褐色中脉3基因特异性标志物在玉米中用于性状基因渗入的用途的制作方法

本申请是2011年5月11日提交的申请号为201180023543.x(pct申请号为pct/us2011/036118)、发明名称为“褐色中脉3基因特异性标志物在玉米中用于性状基因渗入的用途”的发明专利申请的分案申请。

优先权要求

本申请要求2010年5月12日提交的美国临时专利申请流水号61/334,07的关于“useofbrownmidrib-3genespecificmarkersinmaizefortraitintrogression”的提交日的权益。

发明领域

一般而言，本公开内容涉及植物育种。提供了用于测定含有褐色中脉3(bm3)突变的植物的接合性(zygosity)的方法。公开内容的方法进一步可用于增强含有bmr的植物系的育种过程。

发明背景

木质素是植物中与碳水化合物，诸如细胞壁中的半纤维素形成交联的通用组分。木质素聚合物在反刍类中降低纤维消化，并且木质化的程度可以与饲料作物消化率(digestibility)成反比。cherney等(1991)adv.agron.46:157-98。含有褐色中脉(bmr)突变的玉蜀黍展现出与显著降低的木质素含量、改变的木质素组成和改善的消化率有关的叶中脉的微红褐色色素沉着。已经在玉米中鉴定出至少四处独立的bmr突变。kuc等(1968)phytochemistry7:1435-6。在与对照玉米相比时，这些突变(称作“bm1、bm2、bm3和bm4”)都展现出降低的木质素含量。bm3突变包括咖啡酸o-甲基转移酶(comt，例如，genbank登录号m73235)基因内的插入(bm3-1)、缺失(bm3-2)和插入/缺失(bm3-3)。morrow等(1997)mol.breeding3:351-7；vignols等(1995)plantcell7:407-16。

comt基因控制木质素生物合成中牵涉的酶活性。comt利用s-腺苷甲硫氨酸(adenylsylmethionine)对咖啡酸进行转甲基化，这导致生成阿魏酸。最终，自阿魏酸生成松柏醇和芥子醇。在存在自由基的情况中松柏醇、阿魏酸和芥子醇的组合导致木质素生成。bm3突变已经得到表征，并且认为其通过基因灭活抑制咖啡酸的转甲基化。guilletclaude等(2004)theor.appl.genet.110:126-35；piquemal等(2002)plantphysiology130:1-11；he等(2003)cropsci.43:2240-51；morrow等(1997)mol.breeding3:351-7；vignols等(1995)plantcell7:407-16。然而，尚未开发出特异性检测并测试特定植物在bm3基因座处的接合性的快速方法。

发明概述

本文中公开了用于bmr玉米品种(例如，bm3突变体)的基于高通量pcr的分子表征的方法，其可以极大地增强含有bmr的品系的育种过程。公开了用于测定植物组织样品，并且因此制备样品的植物的接合性的方法，其通过测定bm3突变体和野生型comt等位基因的存在或缺乏进行。如此，提供了基于端点水解探针pcr的接合性测定法(其在本文中称为测定法)，其特异性检测并测试bm3基因座处的接合性状态。公开了利用同一测定法对中bm3突变体和相应的野生型序列特异性的寡核苷酸的双重性(biplex)的测定法。

具体地，本公开涉及如下各项：

1.一种使用玉米植物组织确定等位基因的接合性和/或存在/缺乏的方法，该方法包括：

自所述玉米植物组织获得分离的基因组dna的样品；

使所述分离的基因组dna与至少一种包含能够在高严格性条件下与seqidno:10杂交的核苷酸序列的核酸分子和至少一种能够在高严格性条件下与seqidno:11杂交的核酸分子接触；并

确定所述分离的基因组dna中bm3突变的接合性。

2.项1的方法，其进一步包括：

使所述分离的基因组dna与两种各包含能够在高严格性条件下与seqidno:10杂交的核苷酸序列的核酸分子，和两种能够在高严格性条件下与seqidno:11杂交的核酸分子接触；

扩增所述分离的基因组dna的在所述分离的基因组dna中与如下两种核酸分子杂交的核苷酸序列间的核苷酸序列，所述核酸分子各包含能够在高严格性条件下与seqidno:10杂交的核苷酸序列；

扩增所述分离的基因组dna的在所述分离的基因组dna中与如下两种核酸分子杂交的核苷酸序列间的核苷酸序列，所述核酸分子各包含能够在高严格性条件下与seqidno:11杂交的核苷酸序列；

扩增反应中包括包含能够在高严格性条件下与seqidno:10杂交的核苷酸序列且用第一报告物标记的至少一种核酸分子，和能够在高严格性条件下与seqidno:11杂交且用第二报告物标记的至少一种核酸分子；并

检测所述第一和第二报告物的水平。

3.项2的方法，其中所述第一报告物和所述第二报告物是具有可区别的激发/发射光谱的荧光染料。

4.项3的方法，其中所述第一报告物是fam，且所述第二报告物是vic。

5.项1的方法，其中所述至少一种包含能够与seqidno:10杂交的核苷酸序列的核酸分子的长度是10-35个核苷酸。

6.项5的方法，其中所述至少一种包含能够与seqidno:10杂交的核苷酸序列的核酸分子的长度是15-30个核苷酸。

7.项5的方法，其中所述至少一种包含能够与seqidno:10杂交的核苷酸序列的核酸分子之一与seqidno:10的10-35个连续的核苷酸是至少95％相同的。

8.项7的方法，其中所述至少一种包含能够与seqidno:10杂交的核苷酸序列的核酸分子选自下组：seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6。

9.项1的方法，其中至少一种包含能够在高严格性条件下与seqidno:10杂交的核苷酸序列的核酸分子用荧光染料标记，而至少一种能够在高严格性条件下与seqidno:11杂交的核酸分子用具有可区别的激发/发射光谱的第二荧光染料标记。

10.项9的方法，其中至少一种包含能够在高严格性条件下与seqidno:10杂交的核苷酸序列的核酸分子用fam标记，而至少一种能够在高严格性条件下与seqidno:11杂交的核酸分子用vic标记。

11.项1的方法，其中扩增所述核苷酸序列包括在pcr反应中扩增。

12.项1的方法，其中扩增所述核苷酸序列包括在基于非pcr的反应中扩增。

13.一种用于鉴定玉蜀黍中comt突变的方法，该方法包括将玉蜀黍核酸暴露于包含seqidno:6的核酸分子。

14.一种用于可靠且可预测地将低木质素含量的性状基因渗入植物种质中的方法，所述方法包括：

将在comt基因中具有突变的植物与另一种植物杂交；

自通过所述杂交生成的后代植物获得分离的基因组dna的样品；

使所述分离的核酸与至少一种核酸分子接触，所述核酸分子具有能够在高严格性条件下与seqidno:10杂交的核苷酸序列；并

通过繁殖获得样品的植物自所述杂交选择在所述comt基因中包含突变的后代，所述样品以高严格性结合所述至少一种核酸分子，由此生成遗传工程化植物，其中低木质素含量的性状已经基因渗入所述遗传工程化植物的种质中。

15.一种具有通过项1的方法确定的接合性的玉米植物。

16.一种具有通过项2的方法确定的接合性的玉米植物。

17.一种通过项14的方法生成的遗传工程化植物，其展现出低木质素含量。

18.一种通过项14的方法确定的玉米植物，其用特异性等位基因检测测试得到。

19.一种通过项14的方法确定的玉米植物，其用特异性等位基因检测测试得到。

附图简述

图1包括具有bm3突变的comt基因和为comt基因的部分扩增(约1.8kbp)设计的寡核苷酸的图示。

图2包括来自12种bm3系和3种非bm3系(野生型系)的部分comt基因序列的扩增的描绘。将pcr产物在2％e上显现，然后经由0.8％eclonewell提取，随后克隆入pcr4载体中。

图3包括来自bm3突变体和野生型comt基因的共有序列的比对。三处先前描述的缺失/插入突变加下划线。

图4包括comt基因及对bm3突变和完整的comt基因特异性的引物的图示。(a)具有点线的comt基因代表bm3缺失。comt基因特异性引物在缺失位点内。(b)bm3突变体基因。bm3特异性寡核苷酸在缺失位点侧翼的正向和反向寡核苷酸和探针跨越缺失区的接合中。

图5a和5b包括实时pcr扩增图，其中对具有fam的bm3(a)和(b)具有vic(由于实时pcr仪的限制而用hex替换)的野生型comt显示相对荧光单位(rfu)。对于bm3和野生型comt基因两者，从循环22至36观察到指数扩增期。

图6包括使用基于第30个循环时fam作为等位基因1(纯合bm3)和vic(由于仪器限制而用hex替换)作为等位基因2(纯合野生型comt)的相对荧光单位的等位辨别测定法进行的基因型测定。

图7包括用端点测定法进行的bm3接合性测定。在完成pcr和荧光阅读后，产生分布图，如下文所描述的：sob1＝fam的高于背景的信号(高于535nm的背景信号平均值的样品信号)，sob2＝vic的高于背景的信号(高于560nm的背景信号平均值的样品信号)。用对数尺度以sob1/sob2<1(对于野生型)、1<sob1/sob2<5(对于半合子)、和sob1/sob2>5(对于纯合子)进行基因型测定。

图8包括用端点测定法进行的bm3接合性测定。在klims(kbioscience实验室信息管理系统)中分析直接来自读板仪的原始荧光强度数据。产生具有在x轴上绘图的fam和在y周上绘图的vic的rfu(相对荧光单位)的图。基于簇视图中的簇分离进行接合性测定。

序列表

使用如37c.f.r.§1.822中定义的核苷酸碱基的标准字母缩写显示所附序列表中列出的核酸序列。仅显示每种核酸序列的一条链，但是互补链理解为通过对展示链的任意引用而包括在内。在所附序列表中：

seqidno:1显示用于扩增玉米comt部分基因的正向引物序列(bm35_f)：tactctactggctgcggctagc。

seqidno:2显示用于扩增玉米comt部分基因的反向引物序列(bm35_r)：taaccttgattgttattactcgcacatgg。

seqidno:3显示用于对玉米comt部分基因测序的来自comt基因的寡核苷酸序列(bm1234r)：atcagcatcagccaggcagg。

seqidno:4显示用于鉴定突变体bm3等位基因的正向引物序列(bm3_f)：aaaaagaacgaggttgcaaaagata。

seqidno:5显示用于鉴定突变体bm3等位基因的反向引物序列(bm3_r)：ttagaatccacgacatgcaagag。

seqidno:6显示具有在5’端的fam和3’端的mgbnfq的用于鉴定突变体bm3等位基因的探针序列(bm3_探针)：fam-acaaaccaaaggatgtcg-mgbnfq。

seqidno:7显示用于鉴定野生型comt等位基因的正向引物序列(comt_f)：cgcactcgacgacgatgac。

seqidno:8显示用于鉴定野生型comt等位基因的反向引物序列(comt_r)：cacgctgctcaagaactgcta。

seqidno:9显示具有5’端的vic和3’端的mgbnfq的用于鉴定野生型comt等位基因的探针序列(comt_探针)：vic-cattttccggcagcgc-mgbnfq。

seqidno:10显示bm3核苷酸序列。

seqidno:11显示部分comt核苷酸序列。

发明详述

i.几个实施方案的概述

本文中公开了用于bm3玉米品种的基于高通量pcr的分子表征的方法，其可以极大地增强含有bmr的植物系的育种过程。在具体的实施方案中，该方法可以包括自玉米植物获得分离的基因组dna的样品，使分离的基因组dna与至少一种包含能够在高严格性条件下与seqidno:10杂交的核苷酸序列的核酸分子和至少一种包含能够在高严格性条件下与seqidno:11杂交的核苷酸序列的核酸分子接触，并测定来自玉米植物的分离的基因组dna中bm3突变的接合性。在具体的实施方案中，至少一种包含能够在高严格性条件下与seqidno:10杂交的核苷酸序列的核酸分子和至少一种包含能够在高严格性条件下与seqidno:11杂交的核苷酸序列的核酸分子的长度是10-35个核苷酸。在一些实施方案中，至少一种包含能够在高严格性条件下与seqidno:10杂交的核苷酸序列的核酸分子与seqidno:10的10-35个连续的核苷酸是至少95％相同的。在一些实施方案中，至少一种包含能够在高严格性条件下与seqidno:11杂交的核苷酸序列的核酸分子与seqidno:11的10-35个连续的核苷酸是至少95％相同的。在一些实施方案中，能够在高严格性条件下与seqidno:11杂交的核苷酸序列不能够在高严格性条件下与seqidno:10杂交。在某些实施方案中，至少一种包含能够与seqidno:10或seqidno:11杂交的核苷酸序列的核酸分子选自下组：seqidno:1-9。

还公开了用于鉴定玉米植物中bmr突变的方法。在一些实施方案中，该方法可以包括将来自玉米植物的基因组dna暴露于能够在高严格性条件下与seqidno:10杂交的核酸分子。在具体的实施方案中，能够在高严格性条件下与seqidno:10杂交的核酸分子可以选自下组：seqidno:4、seqidno:5和seqidno:6。

进一步公开了用于可靠且可预测地将低木质素含量的性状基因渗入(例如，经由将bm3等位基因基因渗入)植物种质中的方法。在一些实施方案中，该方法可以包括将在comt基因中具有突变的植物与另一种植物回交，自通过杂交生成的后代获得分离的基因组dna的样品，使分离的基因组dna的样品与至少一种包含能够在高严格性条件下与seqidno:11杂交的核苷酸序列的核酸分子接触，并通过繁殖获得分离的基因组dna的样品的植物自所述杂交选择在所述comt基因中包含突变的后代，所述分离的基因组dna的样品在高严格性的情况中结合至少一种包含能够在高严格性条件下与seqidno:11杂交的核苷酸序列的核酸分子，由此生成遗传工程化植物，其中低木质素含量的性状已经基因渗入所述遗传工程化植物的种质中

还公开了具有依照公开内容的基于高通量pcr的分子方法测定的基因型和/或接合性的玉米植物，及依照公开内容的用于可靠且可预测地将低木质素含量的性状基因渗入玉米植物种质中的方法生成的展现出低木质素含量性状的遗传工程化玉米植物。

ii.缩写

bmr褐色中脉

mgbnfq小沟结合非荧光淬灭剂^tmi

fam6-羧基荧光素

pcr聚合酶链式反应

rfu相对荧光单位

vic6-羧基罗丹明

iii.术语

在以下的描述和表中，使用许多术语。为了提供说明书和权利要求书(包括此类术语要给予的范围)的清楚且一致的理解，提供了下列定义：

回交：回交是育种者将杂种后代返回与亲本之一，例如具有f1杂种的亲本基因型之一的第一代杂种f1重复杂交的方法。

bmr玉米：如本文中所使用的，术语“bmr玉米”指含有褐色中脉突变，诸如以bm1、bm2、bm3和bm4表征的突变的玉米品种。bmr玉米品种通常展现出叶中脉的微红褐色色素沉着。bmr玉米通常还以较低的木质素含量、较高的纤维消化率和较高的干物质摄取为特征。bmr玉米品种的非限制性例子包括f2f297、f2f383、f2f488、f2f449、f2f566、f2f610、f2f622、f2f665、f2f633、f2f682、f2f721、f2f700和f2f797。

杂交：寡核苷酸及其类似物通过互补碱基间的氢键合(其包括沃森-克里克、hoogsteen或反hoogsteen氢键合)杂交。一般地，核酸分子由作为嘧啶(胞嘧啶(c)、尿嘧啶(u)和胸腺嘧啶(t))或嘌呤(腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g))的含氮碱基组成。这些含氮碱基在嘧啶与嘌呤间形成氢键，并且嘧啶与嘌呤的键合称为“碱基配对”。更具体地，a会与t或u氢键键合，而g会与c键合。“互补的”指两种独特的核酸序列或同一核酸序列的两个独特区间发生的碱基配对。

“特异性可杂交的”和“特异性互补的”是指示足够的互补性程度，使得寡核苷酸和dna或rna靶物间发生稳定的且特异性的结合的术语。寡核苷酸与要特异性可杂交的其靶序列不需要是100％互补的。在寡核苷酸与靶dna或rna分子的结合干扰靶dna或rna的正常功能，并且有足够的互补性程度，从而避免寡核苷酸与非靶序列在期望特异性结合的条件下，例如在生理学条件下(在体内测定法或系统的情况中)非特异性结合时，寡核苷酸是特异性可杂交的。此类结合称为特异性杂交。

导致特定严格性程度的杂交条件会随选择的杂交方法的性质和杂交核酸序列的组成和程度而有所变化。一般地，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是na⁺和/或mg²⁺浓度)会促成杂交的严格性，尽管清洗次数也影响严格性。关于获得特定的严格性程度需要的杂交条件的计算在sambrook等(编),molecularcloning:alaboratorymanual,第2版,第1-3卷,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,newyork,1989,第9章和第11章中讨论。

出于本公开内容的目的，“严格条件”涵盖若杂交分子与靶序列间存在有小于25％错配会发生杂交的条件。“严格条件”可以进一步限定成特定的严格性水平。如此，如本文中所使用的，“中等严格性”条件是具有超过25％错配的分子不会杂交的条件；“中间严格性”条件是具有超过15％错配的分子不会杂交的条件，而“高严格性”条件是具有超过10％错配的序列不会杂交的条件。“极高严格性”条件是具有超过6％错配的序列不会杂交的条件。

在具体的实施方案中，严格条件可以包括于60℃在依照制造商的用法说明书稀释的基因型分型master混合物(appliedbiosystems,fostercity,ca,产品目录编号#4371355)中杂交。

分离的：“分离的”生物组分(诸如核酸或蛋白质)已经与该组分天然存在的生物体细胞中的其它生物组分，即，其它染色体和染色体外dna和rna及蛋白质基本上分开、离开其生成、远离其纯化。已经“分离的”核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白质。该术语还包括通过宿主细胞中的重组表达制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸分子、蛋白质和肽。

寡核苷酸：寡核苷酸是短的核酸聚合物。寡核苷酸可以通过切割较长的核酸区段，或者通过聚合单个核苷酸前体来形成。自动化的合成仪容许合成长度多达几百个碱基对的寡核苷酸。因为寡核苷酸可以结合互补的核苷酸序列，所以它们可以作为探针用于检测dna或rna。由dna(寡脱氧核糖核苷酸)构成的寡核苷酸可以在pcr(即一种用于扩增小dna序列的技术)中使用。在pcr中，寡核苷酸通常称为“引物”，其容许dna聚合酶延伸寡核苷酸并复制互补链。

接合性：如本文中所使用的，术语“接合性”指生物体中遗传性状的基因的等位基因的相似性或其缺乏。若两种等位基因都是相同的，则生物体在性状方面是“纯合的”。若两种等位基因是不同的，则生物体在所述性状方面是“杂合的”。若一种等位基因是缺少的，则它是“半合子的”。若两种等位基因是缺少的，则它是“失效合子的”。

除非另有明确解释，本文中使用的所有技术和科学术语与本公开内容所属领域普通技术人员的通常理解具有相同的意义。分子生物学中的常见术语的定义可以参见例如lewinb.,genesv,oxforduniversitypress,1994(isbn0-19-8542879)；kendrew等(编),theencyclopediaofmolecularbiology,blackwellscienceltd.,1994(isbn0-632-02182-9)；及meyersr.a.(编),molecularbiologyandbiotechnology:acomprehensivedeskreference,vchpublishers,inc.,1995(isbn1-56081-569-8)。

iv.用于bmr玉米的基因型和接合性测定的高通量方法

a.概述

本文中描述了一种基因特异性端点pcr测定法，其一般可用于bmr玉米或推定的bmr玉米的接合性分析。具体的例子利用同一测定法中对bm3缺失和对相应的野生型序列特异性的寡核苷酸的双重性。在这些例子中，可以通过bm3突变体和野生型comt等位基因的存在/缺乏测定接合性。该测定法已经提交给高通量基因组分析组以进一步执行，并且可以极大地增强bmr基因渗入项目的育种过程。

b.褐色中脉玉米

褐色中脉(bmr)玉米植物以在v4至v6阶段时叶中脉中褐色色素沉着和抽穗后木髓的浅褐色着色为特征。褐色中脉杂种玉米含有在玉米植物组织中引起较低木质素含量的基因突变，例如，bm2突变，或bm3突变。褐色中脉3基因位于染色体4的短臂上，且bm3等位基因是隐性的。褐色中脉2基因位于染色体1的长臂上，且bm2等位基因也是隐性的。木质素聚合物限制玉米植物中纤维的消化率。褐色中脉玉米中降低的木质素导致比正常玉米具有更可消化的纤维的青贮饲料。动物喂养试验已经显示了与正常青贮饲料相比，在bmr玉米青贮饲料的情况中大大约10％的摄取和升高的乳产量。

提供了鉴定bm3突变的方法。公开内容的方法可用于例如将特定玉米植物，或特定玉米品种鉴定为bmr玉米。公开的方法还可用于bmr性状对玉米种质的可靠的且可预测的基因渗入，其通过将bmr玉米与其它玉米品种杂交，或者通过将含有第一bmr突变的bmr玉米与含有第二bmr突变的bmr玉米杂交(例如，将bm1玉米品种与bm3玉米品种杂交)来进行。许多bmr突变是本领域技术人员已知的，并且一些bmr突变已经得到表征(例如，定位并测序)。可以使用公开内容的方法鉴定bmr突变，测定bmr玉米植物或品种的基因型和/或接合性，以及将任何bmr突变基因渗入玉米种质中。

c.端点pcr检测测定法

本文中描述了一种基因特异性端点pcr测定法，其一般可用于bmr玉米或推定的bmr玉米的接合性分析。在具体的实施方案中，可以使用基因特异性端点pcr测定法来分析玉米在bm3突变方面的接合性。

在基因特异性端点pcr测定法中使用的引物和探针可以基于感兴趣的基因中已知的突变设计。例如，可以基于在咖啡酸o-甲基转移酶(comt)基因3’端的978bp缺失设计用于bm3特异性测定法的引物和探针。在双重性反应(其中在同一测定法中使用对突变(例如，bm3)和未破坏的野生型基因(例如，comt)特异性的寡核苷酸)中，特异性寡核苷酸会自存在于基因组dna样品中的突变基因和/或野生型基因之任一或两者选择性扩增序列。

在一些实施方案中，bm3特异性测定法扩增长度为71bp的片段，其对于自野生型comt基因删除978bp核苷酸序列的接合位点而言是独特的。在某些实施方案中，靶物特异性寡核苷酸探针(例如，bm3_探针(seqidno:6))在高严格性条件下与基因组dna样品中在两种pcr引物(例如，bm3_f(seqidno:4)和bm3_r(seqidno:5))间的靶序列杂交。

在一些实施方案中，野生型comt基因特异性测定法扩增长度为65bp且位于外显子2(bm3突变体中缺失)内的comt基因片段，使得不能扩增comt基因座处的非bm3序列。在某些实施方案中，靶物特异性寡核苷酸探针(例如，comt_探针(seqidno:9))在高严格性条件下与基因组dna样品中在两种pcr引物(例如,comt_f(seqidno:7)和comt_r(seqidno:8))间的靶序列杂交。

可以例如用荧光染料(例如，fam、vic和mgbnfq)标记靶物特异性寡核苷酸，所述荧光染料可以容许靶物特异性荧光信号的快速量化。可以在预先确定的循环数目后，例如，在反应处于早期指数期时测量pcr产物。阴性对照样品可以包含例如没有bm3突变的来自任何玉米品种的基因组dna。阳性对照样品可以包含具有bmr突变，诸如comt基因中的bm3缺失突变的来自玉米品种的基因组dna。对照半合子样品可以包含预先测定为在bm3突变方面半合子的来自玉米品种的基因组dna；或者半合子样品可以包含等比例的阴性对照dna与预先测定为在bm3方面纯合的来自玉米品种的dna。

可以通过本领域技术人员已知的方法自玉米植物组织分离(例如，提取并纯化)dna。用于dna分离的商业试剂盒可购自例如qiagen,inc。在一些实施方案中，将来自特定植物的叶盘冲孔并转移入收集管中。可以将冲孔器在每次取样后用70％酒精清洗，在水中漂洗，并干燥。可以依照制造商的推荐制备dna提取缓冲液。然后，可以依照制造商的用法说明书使用试剂盒分离dna。最后，可以使用例如quantit^tm量化试剂盒(invitrogen,carlsbad,ca)和分光光度计，或者通过任何其它合适的技术测定分离的dna的浓度。

一旦已经制备或以其它方式获得引物、探针和基因组dna样品，可以进行pcr反应以鉴定基因组dna样品中感兴趣的核酸序列(例如，对于bmr突变特殊的序列)。在具体的实施方案中，制备单独的pcr反应混合物，其含有所有反应组分，除了基因组dna样品外。对于包含bm3突变体和野生型comt玉米的引物和基因特异性探针的双重反应，反应混合物可以包含酶、反应缓冲液、bm3突变的正向和反向引物、野生型comt基因的正向和反向引物、bm3突变的基因特异性探针、comt基因的基因特异性探针和水。在一些pcr测定系统(例如，pcr测定法)中，酶和缓冲液可以存在于单一试剂盒组分(例如，基因型分型master混合物；appliedbiosystems,fostercity,ca,产品目录编号#4371355)中。

一旦以其它方式制备反应混合物，可以添加基因组dna样品，并开始反应。不必要标准化样品中基因组dna的量。然而，熟练技术人员可以通过使用具有相对相等浓度的基因组dna样品获得最好的结果。

在一些实施方案中，可以用合适的对照建立pcr测定法(例如，pcr测定法)。例如，多孔板中的反应可以在对照孔的情况下实施，所述对照孔包含：(1)具有试剂但没有dna样品的阴性对照；(2)包含bm3玉米基因组dna的纯合阳性对照；(3)和半合子阳性对照，如上文所描述的。然后，在合适的循环条件下通过pcr扩增dna。例如，在使用pcr系统9700的一些实施方案中，可以存在着于95℃持续15分钟的单一初始变性循环，接着是30个循环的变性(92℃持续15秒)和变性/延伸(60℃持续60秒)。本领域技术人员理解，pcr循环条件可以随从业人员的判断而有所变化，并且获得相当的结果。

d.基因型和/或接合性的测定

可以使用pcr测定法(例如，端点pcr测定法)进行bmr玉米或推定的bmr玉米的基因型和/或接合性分析。在一些实施方案中，可以用报告物(例如，荧光模块)标记基因特异性寡核苷酸探针。对于使用荧光测定检测的测定法，可以使用适合于检测探针的激发和发射波长设置在分光荧光计(例如，tecangenios^tm；switzerland)中分析pcr反应产物。例如，可以用485nm的激发波长和535nm的发射波长测量荧光染料fam。或者，可以用525nm的激发波长和560nm的发射波长测量荧光染料vic。

在完成pcr反应和探针检测后，可以使用例如任何合适的计算机制图学软件产生表和分布图。用相似基因型背景的野生型、半合子和纯合dna获得的结果可以充当阴性和阳性对照。在一个分离的群体中，可以获得数据点的三个簇，其容许将样品结果视觉测定为可能属于分离簇之一。或者，可以使用数据分析计算机软件来计算如下的可能性，即样品结果属于每个分离簇，其中最可能的簇充当样品名称。在进行视觉测定时，每个簇的边界可以是任意的，例如在数据点的三个簇是明显可见的时。

也可以使用合适的分析包，诸如klims(kbioscience实验室信息管理系统)自读板仪直接分析原始荧光强度数据。可以产生具有在一条轴上绘图的由突变体等位基因的特异性探针产生的荧光信号的相对荧光单位(rfu)和在另一条轴上绘图的由野生型等位基因的特异性探针产生的荧光信号的rfu的图。然后，接合性测定可以基于数据图形显示中的簇分离进行。

不含突变体基因组dna(例如，bmr突变)的样品仅可以产生野生型pcr产物的荧光读数。含有半合子或纯合突变体基因组dna的样品可以产生比阴性背景对照的读数高的突变体特异性探针的rfu读数。若样品不产生足够的结果，则样品中的基因组dna可能不是足够质量和/或数量的，并且应当实施新的dna制备和/或新的pcr反应。优选地，不含dna样品的阴性对照样品显示基因特异性探针的非常低的检出。还优选的是，已知的纯合对照仅仅显示对照中突变体或野生型dna的高检出，而已知的半合子对照显示突变体和野生型dna两者的高检出。

pcr方法和基因型和/或接合性测定的“测试运行”可以在筛选样品前在所有合适的对照的情况中实施。方法的进一步优化对于可以在各次使用间有所不同的组分(例如，基因组dna制备的方法、taqdna聚合酶、寡核苷酸、实验室设备等)可以是想要的。可以建立pcr和热循环条件，其以可接受的探针检测水平(例如，对于经荧光标记的寡核苷酸探针为可接受的rfu)扩增已知基因组dna模板中突变体和/或野生型序列两者。

e.低木质素含量的性状对植物种质的基因渗入

本文中描述了经由牵涉有性生殖的常规植物育种生成具有低木质素含量的玉米植物(例如，bmr玉米)的方法。方法可以包括将在其基因组中包含至少一个拷贝的bmr突变(例如，bm3、bm3-1、bm3-2)的第一亲本玉米植物与第二亲本玉米植物杂交，从而生成f1后代。第一植物可以是任何bmr玉米植物，包括例如bmr玉米品种f2f297、f2f383、f2f488、f2f449、f2f566、f2f610、f2f622、f2f665、f2f633、f2f682、f2f721、f2f700和f2f797。第二亲本玉米植物可以是在与第一玉米植物杂交时能够生成能活的后代玉米植物(即，种子)的任何玉米植物。第一和第二亲本玉米植物可以是相同玉米物种(例如，玉蜀黍(zeamays,maize))的。所述方法可以进一步牵涉将f1后代自交以生成f2后代。方法可以进一步牵涉将f1或f2后代植物与作为第一或第二亲本玉米植物的相同系或基因型的植物回交的一个或多个世代。或者，可以将第一次杂交或任何随后的杂交的f1后代与第三玉米植物杂交，所述第三玉米植物与第一或第二植物是不同系或基因型的。

在一些实施方案中，将后代植物进行公开内容的基因型和/或接合性测定。一旦已经将后代植物基因型分型，和/或已经测定其接合性，则熟练技术人员可以选择那些具有期望的遗传组成的后代植物。此类选定的后代植物可以进一步的杂交、自交或培养中使用。依照公开内容的方法指导的bmr突变的基因渗入的方法降低或消除没有期望的遗传组成的植物的培养和/或生殖，并且由此提供期望的可靠性和可预测性(经由预期的孟德尔遗传方式)。

提供了以下实施例以例示某些具体的特征和/或实施方案。以下实施例不应解释为将公开内容限制成所描述的具体特征或实施方案。

实施例

实施例1：材料和方法

植物和遗传材料。提供了含有纯合bm3等位基因和纯合野生型comt等位基因的玉米叶样品。

总基因组dna的分离和量化。每份样品冲孔8个叶盘，并使用2000将其研磨成细粉末。用qiagendneasy^tm96孔试剂盒(valencia,ca)提取dna。在pcr前，使用制造商的用法说明书用quantit^tm量化试剂盒(invitrogen,carlsbad,ca)量化dna样品。

部分comt基因的克隆和测序。在含有2.5个单位的takaralataq^tm(takarabioinc.,shiga,japan)、400nmdntp、200nm正向(bm35_f)和反向引物(bm34_r)和30ng基因组dna的反应中使用abipcr系统9700(appliedbiosystems,fostercity,ca)用寡聚物bm35_f(5’-tactctactggctgcggctagc-3’；seqidno:1)和bm34_r(5’-taaccttgattgttattactcgcacatgg-3’；seqidno:2)自12种bm3系和3种非bm3样品(见表1)扩增部分comt基因的玉米基因组dna片段。pcr程序以于94℃变性2分钟开始，接着是94℃持续45秒，55℃持续45秒和72℃持续2分钟的30个循环。将pcr产物在2％e(invitrogen,carlsbad,ca)上显现，然后在0.8％eclonewells^tm上提取。然后，依照制造商的用法说明书将纯化的pcr产物克隆入pcr4载体(invitrogen,carlsbad,ca)中。将选定的菌落在含有2.5％lb(对于1llb培养基为10g胰蛋白胨、10gnacl和5g酵母提取物)、36mmk2hpo4、13mmkh2po4、1.7mm柠檬酸钠、6.8mm(nh4)2so4、4.4％甘油、0.4mmmgso4·7h2o、12.5μg/ml氯霉素(使用前立即添加)和50μg/ml卡那霉素的1x冰箱培养基(freezermedia)中培养过夜。然后，将选定的菌落送到(houston,tx)，以用t7和t3启动子及bm1234r(5’-atcagcatcagccaggcagg-3’；seqidno:3)(其位于comt基因内)测序。使用4.8软件分析序列。通过比较来自bm3系与野生型comt样品的共有序列鉴定bm3突变。

表1：用于comt基因的克隆和测序的12种bm3和3种非bm3近交系的表。

pcr测定法设计和确认。基于来自bm3系的dna共有序列，设计用于鉴定突变体等位基因的对删除3’端的来自comt基因的部分序列的接合特异性的引物(bm3_f；seqidno:4和bm3_r；seqidno:5)和探针(bm3_探针；seqidno:6)；用于鉴定野生型等位基因的在缺失区内的引物(comt_f和comt_r)和探针(comt_探针)。使用primerexpress3.0进行测定法设计。所有引物及用fam或vic和小沟接合非荧光淬灭剂^tmi(mgbnfq)染料的双重标记探针由appliedbiosystems(fostercity,ca)合成。将所有引物和探针在1xtrisedta中以100μm溶解。对所有pcr反应使用基因型分型master混合物(appliedbiosystems,fostercity,ca,产品目录编号#4371355)。

在光学系统(biorad,hercules,ca)上使用96孔板依照表2设立20μl体积中的实时pcr反应，以于95℃变性15分钟开始，接着是92℃持续15秒和60℃持续1分钟的50个循环。在每次循环结束时记录荧光信号。

表2：在20μl终体积的情况中每次双重性反应的pcr混合物。

使用384孔板依照表3设立10μl体积中的端点pcr测定法。使用abipcr系统9700(appliedbiosystems,fostercity,ca)进行扩增，以于95℃变性15分钟开始，接着是92℃持续15秒和60℃持续1分钟的30个循环。在最佳循环数目后在反应处于早期指示期时用推荐的仪器设置(fam(bm3突变体)：激发485nm、发射535nm；vic(野生型comt)：激发525nm，发射560nm)通过分光荧光计(tecangenios^tm,switzerland)测量pcr产物。

表3：在10μl终体积的情况中每次双重性反应的pcr混合物。

数据分析。对于实时pcr，通过软件自动计算荧光阈值，其数值略高于背景。通过产生高于建立的阈值的荧光需要的循环数目确定阈值循环(ct值)。然后，使用等位辨别测定法来测定基因型。

在完成端点pcr和荧光阅读后，计算报告染料1的高于背景的信号(sob1)和报告染料2的高于背景的信号(sob2)。产生样品数目与对数尺度的sob1/sob2的绝对比率间的分布图。使用相似基因型背景的野生型、半合子和纯合植物的样品作为对照。基于簇分离进行基因型测定。

还使用klims(kbioscience实验室信息管理系统)分析直接来自读板仪的原始荧光强度数据。产生具有在x轴上绘图的fam和在y周上绘图的vic的rfu(相对荧光单位)的图。基于簇视图中的簇分离进行接合性测定。

实施例2：对comt基因的部分bm3突变的序列分析

为了设计bm3突变体的基因特异性测定法，需要精确的序列信息。因此，设计两种寡核苷酸以自来自12种bm3和3种非bm3系的基因组dna扩增部分comt基因(图1)。图2。将这些片段克隆入pcr4载体中，并送到cogenics,inc.，以用t7和t3启动子及bm1234r(seqidno:3)测序。bm1234r位于comt基因中间，并且用于实现全长序列信息。使用4.8分析并比对来自9种bm3系的高质量序列。将来自bm3系的共有序列与野生型样品比较。鉴定在comt基因3’端的多处缺失/插入突变。例如，将三处突变确认并加下划线。图3。

基因特异性测定法设计和确认。我们已经测试的所有bm3系都含有comt基因3’外显子处的大缺失突变。然后，使用此突变进行基因特异性测定法设计。图4包括显示寡核苷酸位置的图示。野生型comt基因特异性引物和探针位于978bp缺失位点内。bm3特异性引物和探针位于在缺失位点侧翼的正向和反向寡核苷酸和探针跨越缺失区的接合中。

使用12种已知的bm3系和3种非bm3系来测试基因特异性测定法。通过组合相等量的来自bm3系与非bm3系的dna生成6份半合子样品。使用实时pcr来测试测定法的效率。在同一测定法中组合对bm3突变体和对相应的野生型序列特异性的寡核苷酸。使用fam来监测bm3的扩增子，而使用vic来监测野生型comt的扩增子。对bm3和野生型comt基因两者自循环22至36观察到指数扩增期。图5a和5b。使用基于第30个循环时fam作为等位基因1和vic作为等位基因2的等位辨别测定法产生正确的基因型测定。图6。

端点接合性分析的确认。使用含有以纯合、半合子、和无效(野生型)分离的bm3群体的dna样品的一块96孔板来测试并确认端点pcr测定法。端点pcr的一项优点是容易使用。端点pcr不需要更昂贵的实时pcr仪。任何平常的pcr仪适合于96或384孔板，并且能够阅读相关荧光信号的读板仪足以实施测定法。

基于来自实时pcr的结果，30个循环的pcr反应可以有效分开bm3基因与野生型comt基因。在第30个循环时终止pcr反应。在完成pcr和荧光阅读后，计算高于背景(h2o)的fam(bm3)荧光信号(作为高于背景的信号1(sob1)；和高于背景的vic(野生型comt)荧光信号2(sob2)。以对数尺度使用sob1/sob2产生分布图。图7。相似基因型背景的野生型、半合子和纯合对照充当阴性和阳性对照。在分离的群体中，获得数据点的三个簇，容许视觉确定截留点。对于图7中的例子，数据点的三个簇是明显可见的。野生型的数据点小于1，半合子样品的数据点的范围为1至5，而纯合样品的数据点高于5。

还在klims(kbioscience实验室信息管理系统)中分析直接来自读板仪的原始荧光强度数据。产生具有在x轴上绘图的fam和在y周上绘图的vic的rfu(相对荧光单位)的图。基于簇视图中的簇分离进行接合性测定。图8。因为使用fam来监测bm3的扩增，且使用vic来监测野生型comt的扩增，所以具有强fam信号，且很少或没有vic信号的样品是纯合的bm3；具有强vic信号，且很少或没有fam的样品是野生型comt(无效)；而具有fam和vic两者的强信号的样品是半合子的。

来自此bm3基因特异性端点pcr测定法的基因型和接合性测定与田间收集的表型数据100％匹配。此测定法提供了以高通量方式表征bm3接合性状态的容易且准确的方式。

实施例3：bm3突变的基因渗入

测定玉米植物就bm3突变而言的接合性，如上文所描述的。测定的是，玉米植物在bm3突变方面是纯合的。经由常规的植物育种将植物与已知在野生型comt基因方面纯合的玉米植物和在bm3突变方面纯合的玉米植物杂交。生成杂交的f1后代。然后，将杂交的f1后代自交以生成f2后代。制备f2后代的基因组dna的样品，并测定f2后代植物的接合性，如上文所描述的。

选择在bm3突变方面纯合的f2后代植物。然后，对选定的后代测定低木质素含量，并且通过杂交和自交进一步繁殖展现出低得想要的木质素水平的那些后代，并将所得的后代栽培。

虽然本发明在本文中已经就某些优选的实施方案进行过描述，但是本领域普通技术人员应当认可并领会，它不是如此限制的。取而代之，可以在不背离如要求保护的本发明的范围的前提下做出对优选实施方案的许多添加、删除和修饰。另外，可以组合来自一个实施方案的特征与另一实施方案的特征，而仍涵盖在如发明人设想的本发明的范围内。