GnRH抗原及其在主动免疫对公牛的去势效果及肉品质影响中的应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及一种gnrh抗原及其在主动免疫对公牛的去势效果及肉品质影响中的应用。
背景技术：
：家畜去势是一种控制家畜性欲和繁殖能力的有效方法，不仅使得家畜变得温驯便于饲养管理、提高饲料报酬，还能够改善肉质、提高胴体品级。未阉割的公猪胴体中含有睾丸间质细胞生成的雄烯酮，使得猪肉在加热过程中产生“腥膻味”，严重影响猪肉品质(matthewskretal,2000)；公牛、公羊常会因性情凶暴而发生相互打斗、伤及同类和饲养人员的现象，同时完整公牛胴体还存在着肉质嫩度差、质地粗糙和膻味等问题，去势已是生产高档牛肉常采用的重要方法之一(livestockscience，2010,131(2)：218-221)；母牛在性成熟后会出现周期性发情，易引起牛群混乱，导致无计划怀孕进而影响育肥效果(priceeo,2003)。目前畜牧业最常采用的还是外科阉割方法，传统的去势手术常会造成伤口感染，引起动物高度应激反应，提高发病率和死亡率。尤其在非麻醉的状态下残忍手术广被动物保护主义者所诟病，且在施术过程中对医务人员的安全构成威胁，已不能适应现代集约化畜牧业发展的需要。另外，手术阉割完全摘除了公畜睾丸，使得睾丸中一些分泌控制早期生长发育的激素受到阻断而造成阉畜体型单薄、发育缓慢从而降低了家畜的生产性能。由此可见，运用新方法取代传统去势术势在必行。促性腺激素释放激素(gonadotrpin-releasinghormone,gnrh)是由动物下丘脑分泌的一种十肽激素，其主要生物学功能是与脑垂体促性腺激素分泌细胞上的特异性受体结合，刺激合成并分泌促黄体素(lh)及促卵泡素(fsh)，这些激素能够促进性腺及性器官的正常发育(duboiseaetal,2002)，所以通过适当的方法调控gnrh的分泌或干扰其功能，就能够达到控制动物生殖器官发育和生殖功能的目的。目前，国内外一些学者已在多种动物上开展了利用gnrh主动免疫的方法使动物体内产生抗gnrh抗体以中和内源性gnrh的研究(zengx,2002；millerla,2004；dalinam,2002；melchess,2007；chaleamchat,2016；bothaae,2016)，证实gnrh主动免疫能够替代传统手术去势，控制动物性行为和繁殖能力，且具有一定的改善动物肉质，促进动物生长，提高饲料利用率的作用(zamaratskaiagetal,2008)。gnrh作为由9种不同氨基酸残基构成的短肽，分子量仅为1.181kda，导致其本身不具备免疫原性，因此它需要与大分子载体蛋白结合后来提高其免疫原性，但多数以gnrh单体或并列体与载体蛋白连接后免疫动物效果并不理想(cuisetal,2003)；此外研究表明在天然的gnrh分子结构上替换第6、10位氨基酸能够使其与gnrh受体结合力有效提高100-200倍(marziehah,2010)。gnrh对于哺乳动物生殖系统的调控是一把双刃剑，正常生理剂量下的gnrh能够明显升高血液中fsh和lh的含量，但大剂量的外源性gnrh能够降低其体内内源性gnrh分泌量，致使性腺萎缩。近年来，国外一些学者开展了对gnrh免疫动物的试验研究，但是由于他们所用的gnrh半抗原的结构及单体数目不同，免疫结果存在着很大的差异。gnrh单体与载体蛋白结合后作为抗原时，免疫动物后发现其效果并不理想(sabeurketal,2003)。技术实现要素：本发明的一个目的是提供gnrh衍生体。本发明提供的gnrh衍生体，为在多个串联的gnrh抗原单体间插入能形成α螺旋的短肽，得到gnrh衍生体；所述gnrh抗原单体为将促性腺激素释放激素gnrh氨基酸序列中(从n端起)第6位甘基酸替换为d型赖氨酸，得到多肽。上述gnrh衍生体中，所述能形成α螺旋的短肽为mal(从n端起一次由met,ala,leu三个氨基酸残基组成的短肽)。上述gnrh衍生体中，所述gnrh衍生体为2个或4个串联的gnrh抗原单体间插入所述能形成α螺旋的短肽，得到gnrh衍生体；或所述gnrh衍生体的氨基酸序列的(从n端起)第一个和/或最后一个氨基酸残基分别进行磷酸化修饰和氨基修饰。上述gnrh衍生体为如下1)或2)：1)所示的gnrh衍生体的氨基酸序列为序列3，且第一个氨基酸残基磷酸化修饰，且最后一个氨基酸残基氨基修饰；2)所示的gnrh衍生体的氨基酸序列为序列7，且第一个氨基酸残基磷酸化修饰，且最后一个氨基酸残基氨基修饰。本发明的另一个目的是提供一种gnrh衍生体复合物。本发明提供的gnrh衍生体复合物，为将上述衍生体与载体蛋白偶联，得到的复合物。上述的复合物中，所述衍生物与所述载体蛋白的偶联比为80％。上述衍生体或上述的复合物在制备如下1)8)中任一种产品中的应用也是本发明保护的范围：1)雄性动物去势疫苗；2)降低雄性动物体重和/或睾丸重量产品；3)降低雄性动物血清中促卵泡素fsh、促黄体素lh和/或睾酮t含量产品；4)用于雄性动物去势产品；5)降低雄性动物垂体生殖相关基因mrna表达水平产品；6)降低雄性动物的攻击行为和/或性行为产品；7)抑制雄性动物的睾丸生长发育产品；8)提高雄性动物的胴体的营养水平产品。本发明第三个目的是提供一种产品。本发明提供的产品，包括上述衍生体或上述的复合物；所述产品具有如下1)-8)中至少一种功能：1)雄性动物去势；2)降低雄性动物体重和/或睾丸重量；3)降低雄性动物血清中促卵泡素fsh、促黄体素lh和/或睾酮t含量；4)用于雄性动物去势；5)降低雄性动物垂体生殖相关基因mrna表达水平；6)降低雄性动物的攻击行为和/或性行为；7)抑制雄性动物的睾丸生长发育；8)提高雄性动物的胴体的营养水平。上述产品为疫苗；或，所述疫苗包括上述衍生体或上述的复合物和佐剂。上述中，所述动物为哺乳动物，或，所述动物为哺乳动物，所述哺乳动物为小鼠或牛。本发明在抗原表位设计时，将gnrh第6位甘基酸由d型赖氨酸取代，这样能够有效减慢肽的降解，延长半衰期，并使其余受体结合力增强至正常的100-200倍。此外通过增加串联gnrh抗原的数量以及插入易于形成蛋白质二级结构的氨基酸等方法，能够有效的提高gnrh抗原的免疫原性，增强动物机体识别“非己”成分的灵敏度，引起较强的免疫系统反应，进而达到提升免疫去势效果的目的。本发明在gnrh抗原表位设计中，选择用d型赖氨酸取代gnrh十肽的第6位甘氨酸，共设计了3种类型的gnrh抗原：1、利用串联技术将gnrh单体串联成为gnrh二串子、gnrh四串子，大大增加了gnrh抗原的分子量，使得其易被免疫系统识别。2、通过在gnrh单体间插入易于形成α螺旋与β折叠的氨基酸来改变抗原的分子构象，以达到增强免疫原性的作用。3、双半胱氨酸使得抗原由“平面化”变为“立体化”，二硫键(-s-s-)是肽链上2个半胱氨酸残基的巯基基团脱氢发生氧化反应形成的共价键，在蛋白质分子的立体结构形成上起着一定的重要作用。本项目在设计时将二串子gnrh与四串子gnrh的c端与n端同时加上半胱氨酸，使其形成链内二硫键，进而由平面的单链肽变为立体的折叠肽，推测以上抗原表位设计原则能够起到增强抗原免疫原性，提高免疫系统识别能力的作用。将以上gnrh抗原乳化后免疫雄鼠和奶公犊后，通过检测试验动物血清中抗gnrh抗体滴度和激素水平，发现当gnrh串联倍数相同个数时，插入易于形成α螺旋的氨基酸的gnrh疫苗免疫去势效果最明显，插入β折叠氨基酸的疫苗效果次之，而双半胱氨酸串联的gnrh疫苗基本无法起到免疫效果，表明gnrh多倍抗原经易于形成α螺旋和β折叠的氨基酸修饰后，其分子结构发生改变，成为易于被动物机体免疫系统识别的非自身分子，具有更高的免疫原性，而双半胱氨酸结构的疫苗免疫去势效果较差，推测该抗原在合成的过程中并未形成预想的链内二硫键“立体化折叠肽”；当构象变化类型相同时，二倍体α螺旋的效果的效果略优于四倍体α螺旋，这与前人的研究结果并不一致(jinshuxetal,2004)，推测这可能是由于插入易于形成α螺旋氨基酸的原因，这种构象的改变并不单再是倍数的叠加，而是数量与二级结构的双重作用，这种双重作用也可能会引起四倍体α螺旋在经过动物血脑屏障时的阻碍，最终导致降低外源性的gnrh与其受体特异性结合能力。此外，在本项目中乳化佐剂采取白油span佐剂，白油span属于油乳佐剂，能够促进细胞免疫。乳状液在注射部位的贮存效应能延长抗原在体内的存留时间，缓慢释放抗原，从而持续刺激机体，提高抗原的免疫原性。同时乳剂能够包裹抗原，保护其不被体液中的酶迅速分解，延长抗原刺激机体的时间。乳剂还会在注射部位引起细胞浸润，促使抗原呈递细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等聚集和增殖，从而提高免疫应答水平(aucoutuierjetal,2001)。免疫程序的设计上，为了维持小鼠和公犊牛体内高水平的gnrh抗体，在初次免疫一月后加免一次，通过检测免疫后血清中抗gnrh抗体滴度水平，发现加强免疫后抗体含量持续升高，随后一直维持在较高水平直至试验期末，表明加强免疫可以使血清抗体浓度维持在较长时间且较高水平，达到更长期、更有效的免疫去势效果，这个结果与ferrova等人的研究结果一致(2004)。利用外源性的gnrh主动免疫动物后能够刺激动物机体产生大量的gnrh抗体以特异性的中和内源性gnrh的活性。本实验中，gnrh主动免疫雄鼠后产生了良好的抗体反应，特别是二串子α螺旋的免疫去势鼠，免疫后抗gnrh抗体滴度明显高于对照组，该结果与turkstra等人的研究结果一致，他们将gnrh疫苗免疫公猪后，检测其血清样本同样得到了较高水平的抗gnrh抗体(2011)(本发明的抗原序列不同，在小鼠试验结果二倍体α螺旋比单纯二串子效果要好，但是由于试验动物物种不同，不能说明在公猪上二倍体α螺旋比单纯二串子效果要好)。内源性gnrh活性被中和，会抑制垂体促性腺激素(lh和fsh)及性腺激素(t)的合成与分泌，最终导致性腺萎缩。本实验中，gnrh主动免疫雄鼠后，伴随着抗体滴度的上升，c组血清中促性腺激素lh及fsh水平显著下降(p＜0.05)。通过gnrh主动免疫，由于gnrh抗体的中和作用，引起体内gnrh水平降低，从而抑制了gnrh对促性腺激素的刺激作用，使促性腺激素的分泌量大大降低，这与hanxf等人利用gnrh主动免疫小鼠的结果一致(2016)。t是雄性动物体内最主要的雄性激素，其生物学活性能够刺激并维持附睾、副性腺等生殖器官的生长发育，并对精子的启动、控制、维持及各级生精细胞的分化和成熟均起着重要作用。正常t的分泌主要是受腺垂体lh的控制。本研究显示，使用gnrh免疫雄鼠后，t含量显著低于空白组，说明gnrh主动免疫严重影响了睾丸间质细胞的功能。lh分泌量的减少，降低了间质细胞对lh的应答反应，致使睾酮的合成、分泌受到抑制。促性腺激素、睾酮是雄性动物性腺发育必不可少的激素。gnrh主动免疫，大大抑制了这些激素的分泌，从而间接的抑制了动物性腺的发育，导致动物性腺发生退行性变化。在试验中c组gnrh主动免疫的雄鼠体重增长缓慢，处死时睾丸重量与大小显著低于对照组，表明gnrh二串子α螺旋主动免疫可使雄鼠睾丸重量降低、萎缩，组织学切片显示，免疫组睾丸曲细精管内生精细胞发育不良，生精小管中无精子，这表明该gnrh疫苗主动免疫雄鼠具有很好地去势作用，前人的研究也能够很好地支持本发明的结论。gnrh是下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamus-pituitary-gonadalaxis,hpg)的关键信号分子，gnrh主动免疫动物，会影响雄性动物下丘脑-垂体-睾丸轴的反馈调节，阻碍精子发生，进而达到去势效果。本实验中c组和g组小鼠经gnrh主动免疫后垂体中gnrhr、fshβ和lhβmrna的表达被显著抑制，表明gnrh对gnrhr、fshβ和lhβmrna的正常表达具有显著影响。gnrh的生物学效应需通过gnrhr予以显现，gnrhrmrna表达的减弱，提示gnrhr合成量可能受到抑制，gnrh主动免疫不但阻止了内源性gnrh激素向垂体的输入，同时也下调了垂体gnrh受体的数量，降低了垂体对gnrh激素的反应性。fshβ和lhβmrna表达水平显著下调，进一步从分子水平证实了gnrh主动免疫通过阻止内源性gnrh，达到垂体及下调垂体gnrh受体数量来抑制促性腺激素的合成与分泌，从而导致性腺发育迟缓。垂体分泌的fsh和lh分别与相应性腺受体特异性结合，促进性激素的合成及配子发生。本研究中，c组和g组gnrh主动免疫显著降低了睾丸fshr和lhrmrna表达水平，提示gnrh主动免疫可能通过下调fshr和lhr基因的转录来下调性腺fshr和lhr受体的数量。促性腺激素fshr和lhrmrna表达水平的下调可能是由于gnrh主动免疫后血清fsh和lh激素的降低引起的。此外，还检测了性激素结合蛋白(sexhormone-bindingglobulin,shbg)在不同免疫组中的表达量变化，发现c组和g组gnrh主动免疫使睾丸内shbg的mrna表达量明显下降。该基因在支持细胞中表达，产生睾丸特有的雄激素结合蛋白(androgen-bindingprotein,abp)，它分泌于睾丸的生精小管内并且控制着睾酮的活性。shbg与雄激素有很强的亲和力，能调节雄激素的分泌合成，并且影响精子的生成，进而影响生殖功能。该基因mrna表达水平的显著下降，提示c组和g组的gnrh去势疫苗可能对睾丸支持细胞造成了损伤，该结果正好与我们的睾丸组织学切片结果一致，表明gnrh二串子α螺旋和四串子α螺旋抗原乳化后免疫雄鼠能够有效的起到抑制精子生成，阻碍睾丸发育的作用。gnrh由下丘脑gnrh神经元合成并储存，通过下丘脑-垂体-性腺轴控制着动物性腺激素的合成及配子发生。反过来，性激素通过反馈调节环作用于下丘脑或直接作用于垂体以间接或直接地影响促性腺激素的合成与分泌，从而维持生殖内分泌的稳态。所有下丘脑gnrh基因具有相同的基本结构，其氨基酸序列在哺乳动物中具有高度保守性。因而，选择在雄鼠中产生良好去势作用的c组和g组gnrh疫苗主动免疫公犊牛，检测血清中抗gnrh抗体滴度，发现c组和g组的gnrh抗原主动免疫公牛后都产生了良好的免疫应答，机体内抗体水平明显升高，特别是在第二次免疫后，抗体水平持续上升，并且一直维持在一个较高的水平。表明这两种gnrh疫苗可有效刺激公犊牛机体的免疫记忆应答，诱导机体发生特异性体液免疫，产生维持时间较长、滴度高的特异性抗体，具有很强的免疫原性。促性腺激素、睾酮是雄性动物性腺发育必不可少的激素，本实验中检测免疫c组与对照组公牛血清激素水平，发现试验期间两组fsh、lh和t平均水平有显著差异，血清激素水平在注射c组gnrh抗原后2周内明显下降，4周时有所回升，此时进行第二次免疫后激素水平逐渐下降至最低值，试验末期有回升趋势，但仍明显低于对照组。初次免疫后，血清激素含量并没有发生太大变化，可能是由于初次免疫并没有破坏下丘脑-垂体轴，加强免疫后，血清中抗gnrh抗体滴度显著升高，下丘脑-垂体轴被破坏，血清激素含量随之伴随着显著下降。以上结果表明这种gnrh免疫方法所造成的去势是暂时的，有一定的时限，对于性腺功能有所保留，同时也说明加强免疫能够明显提升去势效果，延长持续时间。前人的研究中也有相似的报道，chantlersa等人利用gnrh疫苗主动免疫公牛后也使得lh分泌量的减少，降低了间质细胞对lh的应答反应，致使睾酮的合成、分泌受到抑制(chantlersaetal,2012；)。但在一些学者的研究中，发现利用gnrh主动免疫公猪后，对于血清中抗体滴度以及t的分泌量并没有显著影响(claudiooetal,2016)，造成这种差异可能与试验动物的品种、免疫剂量及性成熟程度等因素有关。通过对免疫前后的公犊牛睾丸组织学分析，发现免疫c组睾丸组织发生明显病变，生精细胞发育不良，生精小管中无精子，这种睾丸组织学变化与其他关于猪(stigetal,2011)、羊(ozdaletal,2010)的研究报道一致。一些学者对公猪进行免疫去势，发现免疫能够显著降低其睾丸组织大小、周长和重量(fangfgetal,2010；carlbetal,2011)，发明人在试验期间纪录试验动物的睾丸周长和极长变化，发现免疫c组公犊牛的睾丸周长和极长均较对照组相比有所下降，屠宰后观察大小，免疫组公牛睾丸明显皱缩，体积减小，表明gnrh疫苗免疫引起垂体促性腺激素水平下降，延缓了性腺的发育，导致性腺发生一系列的表型变化，最终导致雄性动物生育力下降甚至丧失。t的分泌水平与雄性动物的攻击行为和性行为密切相关。本试验中免疫去势后观察公犊牛的日常行为，发现未进行免疫的公犊牛会频繁出现爬跨现象，并且群体间打斗攻击行为较强,，而经gnrh主动免疫后的公犊牛爬跨现象及攻击行为减少，性欲降低，但会出现被爬跨现象，同时免疫去势组血清睾酮水平显著低于空白对照组，表明雄性动物的攻击行为和性行为与血清中的睾酮浓度成正相关。以上结果提示gnrh主动免疫不仅能够用于安全高效的去势，便于生产管理，同时通过减弱雄性动物性行为和攻击行为，将饲料供给的多余能量用于巩固胴体膘情，增加饲料利用率，能够起到促进动物生长，提高生产性能的作用。为了进一步探讨gnrh疫苗对公牛肉品质的影响，对屠宰后的第3和4肋间背最长肌进行了一系列的品质测定。屠宰后(45min)免疫组与对照组牛肉ph值均在6.2左右，经24h排酸后，免疫去势c组与对照组牛肉的ph值下降至5.8左右，且两种牛肉ph之间差距不大，免疫去势c组牛肉ph值在排酸过程中变化较小，说明免疫去势c组牛肉在屠宰之后贮藏损失小，利于系水力的提高及贮存时间的延长；免疫去势组的干燥水分损失比对照组低5.62％，说明经gnrh免疫后的牛肉保水性能良好；免疫去势c组牛肉剪切力略低于对照组牛肉，说明gnrh免疫后的牛肉相对细嫩，口感较好；免疫去势c组总氨基酸含量比对照组高8.37％，说明经gnrh免疫后的牛肉营养更为丰富，推测该gnrh疫苗可能对提高肉制品的营养水平具有一定的作用；此外，免疫c组牛肉中谷氨酸和甘氨酸含量分别为2.41％和0.6％，而对照组牛肉中谷氨酸和甘氨酸含量分别为2.12％和0.54％，均低于免疫去势组(结果如图5所示，检测方法见后)，这两种氨基酸均属于风味系氨基酸，表明经gnrh抗原免疫后的牛肉具有更加良好的风味；在试验中还发现免疫去势c组的粗脂肪含量相对于对照组来说有所降低，并且两组肉质的粗脂肪含量均低于我国肌内脂肪含量的要求(7.3％)，推测这可能与所选择的肉样部位有关，取部位约为第3和4肋间背最长肌，而肌内脂肪含量测定时一般是根据第12和13肋间背最长肌切面的可见脂肪划分。在skrlepk等人的试验中，利用gnrh免疫公猪屠宰后，免疫组与完整对照组屠宰后ph45、ph24及剪切力的结果趋势与一致，而免疫组肌间脂肪含量略高于完整对照组，但差异不显著，与本发明的结果有所不同(2012)，这可能与试验物种以及最后测定时抽取样品部位差异有关。一些学者比较gnrh免疫与手术阉割公猪对其胴体品质的影响，发现与手术去势法相比，gnrh免疫去势会降低公猪肌间脂肪含量，增加猪肉剪切力值(dazaaetal,2016；martinez-macipemetal,2016)。以上结果均提示该gnrh二串子α螺旋疫苗对于提升公犊牛胴体品质有一定的作用。雄性动物垂体生殖相关基因为fshβ、lhβ、gnrhr。提高雄性动物的胴体的营养水平具体体现在降低雄性动物背最长肌的剪切力、降低干燥水分损失、降低脂肪含量、降低蛋白质含量和/或降低总氨基酸含量。雄性动物背最长肌为雄性动物背第3和4肋间最长肌。综上所述，本实验筛选出的gnrh二串子α螺旋疫苗主动免疫雄鼠和公牛，对其睾丸重量、大小、长度、血清抗gnrh抗体滴度及激素水平及垂体和睾丸组织生殖相关基因及其受体mrna表达水平具有显著影响，可以使睾酮的生物学活性部分或完全丧失，发挥免疫去势作用，加强免疫效果更佳，且对于免疫后的动物胴体品质有一定的提高。以上数据为深入探讨gnrh调节动物生殖的机理提供了科学依据，有助于开发新型、高效、安全、可逆的动物免疫去势疫苗。附图说明图1为新型gnrh衍生体的制备与gnrh-ova复合物的偶联，(a)c组二串子α螺旋gnrh衍生体质谱图；(b)g组四串子α螺旋gnrh衍生体质谱图；(c)gnrh-ova复合物偶联图。图2为新型gnrh衍生体对雄鼠免疫去势效果的影响，(a)雄鼠对照组与免疫c组睾丸组织对比；(b)雄鼠血清抗gnrh抗体滴度；(c)雄鼠血清激素含量；(d)对照组雄鼠睾丸组织学分析；(e)免疫c组雄鼠睾丸组织学分析；(f)雄鼠垂体组织生殖相关基因mrna水平；(g)雄鼠睾丸组织生殖相关基因mrna水平。图3为新型gnrh衍生体对公犊牛行为学及睾丸形态学的影响，(a)公犊牛gnrh疫苗颈部皮下免疫；(b)对照组公犊牛爬跨行为；(c)对照组公犊牛打斗行为；(d)免疫组公犊牛日常状态；(e)免疫组公犊牛被爬跨行为；(f)公犊牛对照组与免疫c组睾丸组织对比。图4为新型gnrh衍生体对公犊牛免疫去势效果的影响，(a)公犊牛血清抗gnrh抗体滴度；(b)公犊牛血清fsh浓度；(c)公犊牛血清lh浓度；(d)公犊牛血清t浓度；(e)对照组公犊牛睾丸组织学分析；(f)免疫c组公犊牛睾丸组织学分析。图5为新型gnrh衍生体对公犊牛肉品质的影响，(a)gnrh衍生体对牛肉酸度的影响；(b)gnrh衍生体对牛肉剪切力的影响；(c)gnrh衍生体对牛肉干燥水分损失的影响；(d)gnrh衍生体对牛肉总蛋白含量的影响；(e)gnrh衍生体对牛肉总氨基酸含量的影响；(f)gnrh衍生体对牛肉肌间脂肪含量的影响；(g)gnrh衍生体对牛肉各氨基酸含量的影响。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中数据分析：荧光定量数据分析：以持家基因gapdh为参照，将小鼠对照组中的表达量定义为1，荧光实时定量pcr结果利用2-δδct法计算生殖相关基因在对照组和免疫组垂体组织和睾丸组织中的相对表达量，并利用spss(18.0)数据分析软件对定量数据进行单因素方差分析。对不同的处理组牛的血液激素含量，抗gnrh抗体的滴度及睾丸大小和重量进行方差分析和显著性检验，以上数据处理用sas软件进行分析。实施例1、gnrh疫苗的制备1、gnrh衍生体的获得自然界中gnrh短肽共由9种氨基酸组成，分别为谷氨酸、组氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸、亮氨酸、精氨酸及脯氨酸，本试验中将gnrh短肽中第6位甘基酸由d型赖氨酸取代，共设计4种类型gnrh抗原表位，共表1所示的8个gnrh衍生体，这8个gnrh衍生体分别为：小分子的gnrh抗原串联、双半胱氨酸串联、插入易于形成α螺旋的短肽mal、插入易形成β折叠的短肽viy(抗原表位序列见表1)。表1为gnrh衍生体氨基酸序列将上述表1所示的8个gnrh衍生体a-h由上海吉尔生化有限责任公司合成，经高效液相色谱(hplc)纯化，纯度＞90％。c组二串子α螺旋的gnrh衍生体质谱图如图1a所示。g组四串子α螺旋的gnrh衍生体质谱图如图1b所示。2、gnrh疫苗的制备1)gnrh-ova复合将上述1得到的8个gnrh衍生体a-h分别采用碳二亚胺法与载体蛋白ova(购自solarbio公司，产品目录号：326a0515)连接，得到gnrh-ova复合物；具体如下：分别称取等质量的10mg上述1得到的8个gnrh衍生体a-h和10mgova，分别与等体积去离子水混合，然后将两者混合，形成ova-gnrh混合物，再将200mgedc.hcl(碳二亚胺盐酸盐，购自solarbio公司，产品目录号：20150522)溶解于适量双蒸水中，缓慢加入上述混合物中，用磁力搅拌器不断搅拌6h以上，然后将反应液装入10kd透析袋中，透析48h，每4-6h换水一次。透析后的液体即为gnrh与ova的偶联产物(gnrh-ova)溶液。冻干后得到8种gnrh-ova复合物a-h(偶联比为80％)。检测gnrh-ova复合物的偶联率，结果如图1c所示，以上8组gnrh-ova复合物的偶联率均达80％，表明该gnrh-ova复合物可以用于后续gnrh免疫疫苗的乳化制备。2)添加佐剂将上述1)得到的8种gnrh-ova复合物a-f分别溶于pbs(ph＝7.4)中，用span白油佐剂(由矿物油mineraloil(购自solarbio公司，产品目录号：703c055)、span85(购自sigma公司，产品目录号：mkbt4291v)和tween85(购自sigma公司，产品目录号：mkbr3983v)构成))充分乳化，乳化过程如下：a水相：称取gnrh-ova溶于适量0.85％nacl中；b矿物油；cspan85和tween85(乳化剂)的混合物，体积比为54：46；组分a、b、c的体积比为8：9：1。先将组分b和组分c按比例充分混匀，然后使用乳化仪边搅拌边逐滴加入组分a，10000rpm持续搅拌5min。制成抗原乳剂，-20℃保存备用，得到8种gnrh疫苗a-h。将制备好的8种gnrh疫苗a-h分别密封后放置于4℃恒温环境中，观察乳液性状，无分层情况，性状保持良好；并将乳化液滴与纯净水上静置，无散开、破乳现象，说明8种gnrh疫苗a-h稳定性较好，可用于后期免疫试验。实施例2、gnrh疫苗的应用一、gnrh疫苗免疫小鼠小试试验1、试验动物取1月龄，体重相近的健康雄性小鼠(购自石河子大学动物试验中心)27只，随机分为9组，分别设定为对照组、a组、b组、c组、d组、e组、f组、g组、h组；2、免疫免疫组a-h：于1月龄时分别向a-h这8组雄鼠采取腿部肌肉注射的方法对应免疫1ml实施例1获得的8种gnrh疫苗a-h(含gnrh约50μg)；4周后以相同剂量与注射方法对试验动物加强免疫一次。对照组：试验动物免疫由生理盐水与佐剂乳化后的疫苗，试验期间饲养管理条件相同。3、检测1)小鼠体重及睾丸重量的变化小鼠试验中，将初次免疫时间记为0dpv(daypostvaccination)，加强免疫时间记为70dpv(daypostvaccination)，检测初次免疫和加强免疫时小鼠体重。结果如表2所示表2为免疫组与对照组雄鼠体重及睾丸重量的变化(g)由表2可知，免疫前，免疫组和对照组雄鼠的平均体重无明显差异(p＞0.05)。gnrh主动免疫两次后，免疫组雄鼠的体重较对照组相比，增重缓慢，其中b组雄鼠的体重与对照组相比，差异不显著(p＞0.05)，c组雄鼠的初免后70dpv体重与对照组相比，差异极显著(p＜0.01)，其余各组体重与对照组相比，差异显著(0.01＜p＜0.05)；在第二次免疫后第8周采集眼眶动脉血后，9组试验雄鼠断颈法处死后，迅速分离出垂体和单侧睾丸置于液氮中，用于生殖相关基因mrna水平测定；另一单侧睾丸剥离附睾后，在电子天平上称取重量，将1cm3大小单侧睾丸组织置于4％中性甲醛中固定，用于制作石蜡切片。检测睾丸重量，结果如表2所示，试验雄鼠睾丸重量与对照组相比，a组、b组差异不显著(p＞0.05)，c组、g组差异极显著(p＜0.01)，其余各组睾丸重量与对照组相比，差异显著(0.01＜p＜0.05)。比较免疫组与对照组小鼠睾丸组织，发现体积明显减小(图2a)。以上数据可知，gnrh疫苗免疫会对雄鼠的体重及睾丸重量产生较大的影响，gnrh疫苗免疫能够有效降低雄鼠的体重及睾丸重量2)小鼠血清抗gnrh抗体及激素含量试验雄鼠于第二次免疫后第8周采集眼眶动脉血样1.5ml，3000rpm离心15min，分离血清，-20℃保存，用于后续血清激素及抗体含量测定。采用elisa法检测血清中gnrh抗体(小鼠促性腺激素释放激素抗体gnrh-abelisa试剂盒)、促卵泡素fsh(小鼠促卵泡素fshelisa试剂盒)、促黄体素lh(小鼠促黄体素lhelisa试剂盒)、睾酮t(小鼠睾酮telisa试剂盒)的含量，试剂盒均购自上海蓝基生物技术有限公司，操作步骤按试剂盒说明书进行。测定试验鼠血清中抗gnrh抗体滴度结果如图2b所示，gnrh主动免疫的雄鼠部分产生了良好的免疫反应，其中c组产生的抗gnrh抗体含量最高，g组次之，b组的抗体含量与对照组之间无明显差异。各组雄鼠主动免疫后血清中fsh、lh、t含量变化见图2c，对照组试验期末fsh、lh、t含量分别为4.91ng/μl、14.59ng/μl、3.08ng/μl，8组试验雄鼠中，c组免疫去势效果最好，试验期末fsh、lh、t含量分别为4.41ng/μl、8.19ng/μl、2.026ng/μl，均显著低于对照组激素浓度。可以看出，gnrh疫苗免疫小鼠后，血清中可产生抗gnrh抗体，且血清中的促卵泡素fsh、促黄体素lh、睾酮t含量降低。3)小鼠睾丸组织石蜡切片分析将单侧睾丸组织置于4％中心甲醛中固定，每个样品组织石蜡切片连续切10张6μm厚度切片，经he染色后，光学显微镜下观察。结果显示，对照组小鼠的睾丸曲细精管结构正常，各级生精细胞发育良好，排列紧密，管腔内有大量精子生成(如图2d)；免疫c组睾丸曲细精管内生精细胞发育不良，数量减少且排列稀疏，生精小管中无精子生成(如图2e)。表明该gnrh抗原c主动免疫小鼠后具有良好的去势作用。4)小鼠垂体、睾丸组织生殖相关基因mrna水平测定分别取免疫组b、c、g和对照组试验雄鼠的垂体组织和睾丸组织100mg于1mltrizol中，用苯酚-氯仿法提取总rna，反转录后获得cdna用于real-timeqpcr分析(生殖相关基因引物设计序列见表3)。表3为垂体组织及睾丸组织生殖相关基因引物采用sybrgreenⅰ染料法分别检测生殖相关基因在对照组和免疫组垂体组织和睾丸组织中的mrna表达水平，每组各3个生物学重复，并设置相应的阴性对照(扩增模板为双蒸水)。gnrh衍生体主动免疫对垂体生殖相关基因mrna表达水平的影响如图2f所示，与对照组相比，c组和g组gnrh抗原主动免疫极显著下调fshβ、lhβ、gnrhr、tshβ及ghmrna表达水平(p＜0.01)，且c组各基因mrna表达水平低于g组，而b组gnrh抗原主动免疫显著下调fshβ、lhβ、tshβ及ghmrna表达水平(0.01＜p＜0.05)，对gnrhrmrna的表达没有显著影响(p＞0.05)。睾丸基因mrna表达变化如图2g所示，c组gnrh抗原主动免疫后睾丸中fshr、lhr、inhα和shbgmrna均显著低于对照组(0.01＜p＜0.05)，g组睾丸组织生殖相关基因的mrna表达水平与对照组相比也均有下调，但差异不显著(p＞0.05)，b组仅lhr基因mrna水平低于对照组，其他基因表达量较对照组相比有所上调。可以看出，gnrh疫苗免疫后，小鼠垂体生殖相关基因fshβ、lhβ、gnrhr表达量下降。因此，从上述可以看出，免疫小鼠所用的疫苗中b、c、g三种类型的疫苗对于小鼠去势效果好。二、gnrh疫苗免疫牛中试试验1、动物取7月龄，体重相近的健康公犊牛12头，随机分为4组，分别设定为对照组、b组、c组、g组，用于后续实验。2、免疫免疫组：公犊牛7月龄时，用选取gnrh疫苗b、gnrh疫苗组c、gnrh疫苗g这三种疫苗分别采取颈部皮下注射的方法免疫1ml(含gnrh约500μg)；4周后以相同剂量与注射方法对各试验动物加强免疫一次(图3a)。对照组：试验动物免疫由生理盐水与佐剂乳化后的疫苗，试验期间饲养管理条件相同。3、检测1)日常行为加强免疫15天后观察公犊牛的日常行为，发现未进行免疫的公犊牛会频繁出现爬跨现象(图3b)，并且群体间有打斗攻击行为(图3c)，而经gnrh主动免疫后的公犊牛无爬跨现象及攻击行为(图3d)，但会出现被爬跨现象(图3e)，说明gnrh主动免疫能够有效的降低动物的攻击行为和性行为。2)奶公犊体重及睾丸长度(周长、极长)的变化初次免疫当天记为0wpv(weekspostvaccination)，试验公牛于0wpv，14wpv记录睾丸周长、极长数据。试验期间定期采集奶公犊睾丸长度数据如表4所示，表4免疫组与对照组公牛体重及睾丸周长、极长的变化(cm)对照bcg0wpv睾丸周长28.3±0.828.9±0.528.7±0.728.5±0.814wpv睾丸周长32.6±0.532.5±0.330.1±0.430.6±0.60wpv睾丸极长10.8±0.210.9±0.111.3±0.310.6±0.414wpv睾丸极长13.8±0.513.3±0.411.3±0.212.3±0.5可以看出，gnrh主动免疫c组和g组的公牛，其睾丸周长、极长增长缓慢，随着免疫时间的延长持续缩短，表明注射gnrh免疫去势疫苗能够阻碍睾丸发育，显著降低睾丸重量。b组免疫去势疫苗对于公牛睾丸周长、极长的影响差异不显著(p＞0.05)。试验末期奶公犊屠宰后取单侧睾丸组织，观察对照组与免疫组公牛睾丸大小的对比图，发现gnrh主动免疫公犊牛后，c组睾丸体积减小约1/3，睾丸重量降低，严重皱缩(图3f)。说明免疫c组公牛睾丸生长发育受到抑制。结合小鼠试验数据，推测在b、c、g三种类型的疫苗中，插入易于形成α螺旋的氨基酸的gnrh疫苗(c组)免疫去势效果最明显，而双半胱氨酸串联的gnrh疫苗(b组)基本无法起到免疫效果。3)奶公犊血清抗gnrh抗体及激素含量初免当天起每2周采集试验公牛尾静脉血样1.5ml，即2wpv，4wpv，6wpv，8wpv，10wpv，12wpv，14wpv，直至屠宰，采集血样3000rpm离心15min，分离血清，-20℃保存，用于后续血清激素及抗体含量测定。采用elisa法检测血清中gnrh抗体(牛促性腺激素释放激素抗体gnrh-abelisa试剂盒)、促卵泡素fsh(牛促卵泡素fshelisa试剂盒)、促黄体素lh(牛促黄体素lhelisa试剂盒)、睾酮t(牛睾酮telisa试剂盒)的含量，试剂盒均购自上海蓝基生物技术有限公司，操作步骤按试剂盒说明书进行。抗gnrh抗体含结果如图4a所示，箭头表示免疫时间，初次免疫(4wpv)后c、g两组公牛血清抗gnrh抗体含量开始升高，加免前免疫组血清抗gnrh抗体浓度与对照组无显著差异(p＞0.05)，8wpv加强免疫后抗体含量持续升高，随后一直维持在较高水平直至试验期末，较对照组相比抗gnrh抗体含量差异极显著(p＜0.01)，表明加强免疫可以使血清抗体浓度维持在较长时间且较高水平，达到更长期、更有效的免疫去势效果。分析c组gnrh衍生体乳化后主动免疫公犊牛后的激素变化情况，箭头表示免疫时间，整个试验期间对照组fsh、lh浓度变化平稳，平均浓度分别为17.91ng/ml和26.46ng/ml；而实验组c组fsh、lh含量在初次免疫(0wpv)后，都有一定程度的降低，4周后(4wpv)二次免疫使得fsh、lh浓度持续下降，与对照组相比始终维持在较低的水平，平均浓度分别仅为13.44ng/ml和21.14ng/ml(图4b、图4c)。观察试验期间血清t浓度，对照组血清t浓度从0wpv(浓度为7.71ng/ml)开始持续上升，至4wpv达到峰值(11.72ng/ml)，后持续维持在较高水平，平均浓度达9.13ng/ml，免疫去势组血清t浓度显著低于对照组(p<0.05)，平均浓度为7.39ng/ml(图4d)。表明gnrh疫苗免疫注射可以明显的降低血清中lh、fsh和t的合成与分泌，影响动物的生殖能力，并且加强免疫效果更加明显。5)奶公犊睾丸组织石蜡切片分析试验公牛屠宰后，迅速分离出单侧睾丸剥离附睾，采集睾丸组织1cm3大小置于4％中性甲醛中固定，用于制作石蜡切片。对照组与c组奶公犊单侧睾丸组织切片后经he染色结果显示，将c组gnrh抗原乳化后免疫公牛，gnrh抗原免疫组睾丸组织出现明显的组织学变化。生理盐水组(对照组)公牛睾丸组织中，曲精细管排列整齐，管腔内各级生精细胞层次清晰，层数正常，精原细胞向管腔内发育，分化为初级精母细胞、精子细胞和精子，精子数量较多，上皮组织完整，支持细胞和间质细胞分布均匀(图4e)；而gnrh主动免疫公牛睾丸(c组)组织发生明显空泡变性，曲细精管生殖上皮明显萎缩，管腔内精原细胞、精母细胞及精子细胞层次减少且不分明，在曲精小管内仅见一两层退化的精原细胞，腔内无精子或极少精子，管腔空荡间质组织疏松，细胞数量明显减少(图4f)。以上结果表明该gnrh疫苗c主动免疫公牛后，抑制公牛睾丸的发育，使曲精小管发生萎缩，精子发生受到抑制，最终导致睾丸组织萎缩，去势作用较好，也表明该gnrh抗原c具有良好的免疫原性。6)牛肉品质分析试验末期公牛屠宰后，采集第3和4肋间背最长肌500g，检测c组gnrh疫苗和对照组的牛肉嫩度(剪切力)、干燥水分损失、酸度(ph值)、脂肪含量、蛋白质含量以及总氨基酸含量。取3个平行样本的均值比较两组之间的差异。具体测定方法如下：(1)剪切力测定将肉样修建成厚度约为2.5cm的肉块，85℃水浴加热30min,使得肉块中心温度达到80℃后取出室温冷却，用直径为1.27cm的中空取样器沿着肌纤维的方向取样，每个肉样重复采集3次，用肌肉嫩度仪测定其剪切力大小，取3次的平均值即为该肉块的剪切力值，结果以牛顿为单位。(2)干燥水分损失测定由于背最长肌横截面上，大理石花纹与水分含量分布都不均匀，因而采集背部肌肉每份约5g，用剪刀剪成肉末状，从中随机称取出1g左右(w1)用锡箔纸包裹，放入电热鼓风干燥箱中，干燥3h至恒重，冷却至室温后准确称取干燥后的重量(w2)。按照公式1计算干燥水分损失。公式1干燥水分损失％＝(w1-w2)/w1×100％(3)ph值测定公牛屠宰后，在新鲜胴体上采集不含脂肪的背部肌肉约5g,于温度4℃，湿度80％-85％的环境中，每隔24h测定1次，持续监测72h。每份肉样剪碎后，50ml蒸馏水浸泡15min后过滤，使用酸度计测定其ph值。(4)肌内脂肪含量测定采集30g左右具有代表性的肉样剪碎，随机称取3g肉样，烘干后用滤纸包好，称重记为w3，置于索氏提取器中，以石油醚作为抽提剂，70℃水浴抽提10h后取出，烘干后冷却至室温再次称重记为w4，按照公式2计算肌内脂肪含量。公式2干燥水分损失％＝(w3-w4)/w3×100％(5)蛋白质含量测定准确称取1.5g肉样于消化管中，加入1粒消化片及12ml浓硫酸，在消化炉中消化2h，用全自动凯氏定氮仪测定其蛋白质含量。(6)氨基酸含量测定秤取350mg肉样置于20ml安瓶中，加入6mol/lhcl溶液10ml抽真空融封，放入110℃烘箱中水解22h，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮反应，通过分光光度计比色测定氨基酸含量。试验结果如图5所示，可以看出，排酸后，免疫去势c组ph值比对照组高0.08，剪切力比对照组低0.36n,干燥水分损失比对照组低5.62％，蛋白质含量比对照组低1.49％，总氨基酸含量比对照组高8.37％。但与对照组相比，c组gnrh抗原免疫后牛肉的剪切力、干燥水分损失、酸度、脂肪含量、蛋白质含量及氨基酸含量虽有一定的变化，均差异不显著(p＞0.05)，其中氨基酸含量比对照组高8.37％，说明该gnrh疫苗c对提高胴体的营养水平具有一定的作用。序列表<110>新疆农垦科学院<120>gnrh抗原及其在主动免疫对公牛的去势效果及肉品质影响中的应用<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>21<212>prt<213>人工序列<220><223><400>1gluhistrpsertyrlysleuargproglyglnhistrpsertyrlys151015leuargproglycys20<210>2<211>22<212>prt<213>人工序列<220><223><400>2cysglnhistrpsertyrlysleuargproglyglnhistrpsertyr151015lysleuargproglycys20<210>3<211>24<212>prt<213>人工序列<220><223><400>3gluhistrpsertyrlysleuargproglymetalaleuglnhistrp151015sertyrlysleuargproglycys20<210>4<211>24<212>prt<213>人工序列<220><223><400>4gluhistrpsertyrlysleuargproglyvaliletyrglnhistrp151015sertyrlysleuargproglycys20<210>5<211>41<212>prt<213>人工序列<220><223><400>5gluhistrpsertyrlysleuargproglyglnhistrpsertyrlys151015leuargproglyglnhistrpsertyrlysleuargproglyglnhis202530trpsertyrlysleuargproglycys3540<210>6<211>42<212>prt<213>人工序列<220><223><400>6cysglnhistrpsertyrlysleuargproglyglnhistrpsertyr151015lysleuargproglyglnhistrpsertyrlysleuargproglygln202530histrpsertyrlysleuargproglycys3540<210>7<211>50<212>prt<213>人工序列<220><223><400>7gluhistrpsertyrlysleuargproglymetalaleuglnhistrp151015sertyrlysleuargproglyalaleumetglnhistrpsertyrlys202530leuargproglyleualametglnhistrpsertyrlysleuargpro354045glycys50<210>8<211>50<212>prt<213>人工序列<220><223><400>8gluhistrpsertyrlysleuargproglyvaliletyrglnhistrp151015sertyrlysleuargproglyilevaltyrglnhistrpsertyrlys202530leuargproglytyrilevalglnhistrpsertyrlysleuargpro354045glycys50当前第1页12