本发明属于生物工程
技术领域：
，具体涉及一种冬虫夏草原生质体的制备方法。
背景技术：
：冬虫夏草真菌是一种名贵的药用真菌。由于近年人工采挖活动的增多，野生冬虫夏草数量骤减，产地植被遭受到了巨大破坏。现今人工冬虫夏草已经可以成功培育，但产量不高，其中一个制约因素是冬虫夏草真菌生性严格，是一种生长缓慢的低温菌，给人工培育带来了很大困难。因此，冬虫夏草菌种的改造势在必行，而冬虫夏草原生质体的制备，不仅可以为冬虫夏草原生质体的诱变和再生提供技术支持，还可以为冬虫夏草真菌和其它虫草真菌的融合提供参考。现有技术中制备冬虫夏草原生质体的方法要么不能成功制备，要么制备量偏低，难以满足生产需要。技术实现要素：本发明要解决的技术问题为：现有冬虫夏草原生质体制备方法产量低的问题。本发明解决技术问题的技术方案为：提供一种冬虫夏草原生质体的制备方法。该方法包括以下步骤：a、菌丝的培养与纯化取冬虫夏草菌丝体，接种于液体培养基上，于10～25℃，50～200rpm转速下培养5～9天，用滤纸过滤，沉淀用0.3～0.6mol/L氯化钾溶液洗涤2～3次，收集得到纯化后的菌丝体；b、原生质体的制备向步骤a得到的冬虫夏草菌丝体中加入复合酶液，于20～35℃下间断混合酶解4～6h；所述复合酶液为以0.55～0.65mol/L氯化钾溶液作为缓冲试剂，配制的溶壁酶和纤维素酶终浓度分别为1.8～2.2％和0.8～1.2％的混合液体。其中，上述冬虫夏草原生质体的制备方法中，步骤a中所述的液体培养基组成为：每升培养基含葡萄糖5～30g，酵母粉5～20g，蛋白胨4～20g，磷酸二氢钾0.25～5g，硫酸镁0.25～5g，余量为水。其中，上述冬虫夏草原生质体的制备方法中，步骤b中所述冬虫夏草菌丝体与复合酶液的添加量为：每500mg菌丝体中加入0.5～3ml复合酶液。其中，上述冬虫夏草原生质体的制备方法中，步骤b中所述冬虫夏草菌丝体与复合酶液的添加量为：每500mg菌丝体中加入0.5～3ml复合酶液。优选的，上述冬虫夏草原生质体的制备方法中，步骤b中所述冬虫夏草菌丝体与复合酶液的添加量为：每500mg菌丝体中加入1ml复合酶液。其中，上述冬虫夏草原生质体的制备方法中，所述的间断混合酶解是指酶解过程中，每隔20～30min颠倒混匀一次。优选的，上述冬虫夏草原生质体的制备方法中，步骤b中加入复合酶液后，于26℃下间断混合酶解6h。本发明的有益效果为：本发明提供了一种冬虫夏草原生质体的制备方法，通过以0.6mol/L氯化钾溶液为渗透剂，以2％溶壁酶和1％纤维素酶作为复合酶进行酶解，能够制备得到含量高的冬虫夏草原生质体。本发明方法操作简单，便于推广实施。说明书附图图1所示为实施例制备得到的冬虫夏草原生质体电镜图。具体实施方式本发明提供一种冬虫夏草原生质体的制备方法，包括以下步骤：a、菌丝的培养与纯化取冬虫夏草菌丝体，接种于液体培养基上，于10～25℃，50～200rpm转速下培养5～9天，用滤纸过滤，沉淀用0.3～0.6mol/L氯化钾溶液洗涤2～3次，收集得到纯化后的菌丝体；所述液体培养基组成为：每升培养基含葡萄糖5～30g,酵母粉5～20g,蛋白胨4～20g,磷酸二氢钾0.25～5g,硫酸镁0.25～5g,余量为水；b、原生质体的制备向步骤a得到的冬虫夏草菌丝体中加入复合酶液，每500mg菌丝体中加入0.5～3ml，于20～35℃下间断混合酶解4～6h,每隔20～30min颠倒混匀一次；所述复合酶液为以0.55～0.65mol/L氯化钾溶液作为缓冲试剂，配制的溶壁酶和纤维素酶终浓度分别为1.8～2.2％和0.8～1.2％的混合液体。为了制备大量的冬虫夏草原生质体，细胞壁溶解至关重要。现有研究发现：真菌细胞壁的主要成分是多糖，另有少量的蛋白质和脂类。不同的真菌，其细胞壁所含多糖的种类也不同，在低等真菌中，以纤维素为主，酵母菌以葡聚糖为主，而高等陆生真菌则以几丁质为主。溶解真菌细胞壁的酶种类繁多，每种酶对冬虫夏草细胞壁的溶解效率也不一致。为了更好的溶解冬虫夏草的细胞壁，发明人进行了如下所示的筛选实验。经过试验筛选，发明人选择溶壁酶，溶菌酶，蜗牛酶和纤维素酶进行不同剂量的组合，来筛选制备冬虫夏草原生质体的适宜组合。其中，溶壁酶是真菌细胞壁溶解酶的简称，是一种复合型水解酶，能分解真菌细胞壁，获得高产、优质的原生质体。溶菌酶又称胞壁质酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。纤维素酶，是由多种水解酶组成的一个复杂酶系，也能溶解真菌细胞壁。蜗牛酶，是一种褐色结晶性粉末，是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶，近年来广泛用于细胞生物学和基因工程学的研究。筛选实验1复合酶种类的剂量筛选具体操作步骤如下：a、菌丝的培养与纯化取冬虫夏草菌丝体，接种于液体培养基中(每升含葡萄糖30g,酵母粉20g,蛋白胨20g,磷酸二氢钾5g,硫酸镁5g,余量为水)，于18℃，100rpm转速下培养7天，用滤纸过滤，0.6mol/L氯化钾溶液洗涤3次后收集菌丝体；b、原生质体的制备向步骤a得到的冬虫夏草菌丝体中加入复合酶液，每500mg菌丝体中加入1ml，于26℃下间断混合酶解6h，每隔30min颠倒混匀一次。复合酶液的组成和冬虫夏草原生质体得率如下表1所示。表1不同复合酶酶解得到的冬虫夏草原生质体由筛选实验1可看出，并不是任意选择的复合酶都能制备得到冬虫夏草原生质体，并且，不同组合得到的冬虫夏草原生质体得率差别也很大。由筛选实验可知，当采用终浓度为2％的溶壁酶和终浓度为1％的纤维素酶组合成复合酶时，冬虫夏草原生质体得率最高。筛选实验2缓冲剂种类剂量筛选除复合酶的种类和组成外，配制复合酶的缓冲液在冬虫夏草原生质体制备时也非常重要，发明人分别采用0.6mol/L的氯化钾、蔗糖、甘露聚糖分别配制复合酶液，用以制备冬虫夏草原生质体，得到如下表2所示的实验结果。表2不同缓冲试剂对冬虫夏草原生质体得率的影响缓冲试剂(0.6mol/L)原生质体得率氯化钾1.85×108/ml蔗糖0/ml甘露醇2.575×106/ml由筛选实验2可看出，采用0.6mol/L的氯化钾作为缓冲试剂配制复合酶时，冬虫夏草原生质体得率最高。筛选实验3酶解条件筛选为了制备得到高含量的冬虫夏草原生质体，需要筛选合适的酶解时间和温度，发明人进行了如下实验。将洗涤过滤后的冬虫夏草菌丝体，加入复合酶液(0.6mol/L氯化钾溶液作为缓冲液，溶壁酶和纤维素酶按照终浓度2％和1％)，于不同条件下(见表3)间断混合酶解(间断混合酶解的具体操作是每隔30min颠倒混匀一次)。表3不同酶解温度和时间对冬虫夏草原生质体得率的影响温度(℃)时间(h)原生质体得率2661.45×108/ml2751.15×105/ml2842.625×104/ml2930/ml3020/ml由筛选实验3可看出，当酶解时间为26℃，酶解6h时，冬虫夏草原生质体得率最高。下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。实施例采用本发明方法制备冬虫夏草原生质体具体操作步骤如下：a、菌丝的培养与纯化取冬虫夏草菌丝体，接种于液体培养基上，于25℃，100rpm转速下培养7天，用滤纸过滤，沉淀用0.6mol/L氯化钾溶液洗涤3次，收集得到纯化后的菌丝体；所述液体培养基组成为：每升培养基含葡萄糖30g,酵母粉20g,蛋白胨20g,磷酸二氢钾5g,硫酸镁5g,余量为水；b、原生质体的制备向步骤a得到的冬虫夏草菌丝体中加入复合酶液，每500mg菌丝体中加入1ml，于26℃下间断混合酶解6h，每隔30min颠倒混匀一次；所述复合酶液是将溶壁酶和纤维素酶溶解于0.6mol/L氯化钾溶液中，使溶壁酶和纤维素酶的终浓度达到2％和1％配制而成。实施例中的冬虫夏草原生质体得率为1.6×108/ml。采用显微镜放大200倍观察实施例所得原生质体，得到图1所示的实验结果。由图1可看出，用发明方法制备得到的冬虫夏草原生质体数量多，体积大，细胞结构完整。由实施例可知，本发明以0.6mol/L氯化钾溶液为渗透剂，以终浓度为2％的溶壁酶和终浓度为1％的纤维素酶混合成复合酶液，在26℃下间断混合酶解6h，能够制备得到含量最高的冬虫夏草原生质体。制备得到的原生质体大小1～2μm，浓度为1.6×108/ml。说明采用本发明方法能制备得到高含量的冬虫夏草原生质体，本发明方法值得推广实施。当前第1页1 2 3