一种犬肝细胞的分离与培养方法与流程

本发明属于细胞分离与培养领域，具体涉及一种犬肝细胞的分离与培养方法。

背景技术：

肝细胞分离方法、培养条件进行了大量的研究，但要获得高活率、功能好的肝细胞，至今仍较困难，尤其是犬原代肝细胞。

早期分离肝细胞的方法主要是非酶法分离肝细胞，包括机械法(如匀浆法)及螯合法。但是机械法对肝细胞损伤大，分离下来的肝细胞活率低；螯合法是用可结合ca²⁺、mg²⁺的螯合剂(如枸橼酸盐或edta)分离肝细胞，但螯合剂单独使用效果不好，常需与酶法结合使用。后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞，包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法等。根据结果显示，一步灌流结合组织块消化法获得的肝细胞形态完整性较差，大部分细胞不贴壁，活性差，功能不强，ldh漏出液、白蛋白分泌和尿素合成呈现不规律变化，无法模拟体内代谢情况。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种犬肝细胞的分离与培养方法，获得的肝细胞几乎为纯的肝实质细胞，不仅数量多，肝细胞形态完整，贴壁良好，活性高，而且保留了肝细胞的各种功能。

本发明提供了如下的技术方案：

一种犬肝细胞的分离与培养方法，包括如下步骤：

s1,取肝，取新鲜的肝脏用灌流液a浸泡冲洗；

s2,灌流，向冲洗后的肝脏灌注37℃预热的灌流液a15-20min，流速为50ml/min，然后继续以50ml/min的流速灌注37℃预热的灌流液b3-5min，接着以20ml/min流速灌注37℃预热的灌流液c4-6min，最后将含有三抗的4℃预冷的基础培养基浇在肝脏表面上，所述三抗与基础培养基的体积比为1:99；

s3,肝细胞分离，在无菌环境下剔除血管、脂肪和结缔组织，撕掉肝脏表面包膜，将肝脏剪碎，将剪碎的肝脏放入4℃预冷的基础培养基溶液中，然后依次使用60目、80目的细胞筛过滤一遍，并使用4℃预冷的基础培养基冲洗，滤出多余组织，接着依次使用200目、300目的细胞筛分别过滤两遍，最后将收取的肝细胞悬液倒入离心管中，加入肝细胞悬浮液重量2％的红细胞裂解液，离心分离获得肝细胞，离心条件为1000-3500r/min,5-10min；

s4，肝细胞培养，将获得肝细胞放入经酒精消毒的细胞计数板上，使用rpmi1640贴壁培养基接板，接板完毕后，放入37℃，co2体积浓度为5％的培养箱中培养4h，在无菌条件下将细胞计数板内的rpmi1640贴壁培养基取出，向细胞计数板内加满rpmi1640生长培养基进行培养。

优选的，所述s2中灌流液a的配方为每1000ml蒸馏水中溶解8.1816gnacl、0.4995gkcl、2.3831ghepes、0.4500g葡萄糖、0.1861gedtana2，调节ph至7.2，灌流液b的配方为每1000ml蒸馏水中溶解8.1816gnacl、0.4995gkcl、6.8493ghepes、0.4500g葡萄糖、0.5550gcacl2，调节ph至7.2，灌流液c的配方为每500ml灌流液b中溶解0.1gⅳ型胶原酶。

优选的，所述s2中三抗的配方为每毫升三抗母液含青霉素、链霉素和两性霉素b分别为1万u、1万ug和250ug。

优选的，所述s4中rpmi1640贴壁培养基的配方为每250mlrpmi1640基础培养基中加入25ml胎牛血清、2.5ml三抗、4.59*10^-4μmol胰岛素、4*10^-5μmol地塞米松、0.16μg维生素c；所述rpmi1640生长培养基的配方为每250mlrpmi1640基础培养基中加入25ml胎牛血清和2.5ml三抗。

本发明的有益效果是：利用原代肝细胞进行体外实验，与其他体外及体内实验方法相比，有自身显著的优点。肝细胞是分化程度很高的细胞，一旦失去体内生存环境，则很快失去分化再生的能力，一些生化功能也很快丧失。犬原代肝细胞经过两步胶原酶灌流消化法后，模拟体内环境，探究分离的肝细胞活性最佳时期，并对肝细胞培养过程中的代谢情况进行检测；

使用两步胶原酶灌流法，这是目前国际上流行的肝细胞分离方法。先从门静脉用无钙、含edta的灌流液灌注，冲出血细胞；再用含钙和edta的灌流液冲出灌流液a，再换含四型胶原酶的灌流液灌注肝脏，除去残留edta的干扰，有利于激活胶原酶额活性，是肝组织软化分散，至肝细胞解离，肝脏表面明显的颗粒状为止，停止蛋白酶作用。经过细胞筛的多次过滤后，除去脉管组织和未充分消化的肝脏组织碎块。反复3次洗涤离心，除去非实质细胞和细胞碎片，即可产生大量的活性较高的肝细胞；

此法分离获得的肝细胞几乎为纯的肝实质细胞，不仅数量多，肝细胞形态完整，贴壁良好，活性高，而且保留了肝细胞的各种功能。

附图说明

图1是不同培养时间肝细胞形态变化图；

图2是肝细胞上清液各项指标变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行详细的叙述。

将取出的肝脏用灌流液a浸泡冲洗后，灌注37℃预热的灌流液a15min，流速为50ml/min，然后继续以50ml/min的流速灌注37℃预热的灌流液b3-5min，接着以20ml/min流速灌注37℃预热的灌流液c4-6min，最后将含有三抗4℃预冷的基础培养基浇在肝脏表面上，三抗和基础培养基的体积比为1:99；其中灌流液a的配方为每1000ml蒸馏水中溶解8.1816gnacl、0.4995gkcl、2.3831ghepes、0.4500g葡萄糖、0.1861gedtana2，调节ph至7.2，灌流液b的配方为每1000ml蒸馏水中溶解8.1816gnacl、0.4995gkcl、6.8493ghepes、0.4500g葡萄糖、0.5550gcacl2，调节ph至7.2，灌流液c的配方为每500ml灌流液b中溶解0.1gⅳ型胶原酶，三抗的配方为每毫升三抗母液含青霉素、链霉素和两性霉素b分别为1万u、1万ug和250ug；在无菌环境下剔除血管、脂肪和结缔组织，撕掉肝脏表面包膜，将肝脏剪碎，将剪碎的肝脏放入4℃预冷的基础培养基溶液中，然后依次使用60目、80目的细胞筛过滤一遍，并使用4℃预冷的基础培养基冲洗，滤出多余组织，接着依次使用200目、300目的细胞筛分别过滤两遍，最后将收取的肝细胞悬液倒入离心管中，加入肝细胞悬浮液重量2％的红细胞裂解液，离心分离获得肝细胞，离心条件为1000-3500r/min,5-10min；将获得肝细胞放入经酒精消毒的细胞计数板上，使用rpmi1640贴壁培养基接板，接板完毕后，放入37℃，co2浓度为5％的培养箱中培养4h，在无菌条件下将细胞计数板内的rpmi1640贴壁培养基取出，向细胞计数板内加满rpmi1640生长培养基进行培养，其中rpmi1640贴壁培养基的配方为每250mlrpmi1640基础培养基中加入25ml胎牛血清、2.5ml三抗、4.59*10^-4μmol胰岛素、4*10^-5μmol地塞米松、0.16μg维生素c；所述rpmi1640生长培养基的配方为每250mlrpmi1640基础培养基中加入25ml胎牛血清和2.5ml三抗。

结果检测

通过倒置显微镜观察的到图1；

图1a是犬肝细胞刚分离完成后，在倒置显微镜下观察，两步胶原酶灌流分离的肝细胞呈现分散状态，呈圆球形，细胞核位于细胞中央；

图1b是4h后，细胞贴壁生长，细胞体开始变平，细胞核隐约可见，细胞开始伸张生长，形态多为椭圆形，活力差的细胞悬浮于细胞培养基中，换液可除去；

图1c是24h后，大部分肝细胞贴壁生长，细胞形态多为椭圆形和多边形，呈扁平状；

图1d是48h后，细胞体积增大，且细胞形态较稳定，细胞核清晰可见；

图1e是72h后，细胞贴壁牢固出现链接状，排列紧密，成片生长，细胞间界限清晰，形成胆小管结构；

图1f、g、h、i、j是96h后，细胞的活性逐渐降低，细胞出现部分破裂，肝细胞呈明显颗粒化，有空泡形成，细胞边缘不清晰，部分肝细胞核消失，细胞间隙拉大，肝细胞逐渐脱壁。

采用全自动生化分析仪检测不同时间的培养上清液得到图2、从图2中可知，上清液中白蛋白(alb)、乳酸脱氢酶(ldh)、尿素(bun)、谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)等指标的变化，在一周内呈现较明显的规律性变化，ldh漏出液第一天指标最高，第3天和第4天时降低到最低，而后逐渐升高。

白蛋白分泌和尿素合成功能正常，第一天最高，第3-4天降到最低值，随着培养时间的延长有升高且稳定的状态，表明两步胶原酶灌流法分离的肝细胞活性在第3-4天功能最佳。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。