解磷青霉菌及其应用的制作方法

技术领域：

本发明涉及一种解磷青霉菌及其应用，属于生物科技领域，具体涉及具有解磷作用的菌株，特别涉及解磷能力较高的两株青霉菌菌株qm-6、qm-10。

背景技术：
：

磷是植物生长发育所必需的营养元素之一，是植物体内核酸及多种酶、辅酶、atp等的重要组成成分，在植物生长发育中的作用仅次于氮。同时磷元素参与植物新陈代谢的途径是多种多样的，它不但可以提高作物的产量，还能增加植物的抗逆性，减轻植物病虫害。植物所利用的磷主要是土壤中的有效磷，但是土壤中的磷95％以上为植物难以利用的无效磷，并且，我国75％左右的耕地土壤有效磷含量低。为了提高作物的产量，增加其抗逆性，每年都需要向土壤中施加大量的磷肥。但磷肥的当季使用率一般只有5％-10％，施入土壤中的大部分磷与ca²⁺、fe³⁺、fe²⁺、al³⁺结合，形成难溶性磷酸盐，导致土壤磷素快速积累。久而久之，施用的磷肥导致大多数农田土壤潜在的磷库含量很大，而提供作物生长发育的磷流却很少，土壤缺磷是“遗传学缺磷”而非“土壤学缺磷”。

现有技术中已经有研究采用微生物方法解决上述土壤缺磷的状况，但是其效果难以令人满意。

技术实现要素：

针对现有技术存在的空白之处，本发明采用以ca3(po4)2作为唯一磷源的固体培养基，初步筛选到具有解磷作用的菌株，然后又利用无机磷液体培养基摇瓶试验进一步测定待测解磷菌株的解磷能力，确定青霉菌菌株qm-6、qm-10的解磷能力较高，这两个菌株对应的最大可溶性磷含量分别为1239.21mg/l，1386.93mg/l。利用its序列测定的方法，确定qm-6和qm-10为草酸青霉(penicilliumoxalicum)。通过温室盆栽解磷试验测定和促生作用分析，发现解磷菌株qm-6和qm-10能够将土壤中植物难以吸收利用的无效磷转化为具有可溶性、可以被直接吸收利用的有效磷，能较好的促进植物的生长，对减少磷肥的施用量具有重要的理论和实践意义。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明首先从土壤中分离得到了两株高效解磷青霉菌，分别来源于山东栖霞、蓬莱地区的果树根际土壤，经人工分离、筛选得到；该菌株鉴定为草酸青霉(penicilliumoxalicum)，命名为草酸青霉qm-6和qm-10，菌落为墨绿或者青绿色，背面淡黄或黄色。在显微镜下观察，分生孢子梗经过多次分枝，产生几轮对称或者不对称的小梗，形如扫帚。

获得上述青霉菌后，对其进行了生物保藏，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为cgmccno.12475和cgmccno.12476；

发明人进一步对上述获得的青霉菌进行了功能研究，结果如下：

qm-6、qm-10的解磷能力较高，这两个菌株对应的最大可溶性磷含量分别为1239.21mg/l，1386.93mg/l；

经草酸青霉qm-6和qm-10处理后，小麦幼苗生长指标的变化，说明草酸青霉qm-6和qm-10可以有效的促进小麦幼苗的生长。

综上所述，本发明获得了两株青霉菌菌株qm-6和qm-10，其解磷能力较高，这两个菌株对应的最大可溶性磷含量分别为1239.21mg/l，1386.93mg/l，通过温室盆栽解磷试验测定和促生作用分析，发现解磷菌株qm-6和qm-10能够将土壤中植物难以吸收利用的无效磷转化为具有可溶性、可以被直接吸收利用的有效磷，能较好的促进植物的生长，对减少磷肥的施用量具有重要的理论和实践意义。

发明人对本发明所公开的青霉菌菌株qm-6和qm-10进行了生物保藏，具体保藏信息如下：

保藏信息

保藏时间：2016年5月27日

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc

保藏编号：cgmccno.12475

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所

分类命名:草酸青霉penicilliumoxalicum

保藏时间：2016年5月27日

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc

保藏编号：cgmccno.12476

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所

分类命名:草酸青霉penicilliumoxalicum

附图说明

图1为青霉菌菌株qm-6和qm-10解磷能力示意图，

将菌株接种到含有难溶性磷酸盐的固体培养基上培养，溶磷圈的大小是表征菌株溶磷能力的一个重要指标，由图可以定性的说明该微生物具有解磷能力；

图2为qm-6和qm-10最大可溶性磷含量检测曲线图，

图中可以看到无机磷液体培养基中qm-6和qm-10可溶性磷含量动态变化，其中qm-6最大可溶性磷含量分别为1239.21mg/l，qm-10最大可溶性磷含量分别为1386.93mg/l；

图3为青霉菌菌株qm-6、qm-10菌丝体及产孢结构微观图；

图中a、c为qm-6的菌丝体及产孢结构；b、d为qm-10的菌丝体及产孢结构；

图4为青霉菌菌株qm-6、qm-10的its序列扩增结果示意图，

图中1为qm-6、2为qm-10，m为2000bpdnamarker，从图中可以看出，两者的片段长度约为550bp左右，符合常规的itsrdna序列长度；

图5为青霉菌菌株qm-6、qm-10的与相关菌株的系统发育树；

从图中可以看出qm-6、qm-10与草酸青霉的遗传进化距离最近，可以确定两者均为草酸青霉菌；

图6为本发明中的磷标准曲线，

图中根据不同浓度的可溶性磷磷对应的不同od值，确定标准曲线方程为：y＝0.528x+0.0007(r²＝0.9999)，其相关系数r²为0.9999，相关性非常高。根据该标准曲线方程以及供试真菌在无机磷液体发酵培养基中的发酵产物的od值，可以计算出培养基中的可溶性磷含量；

图7为qm-6和qm-10对小麦幼苗生长的影响示意图；

图8为qm-6和qm-10对烟草幼苗生长的影响示意图；

从图7、图8可以看出经两种解磷真菌的孢子悬浮液处理后，小麦幼苗和烟草幼苗的生长情况明显优于对照。

具体实施方式

本发明实施例中所采用的培养基如下：

及组分如下：

1.pda培养基：去皮马铃薯200g，葡萄糖16g，琼脂14g，蒸馏水1000ml，121℃高压灭菌25min。

2.无机磷固体培养基：葡萄糖10g，(nh4)2so40.5g，nacl0.3g，kcl0.3g，mgso4·7h2o0.3g，feso4·7h2o0.03g，mnso4·h2o0.03g，ca3(po4)25.0g，琼脂20g，定容至1000ml，ph7.0-7.5。

3.无机磷液体培养基：葡萄糖10g，(nh4)2so40.5g，nacl0.3g，kcl0.3g，mgso4·7h2o0.3g，feso4·7h2o0.03g，mnso4·h2o0.03g，ca3(po4)210.0g，定容至1000ml，ph7.0-7.5。

4.lb固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g,，nacl10g，琼脂15g。

5.lb液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g。

实施例1供试菌株的纯化培养

挑取保存于4℃的供试菌株于pda平板中央培养，抑菌剂为乳酸(25％)，28℃恒温箱中倒置培养，培养3-4d后挑取菌落边缘菌块于pda平板上进行纯化培养。

实施例2：高效解磷菌株的筛选

(一)高效解磷菌株的初筛

将菌株接种到含有难溶性无机磷酸盐的固体培养基上培养，根据菌落的生长情况及菌落周围产生透明圈的大小来定性地检测微生物是否具有解磷能力，具体步骤如下：

刮取菌落到盛有100ml无菌水的300ml三角瓶中，于28℃、160r/min的条件下，振荡30min使孢子团充分散开；用移液枪吸取孢子悬浮液置于血球计数板进行计数，最终得到浓度为10⁸cfu/ml的孢子悬浮液；吸取孢子悬浮液50μl到pda培养基上，然后用无菌涂布器进行涂布，28℃恒温箱中倒置培养3d；用直径为0.7cm的打孔器打取菌饼并接种到无机磷固体培养基中，3次重复，28℃恒温倒置培养7d，以无解磷能力的菌株作为对照；将有透明圈的菌落转接到冻存管中，4℃保存备用；

(二)高效解磷菌株的复筛

将初筛获得菌株制备成浓度为10⁸cfu/ml的孢子悬浮液，并按3vt％的接种量接种于装有100ml无机磷液体培养基的300ml三角瓶中，28℃、180r/min振荡培养。分别在24、48、72、96、120、144、168h时取出用高速冷冻离心机进行离心，取上清液备用；

采用钼锑抗比色法测定上清液中的可溶性磷含量，具体方法如下：

标准曲线的建立：(如图6所示)

分别准确吸取5mg/l的磷标准液0ml、2ml、4ml、6ml、8ml、10ml于50ml容量瓶中，加水定容至30ml，每个容量瓶中滴加两滴2,4-二硝基苯酚指示剂，用稀h2so4和10％的naoh溶液调节ph值至溶液呈微黄色，然后加入钼锑抗试剂5.0ml，最后加水定容至50ml，摇匀。放置30分钟待反应充分，在700nm下进行比色测定其吸光值，以吸光度为纵坐标，磷浓度(ug/ml)为横坐标,绘制标准曲线。利用标准曲线生成方程为：y＝0.528x+0.0007(r²＝0.9999)，其相关系数r²为0.9999，由此可知，该标准曲线线性良好，可以使用；

将10ml0.5mol/l的碳酸氢钠加入三角瓶中，加入两滴2,4-二硝基苯酚作为指示剂(用稀h2so4和10％的naoh溶液调节ph值至溶液呈微黄色)，再用滴定管准确加入蒸馏水35.0ml，然后加入钼锑抗试剂5.0ml，加入上清液，并定容至50ml，摇匀，放置30分钟待反应充分，在700nm下进行比色，以空白液的吸收值为0，读取待测液的吸收值，通过有效磷含量标准曲线计算溶液中有效磷含量，以确定菌株对ca3(po4)2的溶磷能力，进而得到qm-6、qm-10的解磷能力较高的菌株，这两个菌株对应的最大可溶性磷含量分别为1239.21mg/l，1386.93mg/l(如图2所示)，其解磷能力如图1所示。

实施例3：供试真菌的菌株鉴定

将解磷真菌菌株qm-6、qm-10在pda平板上于生化培养箱内培养一周左右，然后观察其菌落形态、菌落的色素产生等情况。挑取少量菌丝以乳酚油为浮载剂制作玻片，于olympus显微镜下观察小孢子的形态及着生方式，分生孢子梗的形态。参考中国真菌志(第三十五卷)-青霉属及其相关有性属、《真菌鉴定手册》，对形态进行观察。

常规方法提取解磷真菌菌株qm-6、qm-10的基因组dna，以提取到的dna为模板，pcr扩增菌株its序列。pcr的引物为：

its1序列为：5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’，其核苷酸序列如seqidno.1所示；

its4序列为：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’，其核苷酸序列如seqidno.2所示；

选用25μl反应体系，各组分的成分如下:

扩增反应条件：

最终得到两株高效解磷真菌菌株的its片段长度分布约为550bp(如图4所示)，其中qm-6its序列如核苷酸序列如seqidno.3所示；qm-10its序列如核苷酸序列如seqidno.4所示；

itsrdna测序结果在genbank数据库中进行blast比对，从结果中选取8株与测定菌株序列相似性高的菌株进行系统发育分析，用mega5.05软件采取neighbor-joining法构建系统进化树(见图5)。

由图可以看出筛选得到的两株高效解磷真菌菌株与已知菌株草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)njdl-03的同源性达到100％。结合其菌体形态和菌落特征观察结果，将其鉴定为草酸青霉(penicilliumoxalicum)，并对其进行生物保藏。

实施例4：菌剂处理对小麦生长的影响

菌剂的制备：在无菌条件下分别刮取qm-6、qm-10菌株菌落于盛有100ml无菌水的300ml三角瓶中，于28℃、160r/min的条件下，振荡30min使孢子团充分散开。用移液枪吸取孢子悬浮液置于血球计数板进行计数，使孢子悬浮液浓度达到10⁸cfu/ml，备用。

每个花盆装500g按照1:1配比混合均匀的土与基质，200mg难溶磷源，每盆播种10粒经过催芽处理的小麦种子，每个处理5个重复。将备好的qm-6和qm-10孢子悬浮液浇灌于小麦根部土壤中，每盆10ml，以清水同样处理为对照，每隔7d处理一次，共处理三次，45d后检测植株的地上部鲜重、地下部鲜重及株高，结果如表2，用消煮钒钼黄比色法测定植株及土壤中的全磷含量，结果如表3。

表2各处理对小麦生长的影响

由表2可见，经qm-6和qm-10孢子悬浮液10ml处理后，小麦株高分别为36.50cm和36.25cm，分别比对照增加5.8％和5.1％，小麦地上部鲜重经孢子悬浮液处理后都比对照明显增加，分别增加16.0％和13.9％。与对照相比，根部鲜重也明显增加，分别增加31.1％和14.2％。可见经qm-6和qm-10孢子悬浮液处理后，小麦的生长情况优于对照(如图7所示)。经差异显著性检验，发现两个处理间及处理与对照间，差异均达到显著水平。

表3各处理对小麦和土壤有效磷含量的影响

qm-10孢子悬浮液10ml处理后，总有效磷含量明显增加，分别比对照增加77.4％和94.1％。其中地上部植株全磷含量分别比对照增加45.1％和34.5％，土壤有效磷含量分别比对照增加109.4％和149.0％。可见经qm-6和qm-10孢子悬浮液可以有效将土壤中的无效磷转化为有效磷。经差异显著性分析，发现两种处理与对照相比，均达到显著差异水平。

实施例5：菌剂处理对烟草幼苗生长的影响

菌剂的制备同实施例4所示。每个花盆装500g按照1:1配比混合均匀的土与基质，200mg难溶磷源，选择长势一致的4-5叶期的烟草幼苗移栽至上述花盆中，每个处理5个重复。分别将实施例4中准备好的qm-6和qm-10孢子悬浮液浇灌于烟草根部土壤中，每盆10ml，以清水同样处理为对照，每隔7d处理一次，共处理三次，45d后检测烟草幼苗的的地上部鲜重、地下部鲜重及株高，结果如表3，用消煮钒钼黄比色法测定植株及土壤中的全磷含量，结果如表4。

表4各处理对烟草幼苗生长的影响

由表4可见，经qm-6和qm-10孢子悬浮液10ml处理后，烟草幼苗株高分别为50cm和56.5cm，分别比对照增加23.5％和39.5％，烟草幼苗茎围部鲜重经孢子悬浮液处理后都比对照明显增加，增加14.3％。与对照相比，处理组幼苗的最大叶长和叶宽也明显增加。可见经qm-6和qm-10孢子悬浮液处理后，烟草幼苗的生长情况优于对照组(如图8所示)。经差异显著性检验，发现两种处理与对照相比，均达到显著差异水平。

表5各处理对烟草幼苗和土壤有效磷含量的影响

由表5可见，经qm-6和qm-10孢子悬浮液10ml处理后，烟草植株有效磷含量明显增加，其中叶片全磷含量分别比对照增加12.5％和18.1％，茎有效磷含量分别比对照增加14.8％和19.5％。根部及土壤中的有效磷含量也明显高于对照组，可见经qm-6和qm-10孢子悬浮液可以有效将土壤中的无效磷转化为有效磷。经差异显著性检验，发现两种处理间及处理与对照相比，均达到显著差异水平。

综上所述，qm-6和qm-10孢子悬浮液对小麦幼苗及烟草幼苗的生长有明显的促进作用；qm-6和qm-10孢子悬浮液处理可明显提高植株体内及土壤中的有效磷含量；使其可以作为一种解磷促生菌剂在农业生产中发挥重要的作用。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

<110>山东农业大学

<120>解磷青霉菌及其应用

<160>4

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

tccgtaggtgaacctgcgg19

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tcctccgcttattgatatgc20

<210>3

<211>549

<212>dna

<213>草酸青霉菌penicilliumoxalicum

<400>3

gacctctgggtcacctcccacccgtgtttatcgtaccttgttgcttcggcgggcccgcct60

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<213>草酸青霉菌penicilliumoxalicum

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