本发明涉及微生物
技术领域：
，具体涉及微生物筛选、菌种鉴定及发酵产酶相关领域，特别是提供了一种产高活力单宁酶菌株及其制备方法。
背景技术：
：单宁酶（Tannase,E.C.3.1.1.20），即单宁酰基水解酶，是一种诱导型细胞膜结合酶，可水解没食子酰单宁及没食子酸烷基酯，生成没食子酸、葡萄糖及烷基醇等小分子物质。基于对单宁物质的高效水解作用，单宁酶在食品、饮料、酿酒、医药、化工、制革及污水处理等领域得到了广泛的应用研究，并已商业化用于去除速溶茶生产中的“茶乳酪”沉淀物。然而，由于目前单宁酶生产效率普遍较低，生产成本较高，因而高昂的市场价格限制了单宁酶的规模化工业应用。经文献查新得知，目前单宁酶主要通过微生物发酵生产，尤其对曲霉和青霉发酵生产单宁酶的报道较多。但目前存在着这些微生物大多产酶不高，尤其是国内对产高活力单宁酶菌株缺乏自主知识产权等问题。本申请的发明人早前申请的CN201310153857.2报道了一种菌株黑曲霉T3-5-1，CN201410121620.0报道了一种菌株黑曲霉N5，二者生产单宁酶均采用的是液态发酵技术，其中黑曲霉T3-5-1所产单宁酶比活力为5304.53U/mg，比美国Sigma公司所产单宁酶的比活力（1788.15U/mg）高3516.38U/mg，黑曲霉N5所产单宁酶比活力为6546.78U/mg，比美国Sigma公司所产单宁酶的比活力（3185.25U/mg）高3361.53U/mg。但上述液态发酵生产的单宁酶主要为胞内酶，因此提酶之前需要先做细胞破壁处理，使单宁酶流出后再提取，工艺相对复杂，而且所产单宁酶比活力也有待进一步提高。技术实现要素：本发明目的是针对以上存在的问题，提供一种产高活力单宁酶菌株的制备方法，从而提高发酵单宁酶活力，解决当前单宁酶工艺相对复杂、生产效率较低的问题。本发明筛选出的一株产高活力单宁酶菌株，经菌种鉴定为黑曲霉（Aspergilluseniger），命名为黑曲霉N5-5，2014年2月28日起，由中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保存，保藏编号CCTCCNO：M2014051。本发明菌株的制备方法包括以下步骤：（1）取2g角倍，用5mLdd水冲洗，收集冲洗液至50mL三角瓶中，用dd水定容并摇匀，得到10-1的菌溶液，梯度稀释至10-10，各梯度菌溶液于筛选培养基上涂平板2个，28℃恒温培养60h，挑取平板上菌落及水解圈较大的单菌落，分别接于PDA斜面活化84h；（2）将活化后的PDA斜面上的孢子，用dd水配成2×106个/mL的孢子液，然后接种lmL于50mL固态发酵培养基中，28℃恒温培养84h，然后进行单宁酶提取及酶活力测定，通过比较酶活力确定产单宁酶活力最高的菌株。步骤（1）中，所述筛选培养基由以下组分配制而成：硝酸铵1.20g，氯化锰0.025g，七水硫酸镁0.005g，磷酸二氢钾0.005g，琼脂28.00g，单宁酸2.50g，用dd水溶解后定容至1L。步骤（2）中，所述固态发酵培养基由以下组分配制而成：麸皮9.25g，单宁酸0.75g，硝酸铵1.20g，氯化锰0.025g，七水硫酸镁0.005g，磷酸二氢钾0.005g，用dd水溶解后定容至1L。步骤（2）中，所述单宁酶提取及酶活力测定方法，包括以下步骤：a、往发酵结束后的三角瓶中加入100mLdd水，28℃，150r/min振荡30min，然后将混合液倒出，用四层纱布过滤，将滤液收集并于5000r/min离心10min，收集上清液即为单宁酶酶液。b、取5支2mL的EP管，设定1支对照管、1支空白管及3支测定管。每管加入0.3mL酶液，45°C金属浴恒温15min。然后各测定管加入0.1mL没食子酸丙酯标准液，空白管中加dd水0.1mL，对照管加95%乙醇0.6mL，反应20min。然后测定管和空白管分别加95%乙醇0.6mL以终止酶促反应。对照管加没食子酸丙酯标准液0.1mL。冷却后，将各管溶液稀释10倍。275nm波长处测定各管溶液吸光度值。酶活力定义：45°C，1mL酶液每分钟水解没食子酸丙酯标准液，导致吸光度值减少0.001个吸收值的酶活力定义为1个酶活力单位（U）。据此定义，可得酶活力计算公式：酶活力（U/mL）=(A对-A测)×2.5×103，其中，A对和A测分别为对照管和测定管溶液的吸光度值。所述没食子酸丙酯标准液配制方法为：准确称取0.4244g没食子酸丙酯，用dd水定容至1000mL，即得2mmol/L的没食子酸丙酯标准液。本发明菌株的鉴定方法包括形态学鉴定和分子生物学鉴定。其中，形态学鉴定通过观察菌落特征和细胞形态进行初步鉴定；分子生物学鉴定通过提取菌株基因组DNA和菌种18SrDNA片段PCR扩增、测序及比较分析作出最终鉴定。本发明采用固态发酵技术生产单宁酶，所产单宁酶比活力高达8658.37U/mg，比美国Sigma公司所产单宁酶的比活力（3185.25U/mg）高5473.12U/mg。可见，利用本发明的菌株通过固态发酵生产的单宁酶比活力远高于此前报道的菌株通过液态发酵生产的单宁酶比活力。另外，液态发酵生产的单宁酶主要为胞内酶，因此提酶之前需要先做细胞破壁处理，使单宁酶流出后再提取；而固态发酵生产的单宁酶主要为胞外酶，发酵结束后可直接提取，因而工艺简单，节约时间。具体实施方式为使本领域技术人员进一步了解本发明，下面列举本发明的具体实施例，详细阐述本发明的技术方案。需要强调的是，实施例并非本发明技术方案所有可能实施方式的穷举，故不用于限制本发明的保护范围。实施例1材料与方法1.1材料与试剂1.1.1材料角倍，张家界久瑞生物科技有限公司提供。1.1.2试剂没食子酸，没食子酸丙酯，湖南省林产化工工程重点实验室提供，纯度≥99%；麸皮，广州绿萃生物科技有限公司提供，水分含量5.24%；PDA培养基，察氏培养基，广东环凯微生物科技有限公司；单宁酸，95%乙醇，硝酸铵，磷酸二氢钾，氯化钾，七水硫酸镁，氯化锰，苯酚，乳酸，甘油，棉蓝，溴酚蓝，琼脂均为分析纯，广州化学试剂厂；真菌基因组DNA提取试剂盒，Solarbio公司；D-2000DNA分子量标准Marker，LATaqDNA聚合酶，GCbufferI增强型PCRbuffer，dNTPs，Takara公司；扩增引物，上海吉美生物工程有限公司；琼脂糖凝胶，西班牙Biowest公司；II型Goldview，北京优尼康生物科技有限公司。1.1.3培养基配制筛选培养基：硝酸铵1.20g，氯化锰0.025g，七水硫酸镁0.005g，磷酸二氢钾0.005g，琼脂28.00g，单宁酸2.50g，用dd水溶解并定容至1L。固态发酵培养基：麸皮9.25g，dd水1mL，单宁酸0.75g，硝酸铵1.20g，氯化锰0.025g，七水硫酸镁0.005g，磷酸二氢钾0.005g。1.1.4主要溶液配制(1)没食子酸丙酯标准液准确称取0.4244g没食子酸丙酯，用dd水定容至1L，即得2mmol/L的没食子酸丙酯标准液。(2)棉蓝乳酚油染液10g苯酚置于40mL水中，加热溶解，再加入10g乳酸(密度为1.21kg/m3)和20g甘油(密度1.21kg/m3)，再加入0.05g棉蓝。1.2实验方法1.2.1产单宁酶菌株的筛选(1)取2g角倍，用5mLdd水冲洗，收集冲洗液至50mL三角瓶中，用双蒸水定容并摇匀，得到10-1的菌溶液，梯度稀释至10-10，各梯度菌溶液于筛选培养基上涂平板2个，28℃恒温培养60h，挑取平板上菌落及水解圈较大的单菌落（共6个，编号N5-1~N5-6）分别接于PDA斜面活化84h。(2)将活化后的PDA斜面上的孢子，用dd水配成2×106个/mL的孢子液，然后接种lmL于50mL固态发酵培养基（置于250mL三角瓶）中，28℃恒温培养84h，提取单宁酶并测其活力，通过比较酶活力确定产单宁酶活力最高的菌株。1.2.2单宁酶提取及酶活力测定(1)单宁酶提取往发酵结束后的三角瓶中加入100mLdd水，28℃，150r/min振荡30min，然后将混合液倒出，用四层纱布过滤，收集滤液于5000r/min离心10min，收集上清液即为单宁酶酶液。(2)单宁酶活力测定取5支2mL的EP管，设定1支对照管、1支空白管及3支测定管。每管加入0.3mL酶液，45°C金属浴恒温15min。然后各测定管加入0.1mL没食子酸丙酯标准液，空白管中加dd水0.1mL，对照管加95%乙醇0.6mL，反应20min。然后测定管和空白管分别加95%乙醇0.6mL以终止酶促反应。对照管加没食子酸丙酯标准液0.1mL。冷却后，将各管溶液稀释10倍。275nm波长处测定各管溶液吸光度值。(3)酶活力定义45°C，1mL酶液每分钟水解没食子酸丙酯标准液，导致吸光度值减少0.001个吸收值的酶活力定义为1个酶活力单位（U）。据此定义，可得酶活力计算公式：酶活力（U/mL）=(A对-A测)×2.5×103，其中，A对和A测分别为对照管和测定管溶液的吸光度值。(5)酶活力计算根据酶活力定义，可得酶活力计算公式：酶活力（U/mL）=(A对-A测)×2.5×103，其中，A对和A测分别为对照管和测定管溶液的吸光度值。1.2.3菌种鉴定1.2.3.1形态学鉴定(1)菌落特征观察制作察氏培养基平板若干，用接种环挑取PDA斜面孢子少许，点接于平板，28℃培养箱中倒置培养60h，观察菌落形成过程和特征。(2)细胞形态观察用水浸片法制片，在干净的载波片中央滴加一滴乳酸石炭酸蓝棉液，用解剖针从菌落边缘划取菌丝体少许，放入乳酸石炭酸蓝棉液中，盖上盖玻片，在显微镜下观察。观察菌株的菌丝有无横隔、足细胞，观察孢子的形状大小和着生方式及其孢子梗，并结合真菌鉴定手册分析。1.2.3.2分子生物学鉴定(1)菌株基因组DNA提取①将最优菌株28℃培养60h后挑取菌体约50mg，置于灭菌研钵中，加入溶液A(真菌提取试剂盒，下同)200μL，再加入20μLRNaseA，并放入100mg玻璃珠，于漩涡振荡器上振荡20min。②加入20μLl0mg/mL的蛋白酶K，充分混匀，55℃水浴消化30min。消化期间颠倒离心管混匀数次，12000r/min离心2min，将上清转移至一个新离心管中。③在上清液中加入200μL溶液B，充分混匀。55℃水浴5min，加入200μL乙醇，充分混匀，将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，放置2min。④12000r/min离心lmin，弃废液，将吸附柱放入收集管中。向吸附柱中加入700μL漂洗液，l2000r/min离心lmin，弃废液，将吸附柱放入收集管中。⑤向吸附柱中加入500μL漂洗液，l2000rpm离心lmin，弃废液，将吸附柱放入收集管中，l2000r/min离心2min，将吸附柱置于室温放置5min。⑥将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加100μL经75℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，l2000r/min离心lmin。⑦离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2min，l2000r/min离心2min，即得到基因组DNA，同时进行电泳鉴定。(2)菌种18SrDNA片段的扩增与鉴定按照表1所示配制好PCR扩增体系，然后在PCR仪上扩增。表1菌种18SrDNA片段PCR扩增体系名称用量名称用量模板DNA1μLGCbufferI(2×)15μL*上游引物NS1(10μm/mL)1μLLATaq(5U/μL)0.5μL*下游引物NS8(10μm/mL)1μLddH2O加至30μL注：上游引物NS1：GTAGTCATATGCTTGTCTC，下游引物NS8：TCCGCAGGTTCACCTACGGA①完成后经1%琼脂糖凝胶电泳，Goldview染色，然后在凝胶成像系统下进行观察与拍摄。②将PCR产物进行测序，得到测序结果后用Bioedit等软件进行拼接。③分析测序结果，将得到的菌株ITS序列用GenBank中的Blast程序与数据库中的其它菌株进行比较分析，得出相似性。使用软件DNAMAN6.4.0进行分析构建菌株同源进化关系树。2结果与分析2.1最优菌株的筛选(1)按照1.2.1方法，得到纯菌株6株，编号N5-1~N5-6。(2)发酵后各菌株产酶活力，菌株N5-5的产酶活力最高，为475.25U/mL。2.2菌种鉴定2.2.1形态学鉴定(1)菌落特征观察结果。N5-5菌落呈球形，直径38.0mm，表面平坦具有同心轮，结合紧密，呈厚绒状，边缘为白色绒毛状气生菌丝，背面有放射性沟纹，略带褐色。在培养24h内，菌落成白色菌丝，60h后，菌落表面产生黑色孢子，菌落表面逐渐变为黑色，该菌种疑似为黑曲霉。(2)细胞形态观察结果。N5-5由菌丝、分生孢子梗和顶囊组成，顶囊呈球形，分生孢子头褐黑色放射状，其上覆有一层梗基，小梗上长有串状分生孢子，孢子呈球形或近球形，有足细胞，分生孢子梗由足细胞垂直生出，分生孢子梗基无横隔，表面光滑，菌丝有隔。参照真菌鉴定手册，鉴定此菌株属半知菌类(FungiImperfecti)，从梗抱目(Moniliales)，从梗抱科(Moniliaceae)，曲霉族(Aspergilleae)，曲霉属(AspergillusMicheliexFr.)。2.2.2分子生物学鉴定(1)真菌基因组DNA提取及PCR扩增结果菌种基因组DNA提取后经电泳鉴定为一条亮带，无任何杂带存在，表明基因组DNA提取非常成功，无分解，无污染。PCR扩增成功获得一条长度约1800bp的亮带，参考其他文献，疑似所需条带，条带亮度较高，同时无其他杂带干扰，可将PCR产物送交生物技术公司纯化及测序。(2)测序及比对结果测序数据经软件拼接得到该菌种18SrDNA序列，长度为1230。经NCBI序列比对，该序列与黑曲霉属具有高度同源性，与黑曲霉(Aspergilluseniger)等同源性在99%以上，属半知菌亚门真菌。综上，鉴定菌株N5-5为黑曲霉(Aspergilluseniger)，因此该菌株命名为黑曲霉N5-5。当前第1页1 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