本发明涉及分子生物学检测领域，尤其涉及一种用于pd-1/pd-l1阻断治疗伴随诊断的免疫组测序技术。
背景技术：
肿瘤的免疫疗法是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型生物治疗方法。肿瘤免疫治疗是通过激活体内的免疫细胞，特异性地清除肿瘤微小残留病灶或明显抑制肿瘤细胞增殖的一种治疗方法。这种治疗方法具有作用期长和副作用小等优点，被称为现代肿瘤治疗的第4种模式。免疫检查点疗法(immunecheckpointtherapy)是一类通过调节患者体内t细胞活性来提高抗肿瘤免疫反应的治疗方法，免疫检查点在正常情况下能抑制t细胞的功能，同时在肿瘤组织中可能被肿瘤利用形成免疫逃逸，常见的免疫检查点包括ctla4,pd-1,lag-3,tim-3等，通过阻断免疫检查点可以释放被抑制的t细胞活性。而其中pd-1/pd-l1抗体阻断治疗这一肿瘤免疫疗法取得了显著突破。
pd-1是免疫球蛋白超家族cd28家族成员，为分子量50～55kd的ⅰ型跨膜糖蛋白，由类似iggv的结构域、跨膜结构域以及胞质尾部结构域组成。pd-l1是b7家族成员，是pd-1的配体，属于1型跨膜蛋白。多种肿瘤细胞表面上可表达pd-l1配体或在ifn-γ诱导下高表达pd-l1配体，当肿瘤细胞的pd-l1与淋巴细胞上的pd-1大量结合后，会抑制t细胞功能，使得肿瘤逃逸体内的免疫清除。而利用pd-1/pd-l1抗体阻断体内t细胞表达的pd-1受体与癌细胞表达的配体pd-l1之间的结合，可以使t细胞从免疫抑制状态下恢复发挥其细胞杀伤性功能，进而利用自身免疫系统将肿瘤细胞消灭。目前获得美国fda批准上市的pd-1抗体有默沙东的keytruda和施贵宝的opdivo，包括对恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、卵巢癌、膀胱癌、胃癌、头颈部及食管鳞状细胞癌等pd-1抗体都表现出良好的治疗效果。罗氏的pd-l1抗体新药atezolizumab也获得fda批准上市，用于治疗最常见的膀胱癌。然而pd-1/pd-l1抗体疗法并非对所有患者都有积极作用，相关数据显示只有20％左右的患者对pd-1/pd-l1抗体药物有积极反应，对于pd-1/pd-l1用药前进行伴随诊断以优化患者权益、最小化治疗时的毒副作用和指导联合治疗显得重要。伴随诊断作为一种与个体化医疗相关联的体外诊断技术，主要通过检测人体内蛋白、突变基因的表达水平，在不同类型的疾病人群中筛选出最佳用药人群，有针对性地进行个体化医疗。伴随诊断可提高伴随药物的安全性和有效性并能改善患者治疗预后和降低保健开支，伴随诊断技术有助于快速判断抗癌药物方案是否适合具体的患者。为了使对免疫治疗包括但不限于pd-1/pd-l1抗体疗法的反应最佳化，需要对患者用药前进行精准的伴随诊断，了解患者的免疫状态以设计一种有效的免疫治疗方案，筛选出对pd-1/pd-l1最有可能获益得患者，在此我们设计一种基于免疫组测序技术分析患者免疫状态的pd-1/pd-l1伴随诊断方法。
另外，目前市场上已经出现了一些临床批准的pd-1/pd-l1抗体免疫治疗伴随诊断产品，其主要是通过对患者癌组织中的pd-l1蛋白表达水平进行检测，然而对pd-1/pd-l1抗体治疗前检测所使用的免疫组化技术存在患者癌组织pd-l1表达不均一，所用pd-l1抗体识别表位不均一和正在使用的pd-l1表达水平的阳性阈值不统一等问题，(且有文献报道pd-l1的表达率与pd-1阻断抗体的反应率并不具有良好的相关性)，其它报道的针对免疫检查点抑制剂用药前的诊断方法，包括通过活检标本检测异位淋巴结样结构进而检测肿瘤侵润细胞的密度，构建基因表达谱尤其是β干扰素诱导的相关基因表达谱，以及mhcii(hla-dr)的高表达与临床反应增加有关的免疫基因印记检测，也只是在一定条件下可以做出较低准确率的pd-1抗体阳性效应患者的预测。此时，新一代高通量测序技术(ngs)则是个理想的解决方案，其可将一系列单基因检测的肿瘤图谱分析模式转化成多个分析物的方法，带来更为精准的肿瘤学。在检测体内免疫系统的多样性上，免疫组测序技术无疑具有独特的优势。
免疫组测序(immunerepertoiresequencing(rep-seq))是以t/b淋巴细胞为研究目标，以多重pcr或5’race技术扩增决定b细胞受体(bcr)或t细胞受体(tcr)多样性的互补决定区(cdr区)，再结合高通量测序技术(ngs)，全面评估免疫系统的多样性，深入挖掘免疫组库与疾病的关系的技术。t/b细胞受体在人体中处于动态重组过程中，对机体中出现的一系列病原体和抗原都可以进行识别。检测tcr在人类健康和疾病的重要性已被日益认识。通过免疫组测序技术得到的患者免疫组库数据依据对不同肿瘤的数据库的比对分析，可以对肿瘤患者免疫系统中的t/b细胞进行全面的分析，快速检测到患者体内肿瘤特异性t/b细胞的存在、多样性和克隆分布。
本发明的目的在于提供一种用于pd-1/pd-l1阻断治疗伴随诊断的免疫组测序技术，通过对患者体内的免疫系统状态进行检测和分析，确定患者对免疫治疗的效用和反应的可能性。
技术实现要素：
本发明提供一种用于pd-1/pd-l1阻断治疗伴随诊断的免疫组测序技术，本发明的技术方案是这样实现的：
一种用于pd-1/pd-l1阻断治疗伴随诊断的免疫组测序技术，包括以下步骤：(1)收集患者血液淋巴细胞或者癌组织的rna或基因组dna样本；(2)利用dna分子的标记方法对所得dna进行基于引物条码的pcr扩增；(3)利用随机引物条码中的测序接头进行tcr高通量测序；(4)基于所得到的受试者的高通量测序数据，分析tcr序列多样性和tcr序列分布分数以及tcr克隆性，确定受试者对pd-1或pd-l1免疫治疗的可能反应。
进一步地，所述步骤(1)中的样本来源于一个或者多个患者在一个或者多个时间点的样本。
进一步地，将所述步骤(1)中收集提取到的癌组织的rna逆转录为cdna。
进一步地，所述步骤(2)中分子标记方法为在dna两端加入过量的随机引物条码，使dna分子两端各标记对应的随机引物条码。
进一步地，所述的随机引物条码是由根据dna分子设计的特异性引物的下游引物、随机条码和测序接头以串联的方式组成的。
进一步地，所述步骤(3)的具体操作方法是将过量的随机引物条码加入到所述步骤(2)的pcr扩增体系中，利用随机引物条码中的测序接头进行高通量测序，测序具体步骤按照illumina平台步骤进行，测序数据进行vdj比对，分析cdr3序列，得到单个完整的免疫库谱。
进一步地，所述步骤(3)中测序接头与illumina的平台兼容。
进一步地，所述步骤(4)中tcr序列的多样性的确定方法是：根据所述步骤(3)中tcr高通量测序数据确定所述样品中重排序列的总数目和独特重排dna序列的总数目，从而定量一个或多个样品的tcr序列的多样性分数；所述步骤(4)中tcr分布数的确定方法是根据每个独特重排dna序列的出现频率和一个或多个样品中每个独特重排dna序列占所观测到的重排序列的总数目的百分比来确定的；所述步骤(4)中tcr克隆性是根据特异tcrdna序列的数量和出现频率的多少来确定的。
进一步地，所述步骤(4)中tcr序列多样性和tcr序列分布分数是受试者的免疫状态的确定依据，所述的tcr序列多样性和tcr克隆性是pd-1/pd-l1用药前的诊断依据。
进一步地，所述免疫组测序技术是针对pd-1抗体治疗和pd-l1抗体治疗中的任一种。
本发明的有益效果：本发明提供一种用于pd-1/pd-l1阻断治疗伴随诊断的免疫组测序技术，有效地解决了pd-1/pd-l1抗体肿瘤免疫疗法中存在的问题：pd-1/pd-l1抗体用药前患者免疫状态的评价，筛选出最有可能受益的患者。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1本发明用于pd-1/pd-l1阻断治疗伴随诊断的免疫组测序技术的流程图
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明样本收集和患者免疫组库构建方面，包括以下步骤：(1)从至少一个患者血液或癌症组织分离白细胞亚群，从该细胞亚群分离rna，在第一扩增反应中使用rt-pcr利用嵌套引物逆转录rna并进行扩增以产生扩增子，嵌套引物的至少一部分包含额外核苷酸以将针对公共引物的结合位点并入所得扩增子中，将第一扩增反应的扩增子与第一扩增反应的一种或多种未使用的引物分离，通过在第二扩增反应中添加公共引物来扩增第一扩增反应的具有至少一个针对公共引物的结合位点的扩增子，和对第二扩增反应的扩增子测序以识别细胞亚群中的抗体和/或受体重排；(2)然后分析同一样本的cdr3序列的结果，得到单个完整的免疫库谱。
用于产生免疫状态报告的方法包括以下步骤：(1)识别在受试者免疫谱与来自存储于数据库中的疾病库的累积免疫谱之间共有的一个或多个独特的cdr3序列，对对应于那些共有的独特cdr3序列的受试者的所检测出序列的总数求和并且计算受试者免疫谱中代表那些在受试者与疾病库之间共有的独特cdr3的所检测出序列总数的百分数，以产生一个或多个初始共有的指数。(2)对患者组织中tcr的多样性和克隆性进行分析。具体的，对患者核酸样品产生的高通量测序序列信息，包含多个独特重排核酸序列的序列，每一个独特核酸序列即为单独的tcr序列和多肽。对于一个或多个样品，根据核苷酸序列序列信息，确定所述样品中所观测到的重排序列的总数目以及样品中独特重排dna序列的总数目；根据其独特重排dna序列的总数目，定量一个或多个样品的tcr序列多样性；根据每个独特重排dna序列的出现频率计算出一个或多个样品中观测到的重排序列的总数目的百分比，从而来定量一个或多个样品的tcr分布分数；以及根据患者的tcr序列多样性分数和tcr序列分布分数来确定患者的免疫状态和对pd-1/pd-l1抗体药物的可能反应。
下面结合附图和转移性黑色素瘤患者pd-1治疗前的伴随诊断的技术方案做进一步介绍。本实施例的技术方案主要分为四个部分：样本收集、患者免疫组库构建、生物信息学分析和分析模型构建。
1.样本收集
(1)样本收集
收集患者外周血样本10毫升和穿刺组织样品一份。抽取患者的静脉血，在血浆分离中心进行12-15毫升的单采血液成分分离。在该程序期间获得患者的pbmc，目的是获取至少50×109个白细胞以备后续的建库，将获取的符合fda要求和研究的基线血细胞冷冻保存。
(2)血液淋巴细胞分离和rna提取
取2ml分层液置于离心管中，将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上，形成清晰界面。稀释血液与分层液的容积比例以2∶1～3∶1为宜。置水平离心机中2000r/min离心20min。离心后从离心管的底部到液面分为四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层(含血小板和破碎细胞)。用滴管直接吸出单个核细胞层或吸去血浆层后再吸该层，置于另一离心管中。加入4倍量以上的pbs液，充分混匀，1000r/min离心l0min。离心后倾弃上清液，再用pbs液洗2次。用含10％～20％灭活小牛血清的pbs液或培养液配制细胞悬液。计数，并分别计数粒细胞和单个核细胞数，同时用台盼蓝检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。分离出来的pbmc细胞用one-steprt-pcr(qingen)在rltbuffer中裂解，并按照one-steprt-pcr(qingen)的操作步骤进行rna提取。提取好的rna的浓度由
(3)组织rna提取
样品处理：取新鲜或-70℃冻存100mg组织加1ml裂解液，用组织研磨杵或匀浆器匀浆处理。将处理后的样品在室温放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。向匀浆样品中加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3-5分钟。2-8℃12000rpm离心10分钟。rna主要在上层无色的水相中，把水相转移到新管中，不要吸到沉淀。吸附柱前处理：在吸附柱中加入500ul洗柱液，室温放置2分钟，2-8℃12,000rpm离心2min，弃废液。第4步收集的上清中加入200ul无水乙醇混匀，加入吸附柱静置2分钟，2-8℃12000rpm离心2min，弃废液。向吸附柱中加入600μl漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，2-8℃12,000rpm离心2min，弃废液。向吸附柱中加入600μl漂洗液，2-8℃12,000rpm离心2min，弃废液。随后12000rpm离心2min，弃掉收集管，将吸附柱置于室温放置数分钟将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱放入新管中，向膜中央滴加50-100ulrnasefreeddh2o，室温放置5min，12000rpm室温离心2min即得到rna。
(4)基因组dna序列
在一些实施案例中，所提取的核酸包括患者的血液和癌组织的基因组dna序列。具体的基因组dna提取过程按照qiagen51306人类组织和细胞dna提取试剂盒，qiagen51104血液dna提取试剂盒的操作说明进行操作。本领域的研究人员应当知晓，以上对rna和基因组dna的提取过程，并不能局限于所述试剂盒和方法的提取过程，任何可以提取达到本专利要求的rna和dna方法都可以作为提取的过程。
2.患者免疫组库构建
在一些实施案例中，所提取的核酸包含基因组dna，在其它的实施案例中，所提取的核酸包含cdna，在一些实施案例中，所提取的核酸包含信使rna。cdna的合成采用one-steprt-pcr(qingen)的后续步骤进行。为能将所有t细胞受体的多样性覆盖，我们将设计多重pcr引物。正向引物设计将覆盖t细胞受体的v基因片段，通过设计11个正向引物以包括所有的v基因片段。5个反向引物设计将覆盖j基因片段(具体引物序列详见国家发明专利201310230809.9)。然后对cdna或基因组dna进行16周期的pcr第一次扩增，随后进行磁珠纯化。磁珠纯化pcr-1产物(agencourtampurexpsystembecmancoulter)后进行35个周期的pcr2以对tcrdna片段进行扩增。pcr产物由qiaquickpcrpurificationkit(qiagen)和qiaquickgelextractionkit(qiagen)来提纯。dna浓度由
3.生物信息学分析
患者测序样本在经过基本的分样筛选处理后，每一条序列都和imgt数据库中v,d和j基因片段的胚系参考序列进行比对，来确定它的v,d和j的类别。归类总结后，绘制vdj类别的数目分布。找出优势tcr克隆，并和患者手术前的tcr库进行对照，找出肿瘤特异抗原性的t细胞。然后运用统计中的团簇分析(clustering)来将tcr归类成克隆。定义出一个衡量tcr库多样性和克隆主导性的指数，通过香农熵(entropy)，呈现tcr库克隆性(基于通过占每个样品中存在的独特tcr序列的数目，标准化至(0-1)的tcr序列分布熵的修改量度)的平均和标准方差，将病人此指数和抑制响应pd-1治疗的模型指数相关联，构建分析pd-1治疗前的伴随诊断模型，将患者的tcr的克隆分布和模型进行比对以确定患者的免疫状态和对pd-1治疗的可能性。
在一些实施案例中，本发明的用于pd-1/pd-l1阻断治疗伴随诊断的免疫组测序技术还包括用于定量所述受试者的repertoire序列分布，具体方法为：提供一种用于确定患者免疫状态的计算机执行方法，对存储于多个时间点从多个患者样品获得的测序数据，确定组合出现频率和cdr3的克隆性。包括定量确定cdr3区序列多样性分数和确定样品中独特克隆的总数目。
在一些实施案例中，本发明的用于pd-1/pd-l1阻断治疗伴随诊断的免疫组测序技术还包括通过测量每个二倍体基因组的t细胞受体重排展示患者t细胞侵润的平均值和标准方差。
在一个实施方案中，所述反应是对免疫疗法的积极免疫应答。
4.分析模型构建
基于患者响应pd-1/pd-l1抗体药物的免疫组库的特征构建评价的标准，并和深度测序结合生物信息学分析所得到特定患者肿瘤特异性t细胞克隆性相比较，看两者是否符合。免疫疗法治疗的功效通过标准肿瘤学临床准则独立地进行评估。受试者具有如下表征：反应者(分成部分反应指示患者肿瘤负载减少，且疾病稳定指示缺乏进展且肿瘤负载不减少)或非反应者(疾病依旧进展)。展示每个患者的免疫系统对免疫疗法包括但不限于pd-1抗体疗法，有益的反应的相对能力通过在免疫疗法前tcr库分布的修改熵计算来预测。
使用修改熵计算(克隆性)，其中通过占所述肿瘤样品中观测到的独特tcr重排的数目，将每个肿瘤样品的tcr序列分布熵标准化至范围(0-1)，并取其倒数以使高标准化的熵变成低克隆性，反之亦然。在开始免疫疗法前，将患者肿瘤活检样品中存在的淋巴细胞tcr序列的分布克隆性是否和模型相比或者和对照组相比具有较高的分布克隆性，亦即少量高度扩增的t细胞克隆的tcr库，具有较高tcr克隆性的患者具有更好的pd-1抗体反应性。同时具有较高侵润度t淋巴细胞的患者更倾向于响应pd-1抗体治疗。