一种特异性标记家蚕微孢子虫的核酸探针及其原位荧光杂交检测方法与流程

本发明属于生物分子检测领域，涉及一种特异性标记家蚕微孢子虫的核酸探针及其原位荧光杂交检测方法。
背景技术：
：家蚕微孢子虫(nosemabombycis，n.b)是家蚕微粒子病的病原，不仅能够水平传播，而且能够经卵垂直传播感染后代家蚕，对生产危害巨大，是蚕种生产中的法定检疫对象。由于n.b营专性细胞内寄生，无法离体培养，且其孢子结构特殊，多数常规研究方法不能使用或尚未建立，因此其研究受到诸多技术限制，以致目前对其生活周期、侵染过程、致病机理等重要特征都尚不明确。目前生产上的蚕种检测主要是显微镜检母蛾和成品卵中具有折光性的n.b的孢子，而对非孢子时期的n.b则无法进行镜检检查。家蚕微孢子虫的生活周期大概分为三个阶段，即感染期、裂殖增殖期、孢子增殖期。目前常用的家蚕微孢子虫观察方法主要有三种：一是利用dapi、dy96等染料对家蚕微孢子虫的细胞核进行染色观察，但此法只能显示细胞核和几丁质成分，而不能显示家蚕微孢子虫的完整轮廓特征，并且其宿主的细胞核也会被同时标记，对观察病原有一定的干扰；二是通过制备家蚕微孢子虫的特异性抗体进行标记观察，但此法耗时长、成本高、稳定性差；三是利用扫描电镜和透射电镜技术对不同时期的家蚕微孢子虫进行直接观察，但该方法操作繁琐、制样难度大、难以长期频繁使用。因此，研究和生产上需要建立一种更直观、简便、特异的方法来检测家蚕微孢子虫。荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,fish)是研究中常用的标记观察技术。利用荧光标记的特异性rna或dna探针对细胞内的核酸进行标记，能够快速简便的对不同物种不同时期的细胞进行特异性的观察。此技术的关键是设计特异高效的标记探针，并有针对性地建立标记流程。然而，由于家蚕微孢子虫前期研究基础薄弱，缺乏充分的分子数据，及其结构特殊、无法离体培养的特征，以致尚未发明出家蚕微孢子虫的fish标记方法。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种能特异性标记家蚕微孢子虫的核酸探针；本发明的目的之二提供在感染家蚕微孢子虫的细胞中特异性地标记出家蚕微孢子虫荧光核酸探针；本发明的目的之三是提供在感染家蚕微孢子虫的细胞中特异性地标记出家蚕微孢子虫的荧光原位杂交方法。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：1.一种特异性标记家蚕微孢子虫的核酸探针，核酸探针序列如seqidno：1或seqidno：2所示。2.含有序列seqidno：1或seqidno：2的荧光探针，荧光探针由seqidno：1或seqidno：2和荧光染料组成，所述荧光染料结合在核酸探针的5’端或3’端。进一步，所述荧光染料为cy3、cy5、fitc、fam、alexafluor488或biotin。进一步，所述荧光染料为cy3。3.利用荧光探针特异性标记家蚕微孢子虫的荧光原位杂交方法，荧光原位杂交方法为以下步骤：(1)用多聚甲醛对感染家蚕微孢子虫的细胞进行固定，所述荧光探针用杂交液进行稀释至终浓度为3～5ng/μl，于46℃进行杂交，杂交10～12小时，再用杂交清洗液清洗非特异性结合的探针，于48℃清洗1～4小时；(2)用100ng/μldapi对细胞的细胞核以及家蚕微孢子虫的细胞核进行标记，室温染色30min，pbs清洗，封片，再用荧光显微镜，选取相应的激发波长观测荧光探针标记结果。进一步，所述细胞为家蚕胚胎细胞、家蚕卵巢细胞或草地贪夜蛾细胞。进一步，所述细胞为家蚕胚胎细胞。进一步，所述多聚甲醛的质量浓度为4％；杂交液为含有900mmnacl,20mmtris,0.01％sds,ph值为7.5的水溶液；所述杂交清洗液为含有900mmnacl,20mmtris，0.01％sds,5mmedtaph值为7.5的水溶液。进一步，所述pbs清洗是用pbs清洗1～5次，每次5～10分钟。本发明的有益效果在于：1、特异性高：本发明提出的家蚕微孢子虫的特异性rdna探针与家蚕微孢子虫结合灵敏度高，进一步结合荧光素做成的荧光探针比较使用抗体的荧光标记方法具有更高的特异性。2、操作简便：比较使用抗体的荧光标记，本发明提出在感染家蚕微孢子虫的细胞中特异性地标记出家蚕微孢子虫的荧光原位杂交方法操作更加简单方便，结果更直观可靠。3、灵敏有效：生产上蚕种检疫使用的母蛾镜检方法只能观察到成熟孢子，无法发现处于裂殖体等阶段的病原体，本发明提出利用含有seqidno：1或seqidno：2的荧光探针标记出家蚕微孢子虫的荧光原位杂交方法能够标记除成熟孢子以外的各发育阶段的病原，因此具有更高的灵敏性。附图说明为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：图1为n.b感染bme细胞后42h，荧光探针nblsu-1标记未成熟家蚕微孢子虫；图2为n.b感染bme细胞后45h，荧光探针nblsu-1标记未成熟家蚕微孢子虫；图3为n.b感染bme细胞后42h，荧光探针nblsu-v1标记未成熟家蚕微孢子虫；图4为n.b感染bme细胞后60h，荧光探针nblsu-v1标记未成熟家蚕微孢子虫；其中各附图，图a中大箭头代表dapi染的bme细胞的细胞核，小箭头表示未成熟家蚕微孢子虫的细胞核，五角星标注的为成熟家蚕微孢子虫的细胞核，以上细胞核均为浅蓝色显示；图b中箭头所示为探针标记的家蚕n.b核糖体rna，为红色荧光显示；图c是白光下的图，箭头所示为未成熟家蚕微孢子虫；图d是将图abc叠加的图，箭头所示为荧光叠加的区域。具体实施方式下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。实施例1探针设计根据n.b核糖体rna大亚基(lsurrna)的dna序列及其二级结构模型，结合fish探针要求进行fish探针的设计筛选。本技术方案所设计的核酸探针能特异性地结合细胞核外的核糖体rna，一般的探针只能结合细胞核内的dna而无法达到区分不同时期家蚕微孢子虫的目的。fish探针要求为：长度为18nt左右，tm值为48-60℃，如果tm值大于60℃或者小于48℃，可以适当调整探针的长度。根据上述原则，设计了两条核酸探针，其序列如下所示：表一特异性标记家蚕微孢子虫的核酸探针序列号名称序列seqidno：1nblsu-v1gcaatcgtactctacattgseqidno：2nblsu-1gaacattaggtttctatcct以上家蚕微孢子虫核酸探针可根据需要偶联不同的荧光标记物，如：cy3、cy5、fitc、fam、alexafluor488或biotin，荧光标记物可结合在3’端或5’端。本实施例是将设计好的探针序列送至公司合成偶联cy3红色荧光标记的探针，结合在序列5’端，其序列如下：表二特异性标记家蚕微孢子虫的荧光探针名称序列nblsu-v1-cy3cy3-gcaatcgtactctacattgnblsu-1-cy3cy3-gaacattaggtttctatcct实施例2nblsu-1-cy3原位杂交实验的方法和结果1)感染n.b的家蚕bme细胞的制备将正常的家蚕胚胎细胞(bme)计数，按1x106次方爬片(直径20mm)，同时，在无菌条件下，取感染家蚕微孢子虫(nosemabombycis，n.b)的蚕蛹血液，对其中的n.b孢子进行计数，计数后以n.b:细胞＝10：1的比例感染bme细胞，感染6小时后换液。2)家蚕bme细胞内杂交n.b的fish探针标记在n.b感染bme细胞后45小时，用4％多聚甲醛对bme细胞进行固定，用杂交液(900mmnacl，20mmtris[ph7.5]，0.01％sds)对nblsu-1-cy3探针进行稀释，至终浓度为5ng/μl，于46℃进行杂交，杂交12h。杂交结束后，利用杂交清洗液(900mmnacl,20mmtris[ph7.5],0.01％sds,5mmedta)清洗非特异性结合的探针，于48℃清洗1h。3)细胞核的dapi标记杂交结束后，为了排除荧光信号的假阳性，利用100ng/μl4',6-二脒基-2-苯基吲哚，简称dapi对bme细胞的细胞核以及家蚕微孢子虫的细胞核进行标记，18～25℃染色30min，pbs清洗3次，每次5分钟，封片。4)fish结果的观察利用激光共聚焦荧光显微镜，选取合适的激发波长观察探针标记结果。图1为n.b感染bme细胞后42h，荧光探针nblsu-1，也记为nblsu-1-cy3探针，标记未成熟家蚕微孢子虫；如图1所示，图a为dapi染色的细胞核，其中大箭头代表dapi染色的bme细胞的细胞核，小箭头表示未成熟家蚕微孢子虫的细胞核，五角星标注的为成熟家蚕微孢子虫的细胞核，以上细胞核均为浅蓝色显示；图b为荧光探针nblsu-1标记的家蚕n.b核糖体rna，为红色荧光显示，图中细胞形态、细胞外的孢子形态清晰可见，几乎所有的孢子都能被dapi给染色标记上，然而只有无特定形态、核不规则的裂殖体时期的病原体可以被核酸荧光探针标记上，表明荧光探针nblsu-1可以特异的标记未成熟病原体；图c是白光下的图，箭头所示为未成熟家蚕微孢子虫；图d是将图abc叠加的图，箭头所示为荧光叠加的区域。图2为n.b感染bme细胞后45h，探针nblsu-1-cy3标记未成熟家蚕微孢子虫；如图2所示，nblsu-1-cy3探针标记的红色荧光较分散，形态逐渐接近成熟的家蚕微孢子虫，比成熟孢子大，由于原生质膜的逐渐增厚，使得能够在肉眼下观察到轻微的轮廓，但仍然不是太清晰，表明探针nblsu-1-cy3可以特异的标记细胞中的正在成熟家蚕微孢子虫。实施例3nblsu-v1-cy3原位杂交实验的方法和结果1)感染n.b的家蚕bme细胞的制备将正常的家蚕胚胎细胞(bme)计数，按1x106次方爬片(直径20mm)，同时，在无菌条件下，取感染家蚕微孢子虫(nosemabombycis，n.b)的蚕蛹血液，对其中的n.b孢子进行计数，计数后以n.b:细胞＝10：1的比例感染bme细胞，感染6小时后换液。2)家蚕bme细胞内杂交n.b的fish探针标记在n.b感染bme细胞后45小时，用4％多聚甲醛对bme细胞进行固定，用杂交液(900mmnacl，20mmtris[ph7.5]，0.01％sds)对nblsu-v1-cy3探针进行稀释，至终浓度为5ng/μl，于46℃进行杂交，杂交12h。杂交结束后，利用杂交清洗液(900mmnacl,20mmtris[ph7.5],0.01％sds,5mmedta)清洗非特异性结合的探针，于48℃清洗2h。3)细胞核的dapi标记杂交结束后，为了排除荧光信号的假阳性，利用100ng/μl4',6-二脒基-2-苯基吲哚，简称dapi对bme细胞的细胞核以及家蚕微孢子虫的细胞核进行标记，室温染色30min，pbs清洗3次，每次5分钟，封片。4)fish结果的观察利用激光共聚焦荧光显微镜，选取合适的激发波长观察探针标记结果。图3为n.b感染bme细胞后42h，荧光探针nblsu-v1，也记为nblsu-v1-cy3探针，标记未成熟家蚕微孢子虫；如图3所示，被fish探针标记上的家蚕微孢子虫大小和成熟的微孢子基本一致，外围的孢壁轮廓清晰可见，整个细胞充满了家蚕微孢子虫。表明荧光探针nblsu-v1可以特异的标记细胞中的正在成熟家蚕微孢子虫。图4为n.b感染bme细胞后60h，荧光探针nblsu-v1标记未成熟家蚕微孢子虫；如图4所示，fish探针标记的病原体逐渐变小，同时宿主细胞内成熟孢子增多，荧光探针nblsu-v1可以特异的标记细胞中的正在成熟家蚕微孢子虫。最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。sequencelisting<110>西南大学<120>一种特异性标记家蚕微孢子虫的核酸探针及其原位荧光杂交检测方法<160>2<170>patentinversion3.3<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<400>1gcaatcgtactctacattg19<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2gaacattaggtttctatcct20当前第1页12