促进冬虫夏草芽孢发育成菌丝的方法与流程

本发明属于真菌培养
技术领域：
，具体涉及一种促进冬虫夏草芽孢发育成菌丝的方法。
背景技术：
：冬虫夏草Ophiocordycepssinensis是我国一种传统的名贵中药材，是一种昆虫与真菌的结合体。虫是虫草蝙蝠蛾的幼虫，菌是冬虫夏草真菌。冬虫夏草的形成是由夏天冬虫夏草真菌感染蝠蛾幼虫，菌丝吸取幼虫体内的营养并逐渐充满虫体，直至第二年春夏从虫体头部长出形成子实体。由于近年人工采挖活动的增多，野生冬虫夏草数量骤减，产地植被遭受到了巨大的破坏。现今人工冬虫夏草已经可以成功培育，但产量不高。其中一个制约因素是：在蝠蛾幼虫感染冬虫夏草真菌后，真菌在蝠蛾幼虫体内以芽生孢子(芽孢)形式存在，并以芽孢萌发产生新的芽孢的方式进行繁殖。所谓的芽孢，是指冬虫夏草在侵染寄主幼虫后，在幼虫体内形成大量类似孢子的长梭形细胞。自然情况下，芽孢萌发成菌丝的过程会历经很长时间，一般需要10天左右。而幼虫体内芽孢发育成菌丝是幼虫产生子实体原基(产生并分化为子实体的菌丝结构)的必经环节，因此，缩短这一环节的时间至关重要。技术实现要素：本发明要解决的技术问题为：现有冬虫夏草芽孢萌发成菌丝的时间长，人工培育冬虫夏草周期长,效率低的问题。本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种促进冬虫夏草芽孢发育成菌丝的方法。该方法包括以下步骤：a、芽孢的培养与纯化取含有冬虫夏草芽孢的菌液，接种于液体培养基中培养3～5天，滤网过滤，得到芽孢培养液；所述菌液与液体培养的体积比为0.1～1﹕5～20；b、芽孢的诱导将步骤a所得的芽孢培养液接种于液体培养基中，加入植物激素后培养1～2天，得到萌发的菌丝；所述芽孢培养液与液体培养基的体积比为0.3～1﹕10～30。其中，上述促进冬虫夏草芽孢发育成菌丝的方法中，步骤a中所述的菌液中冬虫夏草真菌含量不小于103个/ml。其中，上述促进冬虫夏草芽孢发育成菌丝的方法中，步骤a中所述滤网为100～1000目的滤网。其中，上述促进冬虫夏草芽孢发育成菌丝的方法中，步骤a、b中所述的液体培养基组成为：每升液体培养基中含葡萄糖5～30g,酵母粉5～20g,蛋白胨4～20g,磷酸二氢钾0.25～5g,硫酸镁0.25～5g,余量为水。优选的，上述促进冬虫夏草芽孢发育成菌丝的方法中，步骤a、b中所述的液体培养基组成为：每升液体培养基中含葡萄糖30g,酵母粉10g,蛋白胨5g,磷酸二氢钾1g,硫酸镁0.5g,余量为水。其中，上述促进冬虫夏草芽孢发育成菌丝的方法中，步骤a、b中所述的培养温度为10～25℃，培养时置于50～200rpm转速的摇床中。其中，上述促进冬虫夏草芽孢发育成菌丝的方法中，步骤b中所述的植物激素为环腺苷酸或吲哚乙酸。优选的，上述促进冬虫夏草芽孢发育成菌丝的方法中，步骤b中所述环腺苷酸加入后的终浓度为5～40ppm，所述吲哚乙酸加入后的终浓度为5～20ppm。本发明的有益效果为：本发明提供了一种冬虫夏草芽孢的体外诱导萌发方法，该方法通过选择适宜的培养基，添加环腺苷酸或吲哚乙酸对冬虫夏草芽孢进行诱导，能使芽孢48h内即可萌发成菌丝，缩短了芽孢萌发时间，从而为缩短人工培育冬虫夏草时间提供了相应的技术指导，具有重要的经济效益。附图说明图1所示为用10ppm吲哚乙酸处理冬虫夏草芽孢，48h后得到的电镜图；图2所示为用10ppm环腺苷酸处理冬虫夏草芽孢，48h后得到的电镜图；图3所示为用10ppm无菌水处理冬虫夏草芽孢，48h后得到的电镜图；图4所示为冬虫夏草芽孢在蝠蛾体内10天后，得到的电镜图。具体实施方式本发明提供一种促进冬虫夏草芽孢发育成菌丝的方法，包括以下步骤：a、芽孢的培养与纯化取含有冬虫夏草芽孢的菌液，接种于液体培养基中培养3～5天，滤网过滤，得到芽孢培养液；所述菌液与液体培养的体积比为0.1～1﹕5～20；b、芽孢的诱导将步骤a所得的芽孢培养液接种于液体培养基中，加入植物激素后培养1～2天，得到萌发的菌丝；所述芽孢培养液与液体培养基的体积比为0.3～1﹕10～30。其中，上述促进冬虫夏草芽孢发育成菌丝的方法中，步骤a中所述的菌液中冬虫夏草真菌含量不小于103个/ml。其中，上述促进冬虫夏草芽孢发育成菌丝的方法中，步骤a、b中所述的液体培养基组成为：每升液体培养基中含葡萄糖5～30g,酵母粉5～20g,蛋白胨4～20g,磷酸二氢钾0.25～5g,硫酸镁0.25～5g,余量为水。优选的，上述促进冬虫夏草芽孢发育成菌丝的方法中，步骤a、b中所述的液体培养基组成为：每升液体培养基中含葡萄糖30g,酵母粉10g,蛋白胨5g,磷酸二氢钾1g,硫酸镁0.5g,余量为水。其中，上述促进冬虫夏草芽孢发育成菌丝的方法中，步骤a中所述滤网为100～1000目的滤网。其中，上述促进冬虫夏草芽孢发育成菌丝的方法中，步骤a、b中所述的培养温度为10～25℃，培养时置于50～200rpm转速的摇床中。其中，上述促进冬虫夏草芽孢发育成菌丝的方法中，步骤b中所述的植物激素为环腺苷酸或吲哚乙酸。优选的，上述促进冬虫夏草芽孢发育成菌丝的方法中，步骤b中所述环腺苷酸加入后的终浓度为5～40ppm，所述吲哚乙酸加入后的终浓度为5～20ppm。本发明主要采用吲哚乙酸或环腺苷酸促进冬虫夏草芽孢发育成菌丝，吲哚乙酸是一种植物体内普遍存在的内源生长素，具有促进植物茎叶生长、生根及细胞分化等作用；环腺苷酸是一种具有细胞内信息传递作用的小分子，又被称为细胞内信使和第二信使，具有调节细胞代谢的作用。但现有技术中未见有将吲哚乙酸和环腺苷酸用在冬虫夏草芽孢发育上的报道。本发明发明人在长期实践中，筛选出玉米素，环腺苷酸，吲哚乙酸，激动素四种植物激素，分别用于诱导冬虫夏草芽孢。所述玉米素为一种白色粉末，是一种天然的植物分裂素；激动素又称6-糖基氨基嘌呤，是一种人工合成的植物激素，呈白色结晶型粉末，不溶于水。发明人试验时，将激动素和玉米素溶于乙酸、环腺苷酸溶于水、吲哚乙酸溶于乙醇，分别配制成1g/L的植物激素母液。具体的实验操作过程如下：a、芽孢的培养与纯化取含有冬虫夏草芽孢的菌液1ml，接种于液体培养基20ml中，于15℃，100rpm转速下培养5天，用500目滤网过滤菌液，收集纯化芽孢培养液；b、芽孢的诱导取步骤a所得的纯化芽孢培养液，接种于20ml液体培养基中，加入植物激素母液，于15℃，100rpm转速下培养2天后观察菌丝；所述的液体培养基的组成为：葡萄糖30g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨5g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁0.5g/L。筛选实验结果见下表1。表1用不同的植物激素处理冬虫夏草芽孢的结果5ppm10ppm20ppm40ppm玉米素----环腺苷酸++++++++吲哚乙酸++++++-激动素----表1中：“-”表示在放大10×10倍的显微镜视野下没有萌发的菌丝；“+”表示在放大10×10倍的显微镜视野下有1～5根萌发的菌丝；“++”表示在放大10×10倍的显微镜视野下有5～10根萌发的菌丝，部分菌丝有分叉结构出现；“+++”表示在放大10×10倍的显微镜视野下有10根以上萌发的菌丝，并有菌丝团出现。下面通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。实施例1用本发明方法促进冬虫夏草芽孢发育成菌丝具体操作过程如下：a、芽孢的培养与纯化取含有冬虫夏草真菌含量不小于103个/ml的菌液0.5ml，接种于15ml液体培养基中，于15℃，100rpm转速下培养3天，用100目的滤网过滤，得到芽孢培养液；每升液体培养基中含葡萄糖30g,酵母粉20g,蛋白胨20g,磷酸二氢钾5g,硫酸镁5g,余量为水；b、芽孢的诱导将步骤a所得的芽孢培养液接种于液体培养基中，加入吲哚乙酸，使吲哚乙酸的终浓度为10ppm，于15℃，100rpm转速下培养48h后，置于电镜中观察，得到电镜图1。实施例2用本发明方法促进冬虫夏草芽孢发育成菌丝具体操作过程如下：a、芽孢的培养与纯化取含有冬虫夏草真菌含量不小于103个/ml的菌液0.5ml，接种于15ml液体培养基中，于25℃，200rpm转速下培养5天，用1000目的滤网过滤，得到芽孢培养液；每升液体培养基中含葡萄糖30g,酵母粉10g,蛋白胨5g,磷酸二氢钾1g,硫酸镁0.5g,余量为水；b、芽孢的诱导将步骤a所得的芽孢培养液接种于液体培养基中，加入环腺苷酸，使环腺苷酸的终浓度为10ppm，于25℃，200rpm转速下培养48h后，置于电镜中观察，得到电镜图2。对比例1用无菌水处理冬虫夏草芽孢具体操作过程如下：a、芽孢的培养与纯化取含有冬虫夏草真菌含量不小于103个/ml的菌液0.5ml，接种于15ml液体培养基中，于25℃，200rpm转速下培养5天，用1000目的滤网过滤，得到芽孢培养液；每升液体培养基中含葡萄糖30g,酵母粉10g,蛋白胨5g,磷酸二氢钾1g,硫酸镁0.5g,余量为水；b、芽孢的诱导将步骤a所得的芽孢培养液接种于液体培养基中，加入无菌水，无菌水加入量同实施例2，于25℃，50～200rpm转速下培养48h后，置于电镜中观察，得到电镜图3。对比例2自然状态下冬虫夏草芽孢发育成菌丝另一部分未从蝠蛾体内取出的冬虫夏草芽孢，继续在蝠蛾体内培育10天后，开始出现萌发，得到电镜图4。由实施例和对比例可知，体外液体培养冬虫夏草芽孢，可促进芽孢萌发，减少萌发时间，尤其是采用吲哚乙酸或环腺苷酸诱导后，冬虫夏草芽孢的萌发时间可缩短至48h以内，有效的减少了冬虫夏草芽孢萌发成菌丝的时间，为缩短人工培育冬虫夏草的时间提供了技术支持。当前第1页1 2 3