混匀，取回待用。

煤样采样过程：使用煤样取样罐，取样前将取样罐进行高温高压灭菌，将催化剂钯粒装在罐盖底部（催化剂钯粒是干性的，可将罐体内残留少量空气催化成厌氧气体，催化剂的种类名称），从进气口一通入氮气置换罐体内空气，从下至上，能充分置换气体，取样时，将煤样装入罐体内，盖好罐盖，再通入氮气充分置换罐体，取回待用。

如图2所示意，所述的水样取样瓶构造是，瓶体3，瓶体3上口封闭，瓶体3下设有可拆卸的还原剂瓶底5，在瓶口处设有进气液管2和出气液管1，所述的进气液管2下口比出气液管1下口低。

使用方法：用氮气从置换瓶体内空气，从进气液管2送入氮气，使瓶内空气从出气液管1排出，完成置换过程。

将配制好的新鲜还原剂溶液装入底部。取样时从进液口灌入水样，将水样与还原剂混匀，取回待用。使用结束后打开还原剂瓶底5，将还原剂取出即可。

如图3所示意，所述的煤样取样罐的构造是，罐体9，罐体下方设有进气口10一，罐体9上方设有罐盖8，罐盖8内装有催化剂7，穿过罐盖8设有出气口6。

使用方法：将催化剂7装在罐盖8底部（催化剂是干性的，可将罐体内残留少量空气催化成厌氧气体），从下部的进气口一10缓慢通入氮气置换罐体内空气，从下至上，能充分置换气体。取样时，将煤样装入罐体9内，盖好罐盖8，再通入氮气充分置换罐体9，取回待用。使用时取少量煤样后，按照上述方法通入氮气，可保证剩余煤样依然保持厌氧状态，继续使用。

所述的步骤（2）微生物菌体的收集方法,具体如下

操作前进行高温高压灭菌，在超净工作台内，放好微孔滤膜，进气口二连接氮气阀，真空连接好，对过滤装置进行预抽过程，使得整个装置充满氮气，保持厌氧环境，预抽后，加入待滤样，进气口二依然连接氮气阀，开始抽滤工作，完毕后取微孔滤膜待用。

所述待滤样为采集到的水体菌水样，

所述的待滤样为采集到的煤体菌水样，制备方法是采集到的煤样在厌氧条件下，研磨细，加入去氧无菌水，震荡摇匀，静置，取上清液。

如图4所示意，所述收集装置的构造，锥形废液瓶15，联通器14，待滤样品瓶12，待滤样品瓶12和锥形废液瓶15通过联通器14连接，在联通器14一侧设有抽气口16，在待滤样品瓶12上方设有进气口二11，在待滤样品瓶12和联通器14之间设有微孔滤膜17，并且通过夹子13固定。