一种烟草黑胫病菌发酵液致病活性组分的应用方法与流程

本发明属于病理学领域，特别涉及一种利用烟草黑胫病菌发酵液致病活性组分快速筛选抗黑胫病烟草新品系的方法。

背景技术：

烟草黑胫病最早在印度尼西亚的瓜哇被发现。1950年首次报道该病发生于我国黄淮烟区，并长时间为害且病情越来越严重。目前烟草黑胫病除东北烟区零星发病外，全国其他烟区均普遍发生，每年造成的经济损失严重，仅次于病毒病。

当前，防治烟草黑胫病的常用化学药剂主要有瑞毒霉(甲霜灵)可湿性粉剂、波尔多液、甲基托布津、敌克松可湿性粉剂、杀毒矾m-8可湿性粉等，期间多种药剂可联合施用，分时分期喷洒，具有理想的防病增产作用。此外，寻找新的防治方法以克服烟叶农药残留和病菌抗药性的问题，生物防治的多样性决定了防治方法的多样性，也保证了烟草黑胫病的生物防治途径的多样性。国外有研究表明：在烟草黑胫病的防治工作中，木霉菌拮抗效果突出，主要缘于木霉菌在土壤中占据了侵染点位后，与黑胫病菌产生竞争，进而降低烟草黑胫病菌的侵染几率。

随着烟草行业不断向绿色无公害方向发展，对烟草黑胫病的防治仅仅停留在合理轮作为主、起垄栽培和化学防治为辅的综合防治措施已不能满足发展的需求。生物防治中寻找拮抗烟草黑胫病的菌株虽然也能在一定程度上有效防治烟草黑胫病菌，但只有烟草品种的抗病性本身才是防治病害的基础，因而对抗性品种的研究是当今烟草领域的一个热门话题。

技术实现要素：

本发明的目的是首先利用黑胫病菌的发酵液，然后将得到的95％乙醇洗脱液作为黑胫病致病因子的选择压对烟草品系的花药进行抗黑胫病筛选；最后对抗病花药加倍后进行抗病性鉴定。本发明操作简单快速、结果可靠。

一种烟草黑胫病菌发酵液致病活性组分的应用方法，步骤包括：

(1)黑胫病菌菌丝在液体培养基中摇床振荡培养；收集无菌发酵液，离心，将上清液过滤除菌，待用；

(2)将步骤(1)得到的除菌后的黑胫病菌无菌发酵液通过微滤中空纤维素膜和超滤中空纤维素膜进行膜过滤分离，得到澄清透明的超滤液；将超滤液上柱进行大孔吸附树脂富集，最后用80-95％的乙醇将树脂上吸附的成分冲下，得到80-95％乙醇洗脱液，即黑胫病菌发酵液致病活性组分；

(3)以步骤(2)得到的80-95％乙醇洗脱液做为致病因子选择压对烟草品系的花药进行抗黑胫病筛选。

以步骤(3)中筛选出的抗病花药加倍后的烟株为材料，通过叶片离体注射法，对筛选出的烟株进行抗黑胫病鉴定。

作为进一步的改进，步骤(1)所述的液体培养基为pda液体培养基。

作为进一步的改进，步骤(1)中的摇床培养条件：26-30℃、180-250rpm，优选28℃,220rpm。

作为进一步的改进，步骤(1)中从培养后的第5d-7d收集无菌发酵液，优选第7d。

作为进一步的改进，步骤(1)中4℃、6000-10000rpm离心10-20min，优选8000rpm离心15min；将上清液经0.22um细菌过滤器过滤除菌，保存于4℃冰箱中待用。

作为进一步的改进，步骤(2)中采用的是5kda微滤中空纤维素膜和3kda超滤中空纤维素膜进行膜过滤分离。

作为进一步的改进，步骤(2)中采用的是d101型大孔吸附树脂。

作为进一步的改进，步骤(2)和步骤(3)中采用的乙醇浓度是95％。

作为进一步的改进，以80-95％乙醇洗脱液作为致病因子，且以2-3％的质量浓度作为选择压。

本发明操作简单、结果可靠、黑胫病菌发酵液致病活性组分的致病能力强，稳定性好，能够高效的用于烟草黑胫病菌抗性品种的筛选。

附图说明

图1为v8培养基中黑胫病菌发酵液的烟叶hr反应；

从左至右分别代表黑胫病菌振荡培养0d、5d、6d、7d后的无菌发酵液hr反应；

图2为胡萝卜培养基中黑胫病菌发酵液的烟叶hr反应；

从左至右分别代表黑胫病菌振荡培养0d、5d、6d、7d后的无菌发酵液hr反应；

图3为燕麦培养基中黑胫病菌发酵液的烟叶hr反应；

从左至右分别代表黑胫病菌振荡培养0d、5d、6d、7d后的无菌发酵液hr反应；

图4为烟叶汁培养基中黑胫病菌发酵液的烟叶hr反应；

从左至右分别代表黑胫病菌振荡培养0d、5d、6d、7d后的无菌发酵液hr反应；

图5为马铃薯培养基中黑胫病菌发酵液的烟叶hr反应；

从左至右分别代表黑胫病菌振荡培养0d、5d、6d、7d后的无菌发酵液hr反应；

图6为黑胫病菌发酵液不同处理的烟叶hr反应；

图7为烟草高钾品系hkdn-2的花药抗黑胫病菌原液和发酵液活性成分最适选择压的筛选比较；

图8为烟草高钾品系hkdn-5的花药抗黑胫病菌原液和发酵液活性成分最适选择压的筛选比较；

图9为黑胫病菌发酵液活性组分花培幼苗的黑胫病抗性鉴定；

(注：h.r表示高抗；m.r表示中抗；a表示盆栽鉴定；b表示大田；c表示大田单株)

图10为黑胫病菌原液花培幼苗的黑胫病抗性鉴定；

(注：h.s表示高感；a表示移盆栽鉴定；b表示大田；c表示大田单株)。

具体实施方式

以下实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

黑胫病菌发酵液的制备及其活性组分的分离：首先接种环挑取适量菌丝块于马铃薯液体培养基中，置于28℃、220rpm的摇床中培养，从第7d收集无菌发酵液于10ml的无菌离心管中，4℃、8000rpm离心15min，将上清液经0.22um细菌过滤器过滤得到黑胫病菌发酵液；然后将其过5kda微滤中空纤维素膜和3kda超滤中空纤维素膜处理，得到澄清透明的超滤液；最后将滤液经6kgd101型大孔吸附树脂，后用95％乙醇将树脂上吸附的成分冲下，得到95％乙醇洗脱液。

实施例1：黑胫病菌无菌发酵液致病效果

(1)v8培养基培养的黑胫病菌无菌发酵液致病效果

由图1可知：与对照(ck)(ck为培养0天)相比，黑胫病菌振荡培养5天后获得的发酵液已使叶片注射区出现轻微凹陷状，伴有白色圈点，经一段时间振荡培养，至第7天后，所取发酵液使叶片注射区出现凹陷状和圈点。但总体来说，烟叶均未出现明显hr坏死斑现象。

(2)胡萝卜培养基培养的黑胫病菌无菌发酵液致病效果

由图2可知：黑胫病菌培养5天后所取得的黑胫病菌无菌发酵液对叶片的注射结果与对照(ck)一样，无hr反应，培养6天后，所取得的发酵液使叶片的注射孔周围开始出现轻微白色斑点，培养7天与培养6天相比，白色斑点增多，面积扩大，并伴随着注射区烟叶大范围凹陷。综合整个培养周期来看，未产生明显hr坏死斑现象。

(3)燕麦培养基培养的黑胫病菌无菌发酵液致病效果

从图3可知：培养0天(ck)的黑胫病菌无菌发酵液对烟叶无hr反应。黑胫病菌培养了5天的发酵液对烟叶即有轻微影响，伴有白色斑点出现，培养了6天的黑胫病菌无菌发酵液与5天的相比，烟叶注射区产生的白色斑点较大，培养7天后，所取得的黑胫病菌无菌发酵液即使烟叶注射区产生黄色斑点，有产生hr反应的趋势但并不明显。

(4)烟叶汁培养基培养的黑胫病菌无菌发酵液致病效果

由图4可知，培养0天(ck)的黑胫病菌无菌发酵液对烟叶未产生明显的注射效果，黑胫病菌培养5天后，所取得的黑胫病菌无菌发酵液即使烟叶注射区出现白色凹陷，伴有白色斑块，部分斑块存在变黄的现象，培养6天和7天所取的黑胫病菌无菌发酵液对叶片的注射效果与培养5天的相比，均无变化，未出现明显hr坏死斑。

(5)马铃薯培养基培养的黑胫病菌无菌发酵液致病效果

从图5可知：培养0天的黑胫病菌无菌发酵液(ck)对烟叶无明显损伤现象；黑胫病菌培养5天后所取的无菌发酵液对烟叶的注射效果有轻微坏死斑现象并伴随着小范围黄色斑点出现；黑胫病菌培养7天后所取的无菌发酵液与培养6天的相比，烟叶注射处的斑点逐渐变大变黄，出现明显抗敏感性坏死斑，即产生hr反应。

(6)5种培养基培养的黑胫病菌无菌发酵液致病效果比较

综上所述(表1)：马铃薯培养基(pda)培养获得的黑胫病菌无菌发酵液对烟叶的注射效果最明显，烟叶汁培养基培养获得的次之，v8培养基培养的效果最差；分别在黑胫病菌培养5、6和7天取无菌发酵液并对烟叶进行离体注射，培养7天取得的黑胫病菌无菌发酵液的注射效果最好；分别将5种培养0天的黑胫病菌无菌发酵液(培养基原液)对叶片进行离体注射，均无坏死斑现象，排除培养基自身的致病性。

表15种培养基的黑胫病菌无菌发酵液致病效果

注：-代表烟叶无hr反应；+代表烟叶有轻微hr反应；++代表烟叶有hr反应；++++代表烟叶有明显hr反应。

实施例2：黑胫病菌发酵液活性成分致病性的测定

由表2和图6可知：黑胫病菌无菌发酵液经5kda微滤中空纤维素膜和3kda超滤中空纤维素膜处理后的超滤液经叶片注射后，可使烟叶产生明显的hr坏死斑，病斑面积平均值达0.87cm²，其与原液注射叶片后的病斑面积相比，均值增加0.32cm²，二者的差异达到了5％的显著性水平；超滤液经开放层析柱处理后，得到的70％、80％和95％乙醇洗脱液可使烟叶产生hr反应，比较原液和超滤液的hr反应，乙醇洗脱液引起的坏死斑更明显，颜色更深，微现黄，病斑面积平均值达0.88-0.93cm²；其中80％(c4)和95％(c5)乙醇洗脱液坏死斑面积平均值与超滤液之间的差异也达到了5％的显著性水平；虽然70％(c3)乙醇洗脱液坏死斑面积平均值与超滤液之间的差异不显著性，但其变异系数(9.075)小于超滤液的(11.49)。

表2黑胫病菌发酵液不同处理的烟叶hr坏死斑面积差异

实施例3花药抗黑胫病突变体的获得

(1)花药抗黑胫病菌原液和本发明的发酵液活性成分最适选择压的筛选比较

①烟草高钾品系hkdn-2

第一，从图7和表3可知：随着本发明的黑胫病菌发酵液活性成分浓度的增大，hkdn-2的花药的萌发率逐渐减少；与对照组(ck，0％)相比，含1％的本发明的黑胫病菌发酵液活性成分浓度的培养基中花药的萌发率为12.0％，二者不存在差异显著性；本发明的黑胫病菌发酵液活性成分浓度为2％时花药萌发率显著低于对照组，但未达到极显著性水平；当本发明的黑胫病菌发酵液活性成分浓度达3％时，花药萌发率与低浓度(1％、2％)呈现显著差异，而与高浓度(4％、5％)处理的差异达极显著水平，因此选择3％的浓度作为筛选hkdn-2抗黑胫病突变体的最适选择压。

第二，1％和2％及4％和5％原液浓度处理的与3％处理的之间达到了5％水平的差异，因此确定3％作为黑胫病菌原液的最适选择压。

第三，不同浓度原液处理的平均萌发出苗数为41.4株，萌发率为55.2％；而不同浓度本发明的黑胫病菌发酵液活性成分处理的平均萌发出苗数为5.2株，萌发率为6.93％。

表3不同选择压浓度下hkdn-2花药抗黑胫病突变体的萌发率

②烟草高钾品系hkdn-5

第一，从图8和表4可知：当花药培养基中本发明的黑胫病菌发酵液活性成分浓度为1％时，其萌发率与对照组(0％)相比有极显著差异；当本发明的黑胫病菌发酵液活性成分浓度为2％时，其萌发率为12.0％，与低浓度处理(1％)的萌发率相比未产生显著性差异,而与高浓度处理(3％、4％、5％)的萌发率相比达极显著水平,说明2％为烤烟hkdn-5进行花药培养所能耐受的极限致病因子浓度，所以初步认为筛选hkdn-5的抗黑胫病病突变体的最适选择压为2％。

第二，1％、2％和3％及5％原液浓度处理的与4％处理的之间达到了5％水平的差异，因此确定4％作为黑胫病菌原液的最适选择压。

第三，不同浓度原液处理的平均萌发出苗数为40.0株，萌发率为53.3％；而不同浓度本发明的黑胫病菌发酵液活性成分处理的平均萌发出苗数为8.6株，萌发率为11.46％。

表4不同选择压浓度下hkdn-5花药抗黑胫病突变体的萌发率

(2)盆栽和大田的验证结果

分别将经过上述已确定的最适选择压，2-3％本发明的黑胫病菌发酵液活性成分和4％黑胫病菌原液培养下的成活花药进行分化、生根、加倍、炼苗后，通过茎接种进行抗黑胫病性鉴定，结果表明：前者处理的，烟草植株表现了不同程度的抗性，发病率仅仅为3.6％(图9)；而后者处理的，烟草植株的发病率较高，发病率高达45.3％(图10)。