细胞活力检测试剂及其用途的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种细胞活力检测试剂，主要用于检测细胞的活力。
背景技术：
：细胞增殖是细胞生命活动的重要特征之一，是生物体生长、发育、繁殖以及遗传的基础。细胞增殖异常就会导致一系列疾病，比如再生障碍性贫血，动脉粥样硬化或恶性肿瘤等。细胞毒性是由化学物质作用于细胞基本结构或细胞的生理过程，如细胞膜或细胞骨架结构，细胞的新陈代谢过程，细胞组分或产物的合成，降解或释放，离子调控及细胞分裂等过程，导致细胞存活、增殖或功能紊乱，所引起的不良反应。细胞毒性是不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡。细胞增殖与细胞毒性的检测方法主要有：mtt法、xtt法、wst-1法及wst-8法等。mtt法是二十世纪八十年代发展起来的一种快速、简便的测试方法，已被广泛用于药物体外筛选实验，与以往细胞水平研究中检测细胞活性的两种常规方法——细胞计数法和同位素掺入法相比，mtt法具有操作简便、快速、准确及不使用同位素等优点。随着研究的发展，出现了mtt的升级替代产品，如xtt，wst-1及wst-8等。wst-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2h-四唑单钠盐)是目前广泛应用的mtt升级产品，其工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，可被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜，颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比，使用酶标仪在450nm波长处测od值，间接反映细胞数量。wst-8相对前代具有明显的优点：首先，mtt被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的甲臜不是水溶性的，需要特定的溶解液进行溶解，而wst-8和xtt、mts产生的甲臜都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，wst-8产生的甲臜比xtt和mts产生的甲臜更易溶解。再次，wst-8比xtt和mts更稳定，使实验结果更加稳定。另外，wst-8和mtt、xtt等相比，线性范围更宽，灵敏度更高。cck8试剂盒是日本同仁化学研究所基于wst-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2h-四唑单钠盐)开发的细胞活力快速高灵敏度检测试剂盒，已广泛应用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等领域。与上代mtt法等方法相比，cck8法灵敏度更高，且不使用有机溶剂，对细胞毒性低，非常适合悬浮细胞高通量药物筛选，但存在价格昂贵、质量可靠性差、对ph值和温度比较敏感和药物影响大等缺陷。技术实现要素：为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种细胞活力检测试剂盒及其应用。为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：一方面本发明公开了一种细胞活力检测试剂，所述试剂包括缓冲液、wst-8和吩嗪硫酸甲酯，所述wst-8与吩嗪硫酸甲酯的摩尔比为15～20:1。wst-8是指化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2h-四唑单钠盐。优选地，所述试剂盒中还包括醋酸钠，所述醋酸钠与吩嗪硫酸甲酯的摩尔比为0.1～0.2:1。优选地，所述试剂盒中还包括丁酸钠，所述丁酸钠与吩嗪硫酸甲酯的摩尔比为0.05～0.1:1。优选地，吩嗪硫酸甲酯的浓度为8～10mmol/l。优选地，所述缓冲液选自水。优选地，所述wst-8的原料纯度大于98％。本发明的另一方面公开了上述的细胞活力检测试剂用于检测细胞活力的用途。优选地，所述检测细胞活力是指用于在药物筛选实验、细胞增殖测定实验、细胞毒性测定实验或者肿瘤药敏试验中检测细胞的活力。本发明的另一方面公开了一种试剂盒，所述试剂盒包含如上所述的细胞活力检测试剂。所述试剂盒即将上述试剂置于合适的包装材料内形成。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明所述的试剂盒稳定性好，在不同ph和温度检测数值相差较小，同时与细胞反应更快，20min后即可检测出结果，相比原有的cck8试剂盒需要1h以上反应时间而言，提高了效率，节省了时间。附图说明下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。图1为实施例1中a549细胞在450nm处的吸光度。图2为实施例2中hela细胞在450nm处的吸光度。具体实施方式在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本
技术领域：
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
技术领域：
的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
技术领域：
常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。表1实验使用的试剂购买公司货号wst-8santacruzsc-391198吩嗪硫酸甲酯sigmap9625醋酸钠sigma71196丁酸钠sigmaark2161实施例1、试剂盒检测a549细胞活性；制备hanbio-cck8试剂：配制细胞活力检测试剂10ml，其中溶剂是水，wst-8的浓度是200mmol/l，吩嗪硫酸甲酯的浓度是10mmol/l，醋酸钠的浓度是1mmol/l，丁酸钠的浓度是1mmol/l。其中wst-8采用是纯度为99％的原料。检测细胞活力：1、第一天在96孔板中接种不同细胞数量的a549细胞悬液(7000，2*7000，4*7000，8*7000)，将培养板放在培养箱培养(37℃，5％co2)。2、第二天，向每孔加入10ul的细胞活力检测试剂(hanbio-cck8)(同时注意避免在孔中生成气泡，因为气泡会影响o.d值的读数)。3、将培养板在培养箱内孵育2小时。4、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。应用本试剂测试a549细胞结果如图1。对照实验：采用市售同仁的cck8试剂盒作为对照实验，在相同的实验条件下，检测细胞的活力。检测结果显示：实验结果表明本发明所述的试剂使得吸光细胞数目更多，可以精确反映a549细胞的细胞活力情况，灵敏度比市售同仁化学的cck8试剂盒更高。实施例2、hanbio-cck8试剂盒检测药物对hela细胞毒性制备hanbio-cck8试剂：配制细胞活力检测试剂10ml，其中溶剂是水，wst-8的浓度是120mmol/l，吩嗪硫酸甲酯的浓度是8mmol/l，醋酸钠的浓度是1.6mmol/l，丁酸钠的浓度是0.04mmol/l。其中wst-8采用是纯度为99％的原料。检测方法：1、在96孔板中接种8*10^4hela细胞，将培养板放在培养箱培养(37℃，5％co2)。2、37℃培养箱中贴壁培养4小时。3、加入不同浓度的deltamethrin药物(0，0.5ug/ml，1ug/ml，2ug/ml)4、37℃培养箱中培养6小时。5、向每孔中加入10ul的细胞活力检测试剂(hanbio-cck8)同时注意避免在孔中生成气泡，因为气泡会影响o.d值的读数)。6、将培养板继续在培养箱内孵育2小时。7、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。应用本发明所述的试剂测试deltamethrin对hela细胞结果如图2。对照实验：采用市售同仁的cck8试剂盒作为对照实验，在相同的实验条件下，检测细胞的活力。检测结果显示：本发明所述试剂使得吸光细胞数目更多，可以精确反映deltamethrin药物对hela细胞的杀伤作用,灵敏度比市售同仁化学的cck8试剂盒更高。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12