用于快速检测多种真菌并鉴定菌种的引物和探针及其应用的制作方法

本发明属于微生物检测
技术领域：
，具体涉及一种用于快速检测多种临床常见真菌并鉴定菌种的试剂盒的引物，分子信标及试剂盒。
背景技术：
：真菌病是由真菌为病原体所引起的一种疾病，它不仅包括侵犯表皮角质层、毛发和甲板的浅部真菌感染，也包括侵犯真皮、皮下组织和内脏器官的深部真菌病。近几年来，随着广谱抗菌药物、糖皮质激素、免疫抑制剂和各种医学导管的大量使用，器官移植手术的开展及长期的慢性病治疗如肿瘤治疗，使得免疫低下人群和医院内部侵袭性真菌感染的发病率有明显的上升趋势，主要为假丝酵母菌属、隐球酵母菌属和曲霉菌属所致的感染，一些少见真菌及条件致病性真菌如毛霉菌属和青霉菌属引起的感染逐渐增多。早期的抗真菌治疗能极大改善真菌病患者的预后，目前临床抗真菌治疗常被推迟到血液培养的真菌菌群分离后(>12小时)，这是这类感染死亡率较高的原因之一，因此早诊断早治疗是降低深部真菌感染死亡率的有效方式。实验室检查是临床诊断真菌感染的重要依据，常规的实验室诊断方法包括直接镜检法和培养法，血清学方法和分子生物学方法。直接镜检法和培养检查法是形态学检查的基本方法。直接镜检是真菌学检查最经典的方法，具有快速、简便的特点，但阳性率较低，并且取材直接涂片法的漏诊率高达45％，因此阴性结果不能排除真菌感染，与培养检查结合才能确诊。培养检查法可进一步提高病原体检出的阳性率，验证直接镜检的结果同时确定致病菌的种类，但是大部分真菌生产缓慢，因此培养法耗时长，确诊慢，容易延误病情。血清学诊断方法在国内外开展了数十年，该方法可快速得出结果，近年来检测真菌抗原、抗体及代谢产物的血清学方法已广泛用于临床。目前主要检测烯醇化酶、葡聚糖、甘露聚糖、半乳甘露聚糖和隐球菌荚膜多糖抗原等。但是存在的问题是引起假阳性的因素较多，如内毒素污染，溶血和一些抗肿瘤药物的使用都可使检测呈假阳性。近年来，分子生物学方法已成功应用于某些深部真菌感染的检测，如pcr技术，由于该方法可在极短的时间内检测出极微量的真菌，故使真菌感染的早期诊断成为可能，为一些难以靠形态学检查来确诊的深部真菌感染开辟了新的诊断途径。然而用传统pcr技术诊断真菌感染存在局限性，扩增的dna产物极易造成实验室污染，极微量的污染可造成假阳性以及难以区分定植菌和感染菌使其特异性不高。实时荧光核酸恒温扩增检测技术(simultaneousamplificationandtesting，简称sat)是将核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术。该技术具有高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定等优点。其原理为在41℃恒温条件下，首先由m-mlv逆转录酶产生模板核酸(rna)的一个双链dna拷贝，然后利用t7rna聚合酶从该dna拷贝上产生多个(100～1000个)反义rna拷贝；每一个产生的rna拷贝又被逆转录酶作为模板核酸进入下一个扩增循环；同时，带有荧光标记的分子信标探针和这些扩增出来的rna拷贝特异性结合，产生荧光。荧光检测仪器对扩增反应产生的荧光信号进行实时捕获，实时反映扩增循环情况。分子信标(molecularbeacon)是一种在自身5’和3’末端形成一个6～8个碱基序列互补配对的发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针，分子信标的一端标记荧光基团，另一端标记荧光淬灭基团，当分子信标呈现茎环状的二级结构时，5’和3’末端紧紧靠近，发生光诱导电子转移导致荧光基团荧光被淬灭；当分子信标的环状序列与靶标核苷酸链互补结合时，分子信标将成链状而非发夹状，5’和3’末端分离，使得荧光基团与淬灭剂分开，当荧光基团被激发时，因淬灭作用被解除，发出激发光子。荧光强度与溶液中靶标核苷酸链的量呈正比，因此可以用于靶标核苷酸链的实时定量分析。高分辨率熔解曲线(high-resolutionmelting，hrm)是一种基于寡核苷酸链熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因分析技术，具有极高的灵敏度，可以检测出单个碱基的差异，并且通量高、速度快、成本低、结果准确、不受检测位点的局限。hrm技术可以应用于基因突变检测、单核苷酸多态性分析、基因分型、序列匹配、甲基化后修饰等方面的研究。hrm技术的基本原理为双链寡核苷酸链的热稳定性受其碱基组成和核苷酸链长度的影响，碱基序列的不同会导致在升温变性过程中双链核苷酸的解链行为的不同。运用分子信标探针与恒温扩增所得的反义rna拷贝互补结合，可以实时定量rna拷贝数，扩增完成后通过hrm技术可以获得不同rna拷贝序列的不同形态的熔解曲线，用以对原始模板核酸进行基因分型分析。技术实现要素：本发明需要解决的技术问题是，提供一种灵敏、准确、操作简便的新型检测试剂盒，实现对临床常见真菌的快速检测与鉴定，以弥补现有检测方法的不足。为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：用于快速检测多种真菌并鉴定菌种的引物和探针，它包括如下序列：(1)扩增18sv2区的引物对，其核苷酸序列如seqidno.：1～2所示；(2)扩增18sv9区的引物对，其核苷酸序列如seqidno.：3～4所示；(3)检测18sv2区扩增子的分子信标，其核苷酸序列如seqidno.：5所示；(4)检测18sv9区扩增子的分子信标，其核苷酸序列如seqidno.：6所示；(5)检测18sv9区扩增子的分子信标，其核苷酸序列如seqidno.：7所示；上述2对引物对和3条分子信标在一次检测中共同使用。上述用于快速检测多种真菌并鉴定菌种的引物和探针在制备真菌检测试剂盒中的应用。用于快速检测真菌检测与鉴定的试剂盒，该试剂盒包括如下试剂：(1)扩增反应试剂：ph＝8.001mtris-hcl缓冲液、2mkcl、1.2mmgcl2、dntps、ntps、seqidno.：1～7所示的引物和分子信标；(2)5×q-solution：该反应液中含有2.7m甜菜碱、55ug/mlbsa、31.5mmdtt和6.7％dmso；(3)酶反应液：该反应液中含有5.5ug/mlbsa、逆转录酶和t7rna聚合酶；(4)阳性对照：分别含有8种念珠菌(白色念珠菌，热带念珠菌，近平滑念珠菌，光滑念珠菌，克柔念珠菌，季也蒙念珠菌，葡萄牙念珠菌，乳酒念珠菌)，1种隐球菌(新型隐球菌)，1种曲霉菌(烟曲霉)，1种毛霉菌(总状毛霉)和1种青霉菌(绳状青霉)rna的水溶液；(5)阴性对照：去rna酶的水。上述用于快速检测多种临床常见真菌并鉴定菌种的试剂盒，其特征在于，阳性对照中，每一种真菌rna浓度为30ng/μl。上述用于快速检测真菌检测与鉴定的试剂盒在检测临床真菌中的应用。因为真菌的生长繁殖速度相对其他真核生物很快，其基因组也经常会发生变异而具有异质性，包含本发明所述的白色念珠菌，热带念珠菌，近平滑念珠菌，光滑念珠菌，克柔念珠菌，季也蒙念珠菌，葡萄牙念珠菌，乳酒念珠菌，新型隐球菌，烟曲霉，黄曲霉，总状毛霉，卷枝毛霉临床致病菌和橘青霉，绳状青霉条件致病菌的不同临床隔离菌株所含的基因dna序列会有所差异，本发明通过从ncbi的基因序列库中比对多种菌及临床隔离株的基因序列，在保守位点设计的特异性引物和探针能扩增和检测并鉴定临床常见致病真菌的18sv2及v9区。有益效果：(1)通过在ncbi的基因序列库中比对多种菌及临床隔离株18s基因序列，在保守位点处设计的特异性引物，能够对临床常见致病真菌18sv2区和v9区进行特异性扩增。(2)使用一种稳定性强、双链结合特异性高、对核酸恒温扩增抑制小的特异性检测并鉴定真菌的分子信标探针对临床常见的八种念珠菌，一种隐球菌，曲霉菌属，毛霉菌属和青霉菌属进行检测和鉴定。(3)本发明所述的临床常见真菌快速检测与鉴定的试剂盒具有灵敏度高、特异性强、操作简便、成本低廉及高通量等优点，可用于辅助临床快速诊断致病性真菌的感染情况，为临床治疗提供参考依据。附图说明图1为12种真菌阳性对照品fam通道检测结果图。图2为12种真菌阳性对照品hex通道检测结果图。图3为12种真菌阳性对照品cy5通道检测结果图。图4为白色念珠菌阳性对照品检测结果图，a为fam通道检测图，fam探针的tm值为61.0；b为hex通道检测图，hex探针的tm值为68.8；c为cy5通道检测图，cy5探针的tm值为73.5。图5为阴性对照品检测结果图，a为fam通道检测图，b为hex通道检测图，c为cy5通道检测图，三个信号通道均无tm峰。图6为临床样本检测结果图，a为fam通道检测图，b为hex通道检测图，c为cy5通道检测图，fam探针的tm值为59.8，hex探针的tm值为67.8，cy5探针的tm值为72.5。图7为临床样本检测结果图，a为fam通道检测图，b为hex通道检测图，c为cy5通道检测图，fam通道不出峰，hex探针的tm值为65.5，cy5探针的tm值为67.8。图中英文字母对应的中文名称为：fluorescence荧光值；temperature温度，meltingpeaks熔解峰。具体实施方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1：扩增和检测鉴定临床常见真菌的核酸序列，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成：扩增真菌18sv2区的引物对：f1(seqidno.1)：5′-gtggtaattctagagctaataca-3′，r1(seqidno.2)：5′-aattctaatacgactcactataggggcagaaatttgaatgaasca-3′；扩增真菌18sv9区的引物对：f2(seqidno.3)：5′-ttgctcttcaacgaggaat-3′，r2(seqidno.4)：5′-aattctaatacgactcactatagggacggaaaccttgttacgact-3′；检测真菌18sv2区扩增子的分子信标：seqidno.5：5′fam-cggcgatcggactctttgatgattcataataacttttcgaatcgccg-dab3′；检测真菌18sv9区扩增子的分子信标：seqidno.6：5′hex-cgcgcgttgtgttgattacgtccctgccctttgtacgcgcg-dab3′；检测真菌18sv9区扩增子的分子信标：seqidno.7：5′cy5-cggcgctactaccgattgaatggcttagtgaggcctccggagcgccg-dab3′。实施例2：试剂盒的制备方法。(1)扩增反应液：该反应液中含有ph＝8.001mtris-hcl缓冲液、k+、mg2+、dntps(购于thermoscientific)、ntps(购于thermoscientific)、引物和分子信标(核苷酸序列交由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，用depc水溶解)，-20℃保存；(2)5×q-solution：该反应液中含有甜菜碱、bsa、dtt和dmso，-20℃保存；(3)酶反应液：该反应液中含有bsa、逆转录酶和t7rna聚合酶，-20℃保存；(4)阳性对照：分别抽提8种念珠菌，1种隐球菌，1种曲霉菌，1种毛霉菌和1种青霉菌的rna，每一种真菌rna的浓度最终稀释为30ng/μl，-20℃保存；(5)阴性对照：去rna酶的蒸馏水，-20℃保存。实施例3：检测方法。仪器：核酸纯化仪，roche480荧光定量pcr检测仪，beckman22r台式微量冷冻离心机，eppendorf5810r台式冷冻离心机，太仓华利达实验室设备公司wh-866型涡旋振荡器。(1)真菌rna模板的制备：参考公开的文献，不同种类的临床标本，采用相应的前处理方法，痰液等粘液首先利用裂解液水化，无菌体液直接高速离心收集菌体，去除上清，加100ul生理盐水重悬。按照真菌核酸抽提试剂盒说明书制备真菌rna，作为核酸恒温扩增反应模板备用。(2)以步骤(1)得到的真菌rna为模板，利用2对特异性引物和3条特异性分子信标进行临床致病真菌的扩增检测与鉴定，具体包括如下步骤；(2a)反应液配制：从-20℃冰箱取出实施例2中的各组分，室温融化。加样前10分钟之内，按检测样本数配置反应液xμl：x＝(4μl5×q-solution+6μl扩增反应液)×(n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)。振荡混匀后，2000rpm离心5s，按每孔10μl分装到8连孔反应管中，转至样本制备区备用。(2b)加样：向分装好试剂的反应孔中，分别加入待测真菌样本rna模板5μl(若样本裂解产物保存在-20℃，使用前置室温解冻，以13000rpm离心2min)，阳性对照孔加入5μl阳性对照，阴性对照孔加入5μl阴性对照，空白对照孔加入5μldepc水。盖好管盖，微震混匀，2000rpm离心5s，然后放入roche480荧光定量pcr检测仪中预变性处理65℃3mins，41℃3mins后取出。(2c)加酶反应液：向每个反应孔中加入酶反应液5μl，2000rpm离心5s。(2d)扩增检测：将反应管放入roche480荧光定量pcr仪中进行检测，反应条件如下：41℃1min，60个循环；65℃2mins，40℃2mins，连续升温至80℃，荧光采集点在41℃和升温过程，检测模式设置为探针法，反应体积设置为20。保存文件，运行。(2d)结果分析，具体包括如下步骤：roche480荧光pcr检测仪点击分析，选取tmcalling分析模式，进入分析窗口，依次选取fam,hex,cy5通道，点击计算，计算得到每个测试的三个tm值。(2e)阴阳性对照品结果标准及处理，具体按照如下步骤判定：阴性对照品的熔解曲线无tm值峰；阳性对照品的熔解曲线有明显的tm值峰。(3)步骤(2)所得的样本检测结果判断，具体按照如下标准：(3a)如果三个信号通道都无tm峰，则判样本结果为阴性。(3b)如果三个信号通道有tm峰出现，则按以下方法判断：表1常见真菌tm值参考范围对照表菌种/菌属famhexcy5白色念珠菌58.88-61.3366.96-69.8971.72-74.55热带念珠菌62.00-64.1067.06-69.2567.07-69.17近平滑念珠菌59.21-60.8867.48-69.4867.37-69.25光滑念珠菌57.06-57.7167.22-68.2163.56-64.56克柔念珠菌47.14-49.0166.77-69.6065.24-67.89季也蒙念珠菌56.68-58.4366.85-68.4571.44-72.52葡萄牙年念珠菌46.80-48.7266.12-68.1771.22-73.04乳酒念珠菌60.20-62.2866.66-68.4363.15-64.78新型隐球菌-66.27-69.2863.64-65.89曲霉菌属-62.83-65.3163.36-65.24毛霉菌属-67.78-70.6556.43-57.91青霉菌属-63.00-65.3065.92-67.12注：三个通道出现tm峰，但峰值不在上表范围内的为其他临床少见真菌。实施例4：临床患者细菌样品检测。将本发明所述的试剂盒用于40例真菌感染者的样本的检测，检测方法按照实施例3中的步骤实施，检测结果与微生物培养法对40例样品的检测结果进行比对，检测结果表2所示：表2样品检测结果对照表利用本发明提供的临床常见真菌快速检测与鉴定的试剂盒分析40例真菌感染患者的样本得到的检测结果与微生物培养法得到的检测结果一致。图4～7为利用本发明提供的试剂盒检测上述40例样品时的部分结果图。其中，图4为阳性对照品检测结果图；图5为阴性对照品检测结果图；图6为检测结果图，患者样本号“1”，fam探针的tm值为59.8，hex探针的tm值为67.8，cy5探针的tm值为72.5，结果为白色念珠菌；图7为检测结果图，患者样本号“13”，fam通道不出峰，hex通道tm值为65.5，cy5通道tm值为67.8，结果为青霉菌。本发明能检测的真菌菌株主要包括白色念珠菌，热带念珠菌，近平滑念珠菌，光滑念珠菌，克柔念珠菌，季也蒙念珠菌，葡萄牙念珠菌，乳酒念珠菌八种常见念珠菌，新型隐球菌，曲霉，毛霉和青霉。检测准确率为100％。本试剂盒具有操作简便快捷，灵敏、特异，成本低廉，能对常见临床真菌进行快速检测并鉴定菌种，用于临床能有利于医师进行快速诊断，改善治疗方案，减少抗生素药物的滥用。该技术方案技术门槛低，从样本到出检测结果时间为2小时，易于推广，具有较好的应用前景。sequencelisting<110>杭州迪安生物技术有限公司、杭州迪安医学检验中心有限公司<120>用于快速检测多种真菌并鉴定菌种的引物和探针及其应用<130>sg20170205<160>7<170>patentinversion3.5<210>1<211>23<212>dna<213>artificialsequence<220><223>扩增真菌18sv2区上游引物f1<400>1gtggtaattctagagctaataca23<210>2<211>45<212>dna<213>artificialsequence<220><223>扩增真菌18sv2区的下游引物r1<400>2aattctaatacgactcactataggggcagaaatttgaatgaasca45<210>3<211>19<212>dna<213>artificialsequence<220><223>扩增真菌18sv9区上游引物f2<400>3ttgctcttcaacgaggaat19<210>4<211>45<212>dna<213>artificialsequence<220><223>扩增真菌18sv9区的下游引物r2<400>4aattctaatacgactcactatagggacggaaaccttgttacgact45<210>5<211>47<212>dna<213>artificialsequence<220><223>检测真菌18sv2区扩增子的分子信标<400>5cggcgatcggactctttgatgattcataataacttttcgaatcgccg47<210>6<211>41<212>dna<213>artificialsequence<220><223>检测真菌18sv9区扩增子的分子信标<400>6cgcgcgttgtgttgattacgtccctgccctttgtacgcgcg41<210>7<211>47<212>dna<213>artificialsequence<220><223>检测真菌18sv9区扩增子的分子信标<400>7cggcgctactaccgattgaatggcttagtgaggcctccggagcgccg47当前第1页12