一种检测结直肠癌血清分泌型lncRNAs的引物和试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及一种检测结直肠癌血清分泌型lncrnas的引物和试剂盒。

背景技术：

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发生率和死亡率均居男、女恶性肿瘤的第三位，严重威胁人类健康。结直肠癌的发生是一个涉及遗传学、表观遗传学异常的复杂过程，虽然经过长期研究，至今仍未能建立易于推广的有效诊断手段，导致大部分患者就诊时己处于中晚期，丧失了治愈的最佳时机。目前可用于结直肠癌早期诊断的手段非常有限，如结直肠镜检查、粪便隐血实验、影像学检查、血肿瘤标志物检测等，因依从性差、敏感性和/或特异性不高等原因，临床应用还存在不足。因此，寻找并鉴定与结直肠癌发生相关的新型分子标志物用于结直肠癌的早期诊断仍是目前临床关注的焦点。

长链非编码rnas(lncrnas)参与调控肿瘤细胞内多种生物学过程，在肿瘤发生、发展中发挥着重要作用，并且在不同肿瘤中存在各自的表达模式，有望成为一类重要的肿瘤标志物。近年研究显示，lncrnas可通过转录调控、染色质修饰、x染色体沉默、核内运输等多种重要的调控作用，参与肿瘤的发生、发展。ling等研究发现，lncrnaccat2在微卫星稳定的结直肠癌组织中呈过表达，能够促进肿瘤细胞的生长、转移和染色质不稳定(ling,h.etal(2013)genomeresearch,23:1446-1461)。takahashi等发现lncrnapvt-1可通过抑制tgf-β信号通路和凋亡信号来促进结直肠癌的发生发展，是预测结直肠癌预后的一项良好指标(takahashi,y.etal(2014)britishjournalofcancer,110:164-171)。ji等研究发现，lncrnamalat1能够激活结直肠癌细胞中的wnt/β-catenin信号途径，从而促进结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭(ji,q.etal(2013)plosone,8:e78700)。nissan等采用代表性差异分析法发现了一种与结直肠癌密切相关的lncrna——ccat1，进一步研究显示ccat1在结直肠癌发生的早期阶段就明显升高，有望成为一种潜在的结直肠癌早期诊断标志物(nissan,a.etal(2012)internationaljournalofcancer,130:1598-1606)。近年来关于lncrnas的研究进展迅猛，各类lncrnas被大量发现，大部分临床研究主要集中在结直肠癌组织，如何利用无创性诊断手段对lncrnas进行分析，已成为肿瘤诊断领域关注的焦点。近年来，外泌体(exosomes)的出现成为液态活检的主要检测物，为肿瘤的无创检测提供了一条新的途径。

目前实时荧光定量pcr方法是检测lncrnas的主要方法，但由于血清外泌体中lncrnas的丰度较低，临床应用易出现假阴性，因此有必要开发一种敏感性高的血清分泌型lncrnas的检测方法，为结直肠癌的早期发现提供帮助。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种检测结直肠癌血清分泌型lncrnas的引物和试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供血清分泌型lncrnaloc100130899作为结直肠癌诊断标志物在制备结直肠癌诊断试剂中的用途。

所述血清分泌型lncrnaloc100130899是genebank数据库上报的核苷酸序列nr_039988.1。

进一步的，本发明还提供检测血清分泌型lncrnaloc100130899的试剂在制备结直肠癌诊断试剂中的用途。

本发明的第二方面，提供一种检测上述血清分泌型lncrnaloc100130899的引物。

本发明的引物包括：一对outer引物和一对inner引物；所述outer引物的核苷酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示；所述inner引物的核苷酸序列如seqidno.3和seqidno.4所示。具体如下：

outer-f：5’-agaacaggcagtatgtccgc-3’；(seqidno.1)

outer-r：5’-aagccactggaggtcacaac-3’；(seqidno.2)

inner-f：5’-agtgctgtgggtacaagcaa-3’；(seqidno.3)

inner-r：5’-cccagcaaatatccaccgga-3’；(seqidno.4)

上述的引物在制备检测结直肠癌的试剂和/或试剂盒中的应用也是本发明的保护范围。

本发明的第三方面，提供一种检测结直肠癌的试剂盒，所述试剂盒中包括：seqidno.1、seqidno.2所示的outer引物，和seqidno.3、seqidno.4所示的inner引物。

所述试剂盒中还包括：内参基因gapdh的一对outer引物和一对inner引物，内参基因ubc的一对outer引物和一对inner引物，以及pcr反应液和qpcr反应液；

所述内参基因gapdh的outer引物的核苷酸序列如seqidno.5和seqidno.6所示；内参基因gapdh的inner引物的核苷酸序列如seqidno.7和seqidno.8所示；

所述内参基因ubc的outer引物的核苷酸序列如seqidno.9和seqidno.10所示；内参基因ubc的inner引物的核苷酸序列如seqidno.11和seqidno.12所示。

优选的，所述pcr反应液由dna聚合酶、dntps、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁和水组成。

优选的，所述qpcr反应液由sybergreenⅰ荧光染料、dna聚合酶、dntps、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁和水组成。

优选的，上述试剂盒中，seqidno.1-seqidno.12所示引物的浓度均为10nm；dna聚合酶的浓度为100u/ml；dntps的浓度为0.2mm；氯化镁的浓度为6mm；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为16.5mm；氯化钾的浓度为89.3mm。

上述引物或试剂盒在定性或定量检测血清分泌型lncrnaloc100130899表达量中的应用也是本发明的保护范围。

本发明的第四方面，提供一种检测结直肠癌血清分泌型lncrnaloc100130899表达量的方法，包括如下步骤：

(1)提取血清分泌型rnas；

(2)采用逆转录试剂盒将rna逆转录为cdna；

(3)以cdna为模板进行巢氏实时定量pcr扩增；同时将内参基因gapdh、ubc进行逆转录巢氏实时定量pcr扩增；

(4)采用2^-△△cq法计算lncrnaloc100130899的相对表达量。

步骤(1)中，提取血清分泌型rnas采用的方法为：将血清与exoquick^tmexosomeprecipitationsolution试剂混匀，室温静置；然后离心，弃上清，加入trizol试剂混匀，室温静置，加入氯仿，剧烈震荡，室温静置，离心，取上清加入异丙醇，室温静置，离心，弃上清，加入75％乙醇洗涤，离心，弃上清，加depc水溶解备用。

步骤(2)中，逆转录的条件为：37℃15min、85℃5s。

步骤(3)中，以cdna为模板进行巢氏实时定量pcr扩增包括两阶段pcr反应，第一阶段pcr反应：以cdna为模板，以seqidno.1、seqidno.2所示的outer引物作为扩增引物，在pcr反应液中进行反应；第二阶段pcr反应：以第一阶段的pcr产物为模板，以seqidno.3、seqidno.4所示的inner引物作为扩增引物，在qpcr反应液中进行反应。

优选的，第一阶段pcr反应中，反应的条件为：首先95℃3min，然后95℃30s、60℃30s、72℃1min进行25个循环，最后72℃10min。

优选的，第二阶段pcr反应中，反应的条件为：首先95℃10min，然后95℃15s、60℃34s进行35个循环，记录cq值。

步骤(3)中，内参基因gapdh、ubc进行巢氏实时定量pcr扩增也包括两阶段pcr反应，扩增所采用的引物分别如seqidno.5-seqidno.12所示，扩增条件与以cdna为模板进行巢氏实时定量pcr扩增的条件相同。

步骤(4)中，lncrnaloc100130899的相对表达量的计算方法为：△cq＝[cq(待测样本)-cq(校对样本)]，△△cq＝△cq(lncrnaloc100130899)-△cq(内参基因)，cq(内参基因)＝[cq(gapdh)+cq(ubc)]/2。

本发明的上述检测结直肠癌血清分泌型lncrnaloc100130899表达量的方法并不是以疾病的诊断和治疗为目的。

上述技术方案具有如下有益效果：

(1)本发明提供了一种新的结直肠癌的诊断标志物——血清分泌型lncrnaloc100130899，并对该诊断标志物的诊断价值进行了评估，结果表明：血清分泌型lncrnaloc100130899对结直肠癌的诊断效能为0.839(95％ci0.786-0.884)，明显高于传统肿瘤标志物cea的诊断效能0.624(95％ci0.558-0.687，p<0.001)。

(2)针对新发现的结直肠癌的诊断标志物，本发明采用的巢氏实时定量pcr对该诊断标志物进行检测，巢氏实时定量pcr扩增为两次pcr扩增反应过程，第一阶段的pcr反应是对原始cdna模板进行扩增，避免了血清分泌型rna丰度较低的问题，使得痕量rna即可被扩增检测到，大大提高了检测的灵敏度。

本发明采用outer引物和inner引物进行两次pcr反应，inner引物扩增的模板是outer引物扩增的产物，因此第二阶段反应也是对第一阶段反应正确性的鉴定，能够更好的保证反应的准确性，避免一次pcr反应非特异性扩增的引发的假阳性。

本发明建立的结直肠癌血清分泌型lncrnaloc100130899检测方法，为结直肠癌的辅助诊断提供了重要的参考依据。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1：本发明试剂盒敏感性评价结果；

图2：本发明试剂盒特异性评价结果；

图3：血清分泌型lncrnaloc100130899在结直肠癌患者中的表达；

图4：血清分泌型lncrnaloc100130899对结直肠癌的诊断价值。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，由于血清exosomes中lncrnas的丰度较低，临床应用实时荧光定量pcr进行检测易出现假阴性。基于此，本发明首次提出了一种采用巢氏实时荧光定量pcr方法检测lncrnas的方法。

在本申请的一种实施方案中，提供了一种巢氏实时荧光定量pcr方法检测结直肠癌血清分泌型lncrnaloc100130899的引物，包括一对outer引物和一对inner引物，引物序列如下所示：

loc100130899-outer-f：5’-agaacaggcagtatgtccgc-3’；(seqidno.1)

loc100130899-outer-r：5’-aagccactggaggtcacaac-3’；(seqidno.2)

loc100130899-inner-f：5’-agtgctgtgggtacaagcaa-3’；(seqidno.3)

loc100130899-inner-r：5’-cccagcaaatatccaccgga-3’；(seqidno.4)。

在本申请的另一种实施方案中，提供了一种检测结直肠癌血清分泌型lncrnas的的试剂盒，所述试剂盒中包括：上述seqidno.1、seqidno.2所示的outer引物，和seqidno.3、seqidno.4所示的inner引物；内参基因gapdh的一对outer引物和一对inner引物，内参基因ubc的一对outer引物和一对inner引物，以及pcr反应液和qpcr反应液；

所述内参基因gapdh的outer引物的核苷酸序列如seqidno.5和seqidno.6所示；内参基因gapdh的inner引物的核苷酸序列如seqidno.7和seqidno.8所示；

所述内参基因ubc的outer引物的核苷酸序列如seqidno.9和seqidno.10所示；内参基因ubc的inner引物的核苷酸序列如seqidno.11和seqidno.12所示。具体如下：

gapdh-outer-f：5’-tcaaggctgagaacgggaag-3’；(seqidno.5)

gapdh-outer-r：5’-tgatggcatggactgtggtc-3’；(seqidno.6)

gapdh-inner-f：5’-ggagcgagatccctccaaaat-3’；(seqidno.7)

gapdh-inner-r：5’-ggctgttgtcatacttctcatgg-3’；(seqidno.8)

ubc-outer-f：5’-tcggccttagaaccccagta-3’；(seqidno.9)

ubc-outer-r：5’-gagatccctccgcagaatcg-3’；(seqidno.10)

ubc-inner-f：5’-acgggacttgggtgactcta-3’；(seqidno.11)

ubc-inner-r：5’-atcgccgagaagggactact-3’；(seqidno.12)

作为优选的方案，所述试剂盒中各物质的浓度如下：

loc100130899-outer-f：10nm；loc100130899-outer-r：10nm；loc100130899-inner-f：10nm；loc100130899-inner-r：10nm；gapdh-outer-f：10nm；gapdh-outer-r：10nm；gapdh-inner-f：10nm；gapdh-inner-r：10nm；ubc-outer-f：10nm；ubc-outer-r：10nm；ubc-inner-f：10nm；ubc-inner-r：10nm；dna聚合酶：100u/ml；dntps：0.2mm；氯化镁：6mm；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐：16.5mm；氯化钾：89.3mm；1×sybergreenⅰ荧光染料。

在本申请的又一种实施方案中，提供了一种检测结直肠癌血清分泌型lncrnaloc100130899表达量的方法，步骤如下：

(1)提取血清分泌型rnas：取250μl血清与63μlexoquick^tmexosomeprecipitationsolution试剂混匀，室温静置30min；然后1500g离心30min，弃上清，加入750μltrizol试剂混匀，室温静置5min，加入200μl氯仿，剧烈震荡15s，室温静置5min，12000g离心15min，取上清加入500μl异丙醇，室温静置10min，12000g离心10min，弃上清，加入1ml75％乙醇洗涤，7500g离心5min，弃上清，加10μldepc水溶解备用。

(2)逆转录反应：采用逆转录试剂盒将rna逆转录为cdna，逆转录条件为：37℃15min、85℃5s。

(3)巢氏实时定量pcr扩增：取1:10稀释cdna为模板，加入outer引物和pcr反应液，进行第一阶段pcr反应，反应条件：首先95℃3min，然后95℃30s、60℃30s、72℃1min进行25个循环，最后72℃10min。取1:10稀释的第一阶段pcr产物，加入inner引物和qpcr反应液，进行第二阶段pcr反应，首先95℃10min，然后95℃15s、60℃34s进行35个循环，记录cq值。内参基因gapdh、ubc的逆转录巢氏实时定量pcr扩增，除引物外，其它方法相同；

(4)数据分析：lncrnaloc100130899的相对表达量采用2^-△△cq法计算，△cq＝[cq(待测样本)-cq(校对样本)]，△△cq＝△cq(lncrnaloc100130899)-△cq(内参基因)，cq(内参基因)＝[cq(gapdh)+cq(ubc)]/2。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

本发明实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

(1)试剂盒的组成及配制：

本申请在试验过程中发现了一种新的结直肠癌的诊断标志物—血清分泌型lncrnaloc100130899。本申请的试剂盒是专门针对该诊断标志物的检测而进行设计的。

本申请的试剂盒中包含：检测血清分泌型lncrnaloc100130899的引物。

所述引物是根据genebank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)上报的核苷酸序列nr_039988.1为模板而进行优化设计的，优化设计后的引物序列见表1。

表1引物序列及pcr产物长度

由于血清外泌体中lncrna非常容易降解，因此对血清外泌体中lncrna检测的难度很大。我们试验过程中针对lncrnaloc100130899基因不同区域设计了多组引物，结果发现，其扩增效果差异很大。表2给出的是我们在试验过程中针对lncrnaloc100130899基因三个区域设计outer引物进行pcr扩增，发现第三对引物具有较好的扩增效果，因此采用第三对引物作为后续巢氏实时定量pcr的outer引物。

表2引物序列的优选及相应的扩增区域

所述专用试剂盒还包括内参基因gapdh的一对outer引物和一对inner引物以及内参基因ubc的一对outer引物和一对inner引物和pcr反应液和qpcr反应液。pcr反应液由dna聚合酶、dntps、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁和水组成。qpcr反应液由sybergreenⅰ荧光染料、dna聚合酶、dntps、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁和水组成。

所述内参基因gapdh-outer-f引物：5’-tcaaggctgagaacgggaag-3’；10nm。

所述内参基因gapdh-outer-r引物：5’-tgatggcatggactgtggtc-3’；10nm。

所述内参基因gapdh-inner-f引物：5’-ggagcgagatccctccaaaat-3’；10nm。

所述内参基因gapdh-inner-r引物：5’-ggctgttgtcatacttctcatgg-3’；10nm。

所述内参基因ubc-outer-f引物：5’-tcggccttagaaccccagta-3’；10nm。

所述内参基因ubc-outer-r引物：5’-gagatccctccgcagaatcg-3’；10nm。

所述内参基因ubc-inner-f引物：5’-acgggacttgggtgactcta-3’；10nm。

所述内参基因ubc-inner-r引物：5’-atcgccgagaagggactact-3’；10nm。

所述sybergreenⅰ荧光染料在pcr反应液为1×sybergreenⅰ荧光染料。

所述dna聚合酶在pcr反应液和qpcr反应液中的终浓度为100u/ml。

所述dntps在pcr反应液和qpcr反应液中的终浓度为0.2mm。

所述氯化镁在pcr反应液和qpcr反应液中的终浓度为6mm。

所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐在pcr反应液和qpcr反应液中的终浓度为16.5mm。

所述氯化钾在pcr反应液和qpcr反应液中的终浓度为89.3mm。

(2)病例资料：

2016年1月至2016年6月期间山东大学齐鲁医院收治的结直肠癌患者132例，男75例，女56例，年龄27～85岁，中位年龄56岁，所有患者均经组织病理学确诊，且为初次诊断，之前未接受任何治疗。同时选择同期在山东大学齐鲁医院查体的健康体检者100例作为对照，男59例，女41例，年龄25～81岁，中位年龄53岁，所有受试者均未合并疾病，肝心肾功能正常，既往无肿瘤病史。两组间性别、年龄比较差异无统计学意义(p>0.05)。

(3)血清标本采集：血清收集于促凝管内，4℃1600×g离心10min，然后进一步4℃16000×g离心10min，收集血清，置-80℃冻存待测。

(4)提取血清分泌型rnas：取250μl血清与63μlexoquick^tmexosomeprecipitationsolution试剂混匀，室温静置30min；然后1500g离心30min，弃上清，加入750μltrizol试剂混匀，室温静置5min，加入200μl氯仿，剧烈震荡15s，室温静置5min，12000g离心15min，取上清加入500μl异丙醇，室温静置10min，12000g离心10min，弃上清，加入1ml75％乙醇洗涤，7500g离心5min，弃上清，加10μldepc水溶解备用。

(5)逆转录反应：采用逆转录试剂盒将rna逆转录为cdna，逆转录条件为：37℃15min、85℃5s。

(6)巢氏实时定量pcr扩增：取1:10稀释cdna为模板，加入outer引物和pcr反应液，进行第一阶段pcr反应，反应条件：首先95℃3min，然后95℃30s、60℃30s、72℃1min进行25个循环，最后72℃10min。取1:10稀释的第一阶段pcr产物，加入inner引物和qpcr反应液，进行第二阶段pcr反应，首先95℃10min，然后95℃15s、60℃34s进行35个循环，记录cq值。内参基因gapdh、ubc的逆转录巢氏实时定量pcr扩增，除引物外，其它方法相同；

(7)数据分析：lncrnaloc100130899的相对表达量采用2^-△△cq法计算，△cq＝[cq(待测样本)-cq(校对样本)]，△△cq＝△cq(lncrnaloc100130899)-△cq(内参基因)，cq(内参基因)＝[cq(gapdh)+cq(ubc)]/2。

(8)检测结果：

1)试剂盒敏感性评价

提取ht29结直肠癌细胞系总rna，逆转录为cdna，然后进行10倍倍比梯度稀释，得到10¹倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍稀释的cdnas，采用该试剂盒及方法检测lncrnaloc100130899，并与传统实时荧光定量pcr方法比较。结果如图1所示，由图1可知，采用该试剂盒及方法lncrnaloc100130899检测限可达到10⁷倍稀释；而传统方法检测限仅可达到10⁴倍稀释，表明本试剂盒及方法的灵敏度比传统方法高1000倍。

2)试剂盒特异性评价

对最终pcr的产物进行正向和反向测序，其中正向测序序列为：

5’-tccatccccgactttcctgtttcctcatgtgtcaaatggggatgatctcgagacgactctccagagtaaccacgtgaagcacctagcacaggggctgacgcaaacagctgggcatcggaggagcctccagggttgtgacctccagtggctt-3’；

反向测序序列为：

5’-atcaggccagctgtttgcgtcagcccctgtgctaggtgcttcacgtggttactctggagagtcgtctcgagatcatccccatttgacacatgaggaaacaggaaagttcggggatgtgaaattgcttgctggggtcattagctgttcggtggcagaga-3’。

将正、反向测序序列进行拼接，经blast分析，发现扩增产物与genebank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中lncrnaloc100130899序列完全匹配，说明本试剂盒扩增的最终pcr产物确为lncrnaloc100130899分子。结果见图2。

3)血清分泌型lncrnaloc100130899在结直肠癌患者中的表达

采用该试剂盒及方法对132例结直肠癌患者和100例健康体检者血清中分泌型lncrnaloc100130899进行检测，发现结直肠癌患者血清分泌型lncrnaloc100130899的中位表达水平为0.334(0.021-0.659)，明显高于健康体检者水平[0.151(0.090-0.390)]，两组经mann-whitneyu检验比较差异有统计学意义(p<0.05)。结果见图3。

4)血清分泌型lncrnaloc100130899对结直肠癌的诊断价值

以132例结直肠癌患者作为阳性组，100例健康体检者作为阴性组，medcalc9.3.9.0统计软件的受试者工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve，roc)分析，结果见图4，由图4可知，血清分泌型lncrnaloc100130899对结直肠癌的诊断效能为0.839(95％ci0.786-0.884)，明显高于传统肿瘤标志物cea的诊断效能0.624(95％ci0.558-0.687，p<0.001)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>山东大学齐鲁医院

<120>一种检测结直肠癌血清分泌型lncrnas的引物和试剂盒

<130>2017

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<212>dna

<213>人工序列

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