焦磷酸测序联合扩增阻滞技术检测KRAS基因12和13密码子低频突变引物及其应用的制作方法

本发明属分子病理诊断领域，具体涉及一种焦磷酸测序法联合扩增阻滞技术检测kras基因12和13密码子低频突变试剂盒和检测方法。

背景技术：

kras基因是公认的癌基因，参与egfr信号的传导过程。早在2008年6月在美国肿瘤学会(asco)年会上发布了临床研究结果，即kras基因突变型患者并不能从抗egfr治疗中获益，反而徒增不良反应危险和治疗费用；而kras野生型患者更可以从这类药物治疗中获益。同年10月，kras基因突变检测被写入最新版(2008年第三版)《美国国立癌症综合网络(nccn)结直肠癌临床实践指南》。该指南明确指出两点，一是所有转移性结直肠癌患者应检测kras基因状态，二是只有kras野生型患者才建议接受egfr抑制剂(如西妥昔单抗和帕尼单抗)治疗。另外，《09年nccn非小细胞肺癌临床实践指南》明确指出：当kras基因如果发生了突变，则不建议病人使用特罗凯/易瑞沙等进行分子靶向治疗。

目前，测序方法仍然是检测核酸序列突变的金标准，但是该方法对于所取样本中的肿瘤细胞的比例要求较高，一般大于50％，并且突变率低于20％的核苷酸突变，不能有效检测和判读，因此会造成假阴性。相比于测序技术，其它分子生物学检测方法，如荧光定量pcr，高效液相色谱技术等，存在结果不能准确定量等问题，因此会导致假阳性或假阴性。

pyrosequencing(焦磷酸测序)技术是新一代dna序列分析技术，被广泛用于基因型分析领域。该技术无须进行电泳，dna片段也无须特殊的荧光标记，操作极为简便。pyrosequencing技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dntp，若该dntp与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(ppi)。ppi可最终转化为可见光信号，并由pyrogramtm转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dntp，继续dna链的合成。相比传统测序技术和荧光定量pcr检测方法，降低了样本取材的要求(只需较少的肿瘤组织，低肿瘤细胞含量仍可检测)，具有更高的灵敏度，可定量检测低至1～5％的突变，准确性高，更适合于高通量分析，结果直观，判读更加简单、准确、快速，具有无可比拟的优势。但是针对临床上一些特殊标本，如血浆、胸腹水等来源的标本，5％的检测灵敏度远远不够。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种焦磷酸测序联合阻滞技术检测kras基因12和13密码子低频突变引物。

本发明还要解决的技术问题是一种焦磷酸测序联合阻滞技术检测kras基因12和13密码子低频突变试剂盒。

本发明还要解决的技术问题是提供上述试剂盒的检测方法。

本发明最后要解决的技术问题是焦磷酸测序联合阻滞技术检测kras基因12和13密码子低频突变引物在检测kras基因12和13密码子低频突变中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种焦磷酸测序联合扩增阻滞技术检测kras基因12和13密码子低频突变引物，其特征在于，包括seqidno.：1～2所示的扩增引物、seqidno：3所示测序引物、seqidno：4所示扩增阻滞引物；

其中，seqidno：2其5’端标记生物素；seqidno：4其3’端磷酸化处理；

以上核酸序列在一次检测中共同使用，其中，seqidno.：1～2所示的扩增引物用于扩增kras基因12和13密码子。

本发明中，通过引入扩增阻滞引物，降低了野生型序列的扩增，相对增加了突变基因型的扩增，结合焦磷酸测序技术大大提高了检出灵敏度。相比于现在临床上普遍采用的arms检测kras基因12、13密码子突变的方法(1％灵敏度)，检测灵敏度提高至0.1％，提高了临床标本的阳性检出率，可以为更多的患者提供了准确的用药参考。

一种焦磷酸测序联合扩增阻滞技术检测kras基因12和13密码子低频突变试剂盒，它包括如下试剂：

(1)dna提取试剂；

(2)pcr反应试剂：pcr缓冲液，引物seqidno：1～4，2mmmgcl2，0.2mmdntps，2u/μltaqdna聚合酶；

(3)单链纯化试剂：75％(v/v)乙醇溶液，0.2mnaoh，10mmph7.6三(羟甲基)氨基甲烷醋酸盐溶液，结合缓冲液，退火缓冲液；

(4)测序试剂：dna聚合酶，atp硫酸化酶，荧光素酶，三磷酸腺苷双磷酸酶，底物aps，荧光素和dntp。

其中，所述pcr缓冲液包括：0.1％(v/v)np-40，0.02％(v/v)明胶，0.06％(w/v)g/mlbsa，0.1％(v/v)tween-20，0.06mph8.9tricine。

其中，所述结合缓冲液包括：10mmtris-hcl，2mnacl，1mmedta，0.1％(v/v)tween-20；所述退火缓冲液包括：20mmph7.6tris-acetate，2mm醋酸镁。

一种焦磷酸测序联合扩增阻滞技术检测kras基因12和13密码子低频突变的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取石蜡活检标本组织中的基因组dna；

(2)以步骤(1)中所得基因组dna为模板，pcr扩增包含kras基因12和13密码子核酸序列片段；

(3)将步骤(2)得到的pcr扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化；

(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；

(5)测序得到snp突变频率。

步骤(2)中，

pcr扩增的体系为：10×pcr缓冲液5μl，seqidno：10.5μl，seqidno：20.5μl，seqidno：45ul，模板dna3μl，0.2mμdntps，2mmmgcl2，taqdna聚合酶2u，加无菌水补足至50μl；

pcr扩增条件为：94℃5min；50个循环，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min，16℃终止反应。

上述焦磷酸测序联合扩增阻滞技术检测kras基因12和13密码子低频突变引物在检测kras基因12和13密码子低频突变中的应用在本发明的保护范围之内。

本发明设计了包含kras基因12、13密码子的引物，联合扩增阻滞技术和焦磷酸测序技术，进行kras基因12、13密码子低频突变的方法和试剂盒。该方法可快速准确的检测低至0.1％的突变。其重要意义在于：(1)指导肺癌患者有针对性用药，避免无效用药；(2)改善预后；(3)避免获得耐药；(4)降低对样本组织的取材要求；(5)减少医疗费用。

有益效果：本发明的焦磷酸测序联合阻滞技术检测kras基因12和13密码子低频突变的方法和试剂盒，可以准确检测kras基因12和13密码子低频突变。本发明方法操作简单，敏感性高，降低了样本取材要求，结果易于判读，大大降低了检测结果的假阳性或者假阴性率，为患者避免无效靶向药物的使用，节省宝贵的治疗时间。

附图说明

图1为1例石蜡组织标本经该方法和试剂盒检测后，未发现突变。

图2为突变频率为0.2％的标准品(12密码子ggt>gat)，经本方法检测后，突变频率变为4.5％

图3为突变频率为2％的标准品(12密码子ggt>gat)，经本方法检测后，突变频率变为11.1％。

图4为突变频率为10％的标准品(12密码子ggt>gat)，经本方法检测后，突变频率变为25.5％。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：试剂。

(1)dna提取试剂：

购自qiagen公司。

(2)反应液：

pcrbuffer：购自美国fermentas公司；

引物seqidno：1～4，由上海英俊生物科技有限公司合成；

mgcl2：购自美国fermentas公司；

0.2mmdntps：购自美国fermentas公司；

2u/μltaqdna聚合酶：购自美国fermentas公司。

(3)单链纯化试剂：

75％(v/v)乙醇溶液：购于杭州长征化学试剂有限公司；

0.2mnaoh：购于上海试四赫维化工有限公司；

10mmtris-acetate(ph7.6)：tris-base购于美国sigma公司，无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司；

结合缓冲液：由10mmtris-hcl(tris-base购于美国sigma公司，盐酸购于杭州化学试剂有限公司),2mnacl(购于上海试四赫维化工有限公司)，1mmedta(购于杭州化学试剂有限公司)，0.1％(v/v)tween20(购于美国sigma公司)组成；

退火缓冲液：由20mmtris-acetate(ph7.6)(tris-base购于美国sigma公司，无水乙酸购于杭州化学试剂有限公司)，2mm醋酸镁(购于上海试四赫维化工有限公司)组成；

亲和素标记的磁珠(购于gehealthcarebioscienceab)。

(4)测序试剂：

dna聚合酶、atp硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶：购于qiagen公司；

底物aps和荧光素：购于qiagen公司；

四种dntp(datps，dttp，dctp，dgtp)：购于qiagen公司。

实施例2：检测方法。

仪器：bio-rads1000pcr仪，beckmanmicrofuge22r台式微量冷冻离心机，北京六一琼脂糖凝胶电泳仪、上海培清凝胶成像系统，qiagenpyromarkq96id测序仪。

(1)提取石蜡标本组织dna，具体步骤如下：将石蜡标本置于二甲苯中，去除石蜡；加入裂解缓冲液和蛋白酶k，在变性条件下消化组织，裂解细胞；置于90℃孵育，逆转福尔马林交联；将裂解液通过硅胶膜使dna吸附到硅胶膜上，加入漂洗液洗涤杂质，最后将高纯、浓缩的dna从硅胶膜上洗脱，得到基因组dna收集液。

(2)以步骤(1)所得dna为模板，利用kras基因12/13密码子特异性引物进行pcr扩增；其中，所述的pcr扩增体系为：10×pcrbuffer5μl，seqidno：10.5μl，seqidno：20.5μl，seqidno：45ul，templatedna3μl，0.2mμdntps，2mmmgcl2，taqdna聚合酶2u，加无菌水补足至50μl；pcr扩增条件为：94℃5min；50个循环，94℃40s，60℃40s，72℃40s；72℃3min，16℃终止反应。(3)将步骤(2)得到的pcr扩增产物与亲和素标记的磁珠结合进行单链纯化：

(a)在使用前，保证所有溶液都达到室温；

(b)在psq96板中加入45μlannealingbuffer，然后每孔加入seqidno：3测序引物(10um)1ul；

(c)使用vertex混匀sepharosebeads,将需要使用的sepharoebeads总量(每样本3μl)转移到一个eppendorf管中，在sepharosebead中加入bindingbuffer，使得平均每个样品约有50μl的体积，将混合物混匀；

(d)将以上混合物加入pcr产物(50μl反应体积)中，每样本50μl，将pcr产物在常温下混匀10分钟，使得beads与生物素结合；

(e)在vacuumprepworkstation中，四个样品板中依次加入180ml高纯水、70％乙醇、washingbuffer和120mldenaturationbuffer；

(f)打开vacuumprepworkstation的泵，将vacuumpreptool在高纯水中清洗30秒,然后将vacuumpreptool移到pcr板中，抓取sepharosebeads，将vacuumpreptool放入70％乙醇中5秒，然后移到denatureationbuffer中5秒，再移到washingbuffer中清洗10秒，把吸头放在相应含有测序引物的板孔的上方，不要接触液面，关掉泵，将vacuumpreptool放入含有测序引物的板中，摇动，释放sepharosebeads；

(g)使用高纯水清洗vacuumpreptool。

将放有样品的psq96板放在thermoplate上加热到80℃2分钟，再冷却到室温后放入测序仪中。

(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行焦磷酸测序；

(5)读取测序结果。

将本发明方法用于1例临床石蜡组织标本的检测，测序结果如图1所示。

sequencelisting

<110>杭州迪安医学检验中心有限公司

<120>焦磷酸测序联合扩增阻滞技术检测kras基因12和13密码子低频突变引物及其

应用

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<223>扩增kras基因12和13密码子的下游引物

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<223>扩增阻滞引物

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