基于染色法对产纤维素酶菌株的快速筛选方法与流程

本发明属于微生物学技术领域，具体涉及一种基于染色法对产纤维素酶菌株的快速筛选方法。

背景技术：

纤维素酶是将纤维素及其衍生物水解成葡萄糖的一组酶的总称，广泛用于纺织、食品、饲料、造纸、制药、垃圾处理及生物燃料等行业；能产生纤维素酶的微生物主要是真菌和部分细菌，而广泛应用到工业生产中的是真菌，尽管越来越多的细菌也被在实验室里用于生产中性和碱性纤维素酶。开发酶制剂的第一步就是从环境中筛选出能生产高活力对应酶的菌株。考虑到对新型纤维素酶的需求以及其在生物工程领域的广泛应用，分离和筛选产纤维素酶菌株具有很重要的应用价值，一种简单、快速、对环境友好的定量筛选方法无疑会加速这一过程进而并提高效率。

目前，用于筛选产纤维素微生物的传统方法是用羧甲基纤维素（或其钠盐）为碳源，利用无机盐培养基培养；然后用1%刚果红溶液漂染平板30分钟，再用1 mol/L NaCl漂洗，在产纤维素酶菌落周围产生淡黄色晕圈。该方法有五个方面的不足之处：1. 培养过程漫长，在无机盐培养基上大多数土壤微生物培养3~7天才可以看到明显的菌落；2. 染色过程较长，需要30分钟漂染以上；2. 背景不清晰，淡红色和黄色晕圈边界不能准确判定；3. 非特异染色，某些微生物会分解色素；4. 刚果红安全性问题，刚果红在生物体内代谢可能会产生有毒性的对二氨基联苯，从而对筛选菌有一定的毒性，同时废弃染液的处理也会对环境造成污染。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的缺陷，本发明提供了一种基于染色法对产纤维素酶菌株的快速筛选方法，该方法具有快速、简单、染色明显、环境友好、通用性强的特点。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种基于染色法对产纤维素酶菌株的快速筛选方法，它包括以下步骤：培养和染色筛选；

（1）培养

a. 培养基的组成：培养基是由如下质量百分比的组分构成：羧甲基纤维素钠0.2~1.2%、蛋白胨0.5~2%、酵母粉0.2~1%、氯化钠0.1~1 %、硫酸铜0.05~0.5 %和琼脂粉0.7-1.5%，余量为蒸馏水；

b. 培养基的制备方法：先按照上述配方称取羧甲基纤维素钠、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸铜和琼脂粉加入至蒸馏水中，搅拌溶解，灭菌，灭菌之后在超净台内倒平板，凝固之后倒置；

c. 恒温培养：将待培养的产纤维素酶菌株接种于上述琼脂平板，倒置于20~42℃培养箱培养1~7天；

（2）染色筛选

d. 称取质量百分比浓度为0.2~1.0% I₂/KI水溶液5~10 mL，加入上述培养好的长满菌落的平板中，轻轻晃动平板，使染色液均匀覆盖所有琼脂表面为止；其中I₂/KI水溶液中，I₂与KI的质量比为1:2；

e. 根据所用染色液浓度不同，在0.5~1.5小时内对水解羧甲基纤维素钠形成的透明圈进行测定。

根据上述的基于染色法对产纤维素酶菌株的快速筛选方法，步骤（1）培养基的组成中，培养基是由如下质量百分比的组分构成：羧甲基纤维素钠0.8~1.0%、蛋白胨1.0~1.5%、酵母粉0.5~0.8%、氯化钠0.3~0.5 %、硫酸铜0.1~0.2 %和琼脂粉1.0-1.2%，余量为蒸馏水。

根据上述的基于染色法对产纤维素酶菌株的快速筛选方法，步骤（1）培养基的制备方法中，灭菌条件为121℃高压灭菌30分钟。

根据上述的基于染色法对产纤维素酶菌株的快速筛选方法，步骤（1）中，恒温培养是将待培养的产纤维素酶菌株接种于上述琼脂平板，倒置于30~37℃培养箱培养1~2天。

根据上述的基于染色法对产纤维素酶菌株的快速筛选方法，步骤（2）染色筛选中，称取质量百分比浓度为0.5~0.7% I₂/KI水溶液5~7 mL，加入上述培养好的长满菌落的平板中，轻轻晃动平板，使染色液均匀覆盖所有琼脂表面为止。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

1．本发明的培养方法简单，微生物生长快。

2. 本发明的筛选方法上色迅速，上色的时间小于0.5~2分钟，而且形成的透明圈边界清晰，易于定量测定。

3. 本发明所用染色剂安全，用量少，无需倾倒清洗，不存在环境污染。

4. 同时由于培养基中加入了硫酸铜，筛选菌株产纤维素酶阳性率高。

附图说明

图1为I₂/KI水溶液染色图；

图2为刚果红染色图；

图1和图2中的N2、N10、 N13、 SC25为4种不同的微生物菌落；

N2：Bacillus subtilis N2

N10：Bacillus subtilis N10

N13：Bacillus cereus N13

SC25：Enterobacter cloacae SC25。

具体实施方式

以下实施例是对本发明内容进行详细具体的说明，但本发明的内容并不限定如此。

实施例1

一种基于染色法对产纤维素酶菌株的快速筛选方法，它包括以下步骤：培养和染色筛选；

（1）培养

a. 培养基的组成：培养基是由如下质量百分比的组分构成：羧甲基纤维素钠0.2~1.2%、蛋白胨0.5~2%、酵母粉0.2~1%、氯化钠0.1~1 %、硫酸铜0.05~0.5 %和琼脂粉0.7-1.5%，余量为蒸馏水；

b. 培养基的制备方法：先按照上述配方称取羧甲基纤维素钠、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸铜和琼脂粉加入至蒸馏水中，搅拌溶解，灭菌，灭菌之后在超净台内倒平板，凝固之后倒置；

c. 恒温培养：将待培养的产纤维素酶菌株接种于上述琼脂平板，倒置于20~42℃培养箱培养1~7天；

（2）染色筛选

d. 称取质量百分比浓度为0.2~1.0% I₂/KI水溶液5~10 mL，加入上述培养好的长满菌落的平板中，轻轻晃动平板，使染色液均匀覆盖所有琼脂表面为止；其中I₂/KI水溶液中，I₂与KI的质量比为1:2；

e. 根据所用染色液浓度不同，在0.5~1.5小时内均对水解羧甲基纤维素钠形成的透明圈进行测定。

实施例2

一种基于染色法对产纤维素酶菌株的快速筛选方法，它包括以下步骤：培养和染色筛选；

（1）培养

a. 培养基的组成：培养基是由如下质量百分比的组分构成：羧甲基纤维素钠1.0%、蛋白胨1.5%、酵母粉1%、氯化钠1 %、硫酸铜0.05 %和琼脂粉1.5%，余量为蒸馏水；

b. 培养基的制备方法：先按照上述配方称取羧甲基纤维素钠、蛋白胨、酵母粉、氯化钠、硫酸铜和琼脂粉加入至蒸馏水中，搅拌溶解，灭菌，灭菌之后在超净台内倒平板，凝固之后倒置；

c. 恒温培养：将待培养的产纤维素酶菌株接种于上述琼脂平板，倒置于37℃培养箱培养1天；

（2）染色筛选

d. 称取质量百分比浓度为1.0% I₂/KI水溶液5 mL，加入上述培养好的长满菌落的平板中，轻轻晃动平板，使染色液均匀覆盖所有琼脂表面为止；其中I₂/KI水溶液中，I₂与KI的质量比为1:2；

e. 根据所用染色液浓度不同，在1.5小时内均对水解羧甲基纤维素钠形成的透明圈进行测定。

实施例3

本实施例与实施例2相同之处不再重述，不同之处在于所述培养基是由如下质量百分比的组分构成：羧甲基纤维素钠0.2%、蛋白胨2%、酵母粉0.2%、氯化钠1 %、硫酸铜0.05 %和琼脂粉1.5%，余量为蒸馏水。

实施例4

本实施例与实施例2相同之处不再重述，不同之处在于所述培养基是由如下质量百分比的组分构成：羧甲基纤维素钠0.3%、蛋白胨1.8%、酵母粉0.3%、氯化钠0.9%、硫酸铜0.1%和琼脂粉1.4%，余量为蒸馏水。

实施例5

本实施例与实施例2相同之处不再重述，不同之处在于所述培养基是由如下质量百分比的组分构成：羧甲基纤维素钠0.4%、蛋白胨1.6%、酵母粉0.4%、氯化钠0.8 %、硫酸铜0.15 %和琼脂粉1.3%，余量为蒸馏水。

实施例6

本实施例与实施例2相同之处不再重述，不同之处在于所述培养基是由如下质量百分比的组分构成：羧甲基纤维素钠0.5%、蛋白胨1.5%、酵母粉0.5%、氯化钠0.7 %、硫酸铜0.2%和琼脂粉1.2%，余量为蒸馏水。

实施例7

本实施例与实施例2相同之处不再重述，不同之处在于所述培养基是由如下质量百分比的组分构成：羧甲基纤维素钠0.6%、蛋白胨1.4%、酵母粉0.6%、氯化钠0.6 %、硫酸铜0.25 %和琼脂粉1.1%，余量为蒸馏水。

实施例8

本实施例与实施例2相同之处不再重述，不同之处在于所述培养基是由如下质量百分比的组分构成：羧甲基纤维素钠0.7%、蛋白胨1.2%、酵母粉0.7%、氯化钠0.5 %、硫酸铜0.03 %和琼脂粉1.0%，余量为蒸馏水。

实施例9

本实施例与实施例2相同之处不再重述，不同之处在于所述培养基是由如下质量百分比的组分构成：羧甲基纤维素钠0.8%、蛋白胨1.1%、酵母粉0.8%、氯化钠0.4 %、硫酸铜0.35 %和琼脂粉0.9%，余量为蒸馏水。

实施例10

本实施例与实施例2相同之处不再重述，不同之处在于所述培养基是由如下质量百分比的组分构成：羧甲基纤维素钠0.9%、蛋白胨1.0%、酵母粉0.9%、氯化钠0.3 %、硫酸铜0. 4 %和琼脂粉0.8%，余量为蒸馏水。

实施例11

本实施例与实施例2相同之处不再重述，不同之处在于所述培养基是由如下质量百分比的组分构成：羧甲基纤维素钠1.0%、蛋白胨0.8%、酵母粉1%、氯化钠0.2 %、硫酸铜0.45 %和琼脂粉0.7%，余量为蒸馏水。

实施例12

本实施例与实施例2相同之处不再重述，不同之处在于所述培养基是由如下质量百分比的组分构成：羧甲基纤维素钠1.2%、蛋白胨0.5%、酵母粉1%、氯化钠0.1 %、硫酸铜0.5 %和琼脂粉0.7%，余量为蒸馏水。

实施例13

本实施例与实施例2相同之处不再重述，不同之处在于所述培养基是由如下质量百分比的组分构成：羧甲基纤维素钠0.8%、蛋白胨1.0%、酵母粉0.6%、氯化钠0.4 %、硫酸铜0.45 %和琼脂粉1.5%，余量为蒸馏水。

实施例14

本实施例与实施例2相同之处不再重述，不同之处在于所述染色筛选步骤中取质量百分比浓度为0.3% I₂/KI水溶液8 mL。

实施例15

本实施例与实施例2相同之处不再重述，不同之处在于所述染色筛选步骤中取质量百分比浓度为0.5% I₂/KI水溶液6 mL。

实施例16

本实施例与实施例2相同之处不再重述，不同之处在于所述染色筛选步骤中取质量百分比浓度为1.0% I₂/KI水溶液5 mL。

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。