一种钩端螺旋体快速染色试剂及制备方法和应用与流程

本发明属于微生物学检测技术领域，具体涉及一种螺旋体染色试剂及其应用。

背景技术：

钩端螺旋体隶属于螺旋体目钩端螺旋体科钩端螺旋体属，菌体纤细，长6~12微米，宽0.1~0.2微米，菌体的一端或两端弯曲使菌体呈问号状。由致病性钩端螺旋体引起的疾病为钩端螺旋体病，简称钩体病，该病是一种典型的人兽共患性疾病，呈全球性分布，在我国除新疆、西藏、青海、宁夏和甘肃尚未肯定有钩端螺旋体病流行外，其余地区均有钩端螺旋体病流行（李凡、徐志凯主编《医学微生物学》第八版，P198~P208），因此该病是我国重点防控的传染病之一。由于感染的钩端螺旋体血清型、毒力和数量不同以及宿主免疫力的差异，感染者临床表现差异很大，特别是在感染的初期，很多人出现类似感冒的症状，导致临床误诊，延误治疗，造成严重的感染甚至死亡的病例时有报道。因此急需一种快速而又准确的钩端螺旋体病原学诊断方法。目前钩端螺旋体病原学诊断的方法有直接暗视野显微镜检查法、Fontana镀银染色检查法、免疫荧光法和免疫酶染色检查法、血清学实验检查法（如间接血凝试验、血凝抑制试验、酶联免疫吸附试验等）、分子生物学实验检查法（如PCR技术、限制性核酸内切酶指纹图谱、脉冲场凝胶电泳等）。在这些检查法中，基于分子生物学技术的检查方法如中国专利申请200780050927.4公开了一种诊断试剂盒和中国专利申请200710164460.8公开了一种钩端螺旋体的检查方法。这些方法需要的试剂成本较高，而且有假阳性的存在。免疫血清学方法存在操作繁琐、灵敏度不高、且有假阳性的存在。根据Koch法则，检出病原是诊断疾病的金标准，采用暗视野显微镜直接检查要求样本中钩端螺旋体的数量较多，不易观察到，而且存在菌体扩散、污染环境的风险。因此采用染色的方法是对钩端螺旋体诊断检查比较理想的方法。目前通常采用Fontana镀银染色检查法，该法要求染色试剂昂贵，且需要现配现用，配制的试剂不稳定，不能长期保存，染色过程比较繁琐，镀银染色时间难以掌控，染色时间短标本不着色，染色时间长，标本片常常有银颗粒的沉淀，杂质较多，不易观察。由于银离子的氧化作用，采用镀银染色法染出的标本片不稳定，不能长期保存。因此需要一种更加简单快捷的染色方法，来对钩端螺旋体进行染色观察。

技术实现要素：

本发明的目的旨在克服现有技术的不足，为钩端螺旋体染色提供一种新的染色试剂及其使用方法，该试剂可在室温下长期贮存，染色操作简单、染色时间短，染色效果好。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种钩端螺旋体快速染色试剂，由以下重量份数的原料制成：乳酸24-54份、氯化铝（AlCl₃）3.2-4.5份、蔗糖2.2-5.3份、孔雀绿1.28-2.65份、乙醇11-24份、蒸馏水48-64份、0.8-1.2mol/L NaOH和/或KOH水溶液 0.1-1份。

制备方法包括以下步骤：

（1）将孔雀绿研磨后加入乙醇溶解，过滤，得滤液；

（2）将氯化铝溶于蒸馏水中，加入蔗糖和乳酸混匀，得溶液A；

（3）将步骤（1）所得滤液与步骤（2）所得溶液A混匀，然后加入0.8-1.2mol/L NaOH和/或KOH水溶液，混匀即得。

钩端螺旋体快速染色试剂在检测钩端螺旋体方面的应用。

优选的，所述应用包括以下步骤：将感染钩端螺旋体的临床标本或将培养好的钩端螺旋体涂片，将制得涂片自然干燥，固定备用。将上述配制好的染色试剂滴加到涂片区2~3滴（以完全覆盖涂片区为准），染色40~60秒，用水冲掉染色试剂，吸水纸吸干，镜检。

优选的，所述应用用固定是通过加热的方法固定，其过程是将干燥后的涂片在酒精灯外焰上方来回切割三次，进行固定。

本发明的产生的有益效果为：1、试剂配制简单，配制试剂所用材料成本低、易得；2、配制的试剂不需要特殊的保存条件，在室温下可长期保存而不失效；3、染色方法操作简单，对实验人员操作技能要求不高，而且染色时间仅仅需要40~60秒，大大缩短染色时间；

4、染色效果好，通过该法染出的钩端螺旋体呈绿色，在显微镜下更易观察到，且没有杂质。适合对钩端螺旋体染色中推广应用。

附图说明

图1为应用实验1的钩端螺旋体染色效果图（放大倍数 10×100）；

图2为应用实验2的钩端螺旋体染色效果图（放大倍数 10×100）；

图3为应用实验3的钩端螺旋体染色效果图（放大倍数 10×100）；

图4为应用实验4的钩端螺旋体染色效果图（放大倍数 10×100）。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

一种钩端螺旋体快速染色试剂，由以下重量的原料制成：乳酸36g（30ml）、氯化铝3.2g、蔗糖2.2g、孔雀绿1.28g、无水乙醇17.38g（22ml）、蒸馏水50g（50ml）、1mol/L NaOH水溶液 0.2g。

所述钩端螺旋体快速染色试剂的制备方法包括以下步骤：

（1）将孔雀绿染料放入研钵中，充分研磨后加入无水乙醇充分溶解，两层滤纸过滤后得滤液；

（2）将氯化铝溶于蒸馏水中，再加入蔗糖和乳酸混匀，得溶液A；

（3）将步骤（1）所得滤液与步骤（2）所得溶液A混合，充分混匀后加入1mol/L NaOH水溶液，充分混匀后保存在棕色广口瓶中，室温保存备用。

实施例2

一种钩端螺旋体快速染色试剂，由以下重量的原料制成：乳酸31.2g（26ml）、氯化铝3.65g、蔗糖4.3g、孔雀绿1.59g、无水乙醇14.22g（18ml）、蒸馏水56g（56ml）、1mol/L NaOH水溶液 0.5g。

所述钩端螺旋体快速染色试剂的制备方法包括以下步骤：

（1）将孔雀绿染料放入研钵中，充分研磨后加入无水乙醇充分溶解，两层滤纸过滤后得滤液；

（2）将氯化铝溶于蒸馏水中，再加入蔗糖和乳酸混匀，得溶液A；

（3）将步骤（1）所得滤液与步骤（2）所得溶液A混合，充分混匀后加入1mol/L NaOH水溶液，充分混匀后保存在棕色广口瓶中，室温保存备用。

实施例3

一种钩端螺旋体快速染色试剂，由以下重量的原料制成：乳酸24g（20ml）、氯化铝3.2g、蔗糖5.3g、孔雀绿2.65g、无水乙醇11g（13.9ml）、蒸馏水48g（48ml）、1.2mol/L NaOH水溶液 0.1g。

所述钩端螺旋体快速染色试剂的制备方法包括以下步骤：

（1）将孔雀绿染料放入研钵中，充分研磨后加入无水乙醇充分溶解，两层滤纸过滤后得滤液；

（2）将氯化铝溶于蒸馏水中，再加入蔗糖和乳酸混匀；

（3）将步骤（1）所得滤液与步骤（2）所得溶液混合，充分混匀后加入1.2mol/L NaOH水溶液，充分混匀后保存在棕色广口瓶中，室温保存备用。

实施例4

一种钩端螺旋体快速染色试剂，由以下重量的原料制成：乳酸54g（45ml）、氯化铝4.5g、蔗糖4.3g、孔雀绿1.59g、无水乙醇24g（30.4ml）、蒸馏水64g（64ml）、0.8mol/L KOH水溶液 1g。

所述钩端螺旋体快速染色试剂的制备方法包括以下步骤：

（1）将孔雀绿染料放入研钵中，充分研磨后加入无水乙醇充分溶解，两层滤纸过滤后得滤液；

（2）将氯化铝溶于蒸馏水中，再加入蔗糖和乳酸混匀；

（3）将步骤（1）所得滤液与步骤（2）所得溶液混合，充分混匀后加入0.8mol/L KOH水溶液，充分混匀后保存在棕色广口瓶中，室温保存备用。

应用实验1

1、取一张洁净的载玻片，在载玻片的中央滴加少许蒸馏水，用灭菌的接种环取少许培养好的钩端螺旋体，放入载玻片上的蒸馏水中，充分涂开，然后自然干燥，将干燥后的载玻片在酒精灯外焰上方来回切割三次，进行固定；

2、用胶头滴管吸取上述实施例1配制好的染色试剂，滴加2~3滴到载玻片的涂片区上（以覆盖涂片区为好），染色时间为60秒，然后用流水将染色试剂冲洗掉，用吸水纸将载玻片上多余的水分吸干；

3、将上述染色后的载玻片置于显微镜的油镜下观察，可见钩端螺旋体呈绿色，形态典型，染色清晰，如附图1所示。

应用实验2：

1、取一张洁净的载玻片，在载玻片的中央滴加少许蒸馏水，用灭菌的接种环取少许培养好的钩端螺旋体，放入载玻片上的蒸馏水中，充分涂开，然后自然干燥，将干燥后的载玻片在酒精灯外焰上方来回切割三次，进行固定；

2、用胶头滴管吸取上述实施例2配制好的染色试剂，滴加2~3滴到载玻片的涂片区上（以覆盖涂片区为好），染色时间为50秒，然后用流水将染色试剂冲洗掉，用吸水纸将载玻片上多余的水分吸干；

3、将上述染色后的载玻片置于显微镜的油镜下观察，可见钩端螺旋体呈绿色，形态典型，染色清晰，如附图2所示。

应用实验3：

1、取一张洁净的载玻片，在载玻片的中央滴加少许蒸馏水，用灭菌的接种环取少许培养好的钩端螺旋体，放入载玻片上的蒸馏水中，充分涂开，然后自然干燥，将干燥后的载玻片在酒精灯外焰上方来回切割三次，进行固定；

2、用胶头滴管吸取实施例1中配制好后在室温放置1年的染色试剂，滴加2~3滴到载玻片的涂片区上（以覆盖涂片区为好），染色时间为60秒，然后用流水将染色试剂冲洗掉，用吸水纸将载玻片上多余的水分吸干；

3、将上述染色后的载玻片置于显微镜的油镜下观察，可见钩端螺旋体呈绿色，形态典型，染色清晰，如附图3所示。

应用实验4：

1、取一张洁净的载玻片，在载玻片的中央滴加少许蒸馏水，用灭菌的接种环取少许培养好的钩端螺旋体，放入载玻片上的蒸馏水中，充分涂开。然后自然干燥，将干燥后的载玻片在酒精灯外焰上方来回切割三次，进行固定；

2、用胶头滴管吸取实施例2配制好在室温放置18个月的染色试剂，滴加2~3滴到载玻片的涂片区上（以覆盖涂片区为好），染色时间为60秒，然后用流水将染色试剂冲洗掉，用吸水纸将载玻片上多余的水分吸干；

3、将上述染色后的载玻片置于显微镜的油镜下观察，可见钩端螺旋体呈绿色，形态典型，染色清晰，如附图4所示。

由应用实验1-4及附图1-4可知，本发明所制备的钩端螺旋体快速染色试剂可在室温下长期贮存，染色操作简单、染色时间短，染色效果好。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。