一种功能化温度敏感型聚合物及其制备方法与应用与流程

本发明涉及一种功能化温度敏感型聚合物及其制备方法与应用，属于分析化学领域。

背景技术：

O-连接的β-N-乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)是一种广泛存在于真核细胞中的翻译后修饰。与经典的O-糖基化修饰有所不同，O-GlcNAc糖基化修饰仅存在于细胞核和细胞质蛋白质，只有一个单糖结构，结构简单，是一种高度动态、可诱导且可逆的修饰方式。尽管蛋白质上的这种修饰丰度极低，但O-GlcNAc修饰蛋白质在生物体内扮演着重要角色，从基因转录到信号转导和细胞周期的调控等都有着O-GlcNAc糖基化修饰蛋白质的参与。研究表明蛋白质上O-GlcNAc糖基化修饰水平异常与许多人类疾病如神经退行性疾病、代谢类疾病及癌症等密切相关。鉴于此，对O-GlcNAc修饰蛋白质进行深度鉴定对疾病的发生发展、疾病诊断标志物的发现及治疗靶标有着深远意义。然而由于O-GlcNAc糖基化修饰处于极低的化学计量水平且O-GlcNAc糖苷键易断裂，对其鉴定手段提出了严峻的挑战。为了提高质谱鉴定灵敏度，在质谱鉴定前在复杂生物样品中对O-GlcNAc糖基化修饰蛋白质进行富集是必要步骤。近年来国内外发展了针对O-GlcNAc糖基化修饰蛋白/肽段的富集方法有：凝集素富集法、抗体富集法、酰肼富集法和代谢标签富集法等。凝集素是一种可以与某种特殊结构单糖或聚糖结合的糖蛋白，因此可利用凝集素与糖链间的亲和作用富集糖蛋白/糖肽。但其亲和力不足、选择性有限且偏爱簇生的GlcNAc修饰，因此富集效率低。抗体富集法是基于抗体抗原的特异性结合进行选择性富集。目前已商业化的O-GlcNAc修饰的抗体中使用较多的是RL2和CTD110.6，此方法的特异性和富集效率都强于凝集素富集法，但抗体存在底物氨基酸序列依赖性且制备周期长、价格昂贵而难以广谱性富集所有的O-GlcNAc修饰蛋白/肽段。酰肼富集法是利用氧化剂将O-GlcNAc糖链上相邻的两个羟基氧化形成醛基再利用其与带有酰肼基团的固相载体共价结合选择性富集O-GlcNAc修饰蛋白/肽段，但此方法需要进行多步化学反应，且氧化后糖链开环使得糖链结构不能完整保留，影响下游对糖链的结构解析。代谢标签富集法通过细胞代谢标记在O-GlcNAc修饰上引入叠氮等修饰基团再利用生物正交反应选择性富集O-GlcNAc修饰蛋白/肽段。此外，现有O-GlcNAc糖基化修饰蛋白/肽段的富集载体均为固相材料，在富集时与溶液中的靶分子蛋白形成异相体系，固液界面间的传质阻力和固相材料与目标蛋白间的空间位阻等因素都会降低富集反应速率和效率。因此需要提供一种新的富集O-GlcNAc修饰蛋白/肽段的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种功能化温度敏感型聚合物及其制备方法与应用，本发明通过自由基聚合反应和化学修饰的方式(三苯基磷基团修饰)制备得到功能化温度敏感型聚合物，能够实现选择性富集、分离O-GlcNAc修饰蛋白质，然后即可利用质谱技术分析鉴定O-GlcNAc修饰蛋白样品。

本发明所提供的功能化温度敏感型聚合物，其结构式如式Ⅰ所示：

式Ⅰ中，m为40～280之间的数，n为140～850之间的数。

所述功能化温度敏感型聚合物的数均分子量可为20000～120000，优选50000～60000。

式Ⅰ中，m优选为110～140之间的数，n优选为350～420之间的数。

所述功能化温度敏感型聚合物的数均分子量可为。

本发明进一步提供了所述功能化温度敏感型聚合物的制备方法，是以N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)和丙烯酸甲酯(MA)分别为温敏单体和功能单体，水合肼(Hydrazine Hydrate)和施陶丁格试剂2-(二苯基磷基)对苯二甲酸-1,1-甲基-4-五氟苯基酯(2-(Diphenylphosphino)terephthalic acid 1-methyl 4-pentafluorophenyl diester，phosphine-PFP ester)为功能基团修饰试剂；经自由基聚合反应得到温度敏感型聚合物后，依次加入两种功能基团修饰试剂，对所得温度敏感型聚合物共价修饰，生成带有大量三苯基磷基团的温度敏感型聚合物，也即所述功能化温度敏感型聚合物。具体包括如下步骤：

(1)在引发剂存在的条件下，温敏单体和功能单体经自由基聚合反应得到温度敏感型聚合物；

所述温度敏感型聚合物同时带有温度响应基团以及能与水合肼酰肼化的羧基基团；

所述温敏单体为N-异丙基丙烯酰胺；

所述功能单体为丙烯酸甲酯或丙烯酸；

(2)所述温度敏感型聚合物与水合肼经酰肼化反应得到酰肼修饰的温度敏感型聚合物；

(3)所述酰肼修饰的温度敏感型聚合物与2-(二苯基磷基)对苯二甲酸-1,1-甲基-4-五氟苯基酯经反应即得所述功能化温度敏感型聚合物。

上述的制备方法中，步骤(1)中，所述温敏单体与所述功能单体的摩尔比可为1：4～4：1，具体可为4：1；

所述引发剂可为过硫酸钾、过硫酸铵和过硫酸钠中任一种；

所述引发剂的用量可为所述温敏单体质量的5％～50％，具体可为10％；

所述自由基聚合反应的温度可为50～75℃，具体可为60℃，时间可为8～12小时，具体可为8h；

所述自由基聚合反应在水与甲醇或异丙醇的混合液中进行；

所述自由基聚合反应在惰性气氛中进行，如氮气或氩气气氛。

上述的制备方法中，步骤(2)中，所述水合肼与所述温度敏感型聚合物的摩尔比可为8：1～2：1，具体可为6：1；

在冰浴条件下将所述温度敏感型聚合物与所述水合肼混合；

所述酰肼化反应的温度可为20～25℃，时间可为2～6小时，具体可为5小时；

所述酰肼化反应在水与甲醇或异丙醇的混合液中进行；

所述酰肼化反应在惰性气氛中进行，如氮气或氩气气氛。

上述的制备方法中，步骤(3)对所述酰肼修饰的温度敏感型聚合物进行三苯基磷修饰；

所述酰肼修饰的温度敏感型聚合物与所述2-(二苯基磷基)对苯二甲酸-1,1-甲基-4-五氟苯基酯的质量比可为1：2～2：1，具体可为2：1；

所述反应的温度可为20～25℃，时间可为24～48小时，具体可为48小时；

所述反应在水与N,N-二甲基甲酰肼或二甲基亚砜的混合液中进行。

本发明提供的上述制备方法基于如下原理：

首先在引发剂存在下将温敏单体和功能单体通过自由基聚合反应得到温度敏感型聚合物；之后通过酰肼化反应将水合肼共价修饰于温度敏感型聚合物，达到设定反应时间后通过透析去除残留反应物；之后加入施陶丁格试剂与酰肼修饰的温度敏感型聚合物混合均匀继续反应，达到设定反应时间后通过透析去除残留反应物并进行冻干去除溶剂，得到三苯基磷修饰的温度敏感型聚合物，即功能化温度敏感型聚合物。

本发明提供的功能化温度敏感型聚合物可通过三苯基磷与叠氮基团之间高度特异性和生物正交的施陶丁格连接反应，对叠氮标记的O-GlcNAc修饰蛋白进行选择性富集，并利用此聚合物的温度响应特性，在富集时完全溶解实现均相反应富集，在回收时沉淀析出实现异相分离。富集所得的O-GlcNAc修饰蛋白可直接进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，也可酶解得到肽段后将样品点在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪靶上，或进样到液-质联用系统中进行分析。

将本发明功能化温度敏感型聚合物用于O-GlcNAc修饰蛋白富集和/或分离时，可按照如下步骤进行：

将含有O-GlcNAc修饰蛋白的样品与所述功能化温度敏感型聚合物溶解于缓冲溶液中并充分混合，在室温下进行O-GlcNAc修饰蛋白的富集；之后将温度升高使所述功能化温度敏感型聚合物从溶液中析出，并采用离心方式回收所得沉淀；在室温下使用缓冲溶液溶解聚合物沉淀并充分混合，再次升高温度沉淀聚合物并离心回收。如此重复清洗3次，除去样本中的非O-GlcNAc修饰蛋白质和盐类等杂质。对所得O-GlcNAc修饰蛋白进行电泳分析或者使用胰蛋白酶酶解后对所得肽段进行质谱分析。

上述的富集步骤中，所述功能化温度敏感型聚合物使用量可为0.4～1.0mg，优选1.0mg；

上述的富集步骤中，所述富集的时间可为10～60min，优选60min；

所述缓冲溶液为pH为7～8的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液、PBS缓冲溶液和Tris-HCl缓冲溶液中任一种；

所述析出的温度为32～40℃，优选40℃。

本发明所述功能化温度敏感型聚合物可对叠氮标记的O-GlcNAc修饰标准蛋白α-crystallin和牛血清白蛋白(质量比为1：10)的混合物进行富集和/或分离，具体步骤如下：

在室温下将含有叠氮标记O-GlcNAc修饰蛋白的样品与所述功能化温度敏感型聚合物使用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液溶解并充分混合，使三苯基磷和叠氮基团发生施陶丁格连接反应，达到设定反应时间之后升高温度至40℃使敏感型聚合物从溶液中析出，并采用离心方式去除沉淀回收上清，对上清进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。可知，富集后上清中不存在残留的叠氮标记O-GlcNAc修饰蛋白质，说明其已全部与功能化温度敏感型聚合物反应并被富集。

本发明所述功能化温度敏感型聚合物还可对叠氮标记的O-GlcNAc修饰标准蛋白α-crystallin和牛血清白蛋白(质量比为1：100)的混合物进行富集和/或分离，具体步骤如下：

在室温下将含有叠氮标记O-GlcNAc修饰蛋白的样品与所述功能化温度敏感型聚合物使用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液溶解并充分混合，使三苯基磷和叠氮基团发生施陶丁格连接反应，达到设定反应时间之后升高温度至40℃使温度敏感型聚合物从溶液中析出，并采用离心方式回收所得沉淀，在室温下使用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液溶解聚合物沉淀并充分混合，再次升高温度沉淀聚合物并离心回收。如此重复清洗3次，除去样本中的非O-GlcNAc修饰蛋白质和盐类等杂质，对所得富集了O-GlcNAc蛋白的聚合物样本使用胰蛋白酶进行酶解，将酶解产物肽段进行MALDI-TOF-MS表征。可知，富集后样品中的非O-GlcNAc修饰蛋白质和其他杂质基本被去除，O-GlcNAc修饰标准蛋白α-crystallin的氨基酸序列覆盖率显著提高。

利用本发明功能化温度敏感型聚合物对O-GlcNAc修饰蛋白样品进行选择性富集、分离，然后利用质谱技术分析鉴定O-GlcNAc修饰蛋白样品。本发明功能化温度敏感型聚合物是通过自由基聚合反应和化学修饰反应制备温度敏感型聚合物并对其进行三苯基磷基团修饰而得。

本发明具有以下有益效果：

1)本发明温度敏感型聚合物是通过自由基聚合反应得到的线型聚合物，带有大量的可修饰位点，经功能化修饰后得到携带大量三苯基磷基团的温度敏感型聚合物；

2)本发明功能化温度敏感型聚合物携带大量的三苯基磷富集基团将增加富集基团与O-GlcNAc修饰蛋白质的碰撞机率；

3)利用本发明功能化温度敏感型聚合物的温度响应特性，通过改变外界温度准确控制该温敏聚合物在水溶液中的溶解性，即富集时完全溶解，回收时沉淀分离，从而实现了均相反应富集和异相分离的效果，与传统固相材料相比显著降低了富集反应时的固液界面传质阻力和空间位阻，提高了富集速率和效率；

4)本发明对叠氮标记O-GlcNAc修饰蛋白质的富集原理是基于叠氮与三苯基磷间的施陶丁格连接反应，此反应生物正交性强，在水溶液中产率高、专一且稳定，同时不需要催化剂从而与后续质谱鉴定具有良好的相容性，该方法具有很高的富集效率和选择性，大幅度提高了混合样品中低丰度O-GlcNAc修饰蛋白质谱鉴定的氨基酸序列覆盖率。

附图说明

图1(a)为本发明所述功能化温度敏感型聚合物的合成路线图；图1(b)为使用本发明所述功能化温度敏感型聚合物富集O-GlcNAc修饰蛋白质的实验流程图。

图2为不同分子量功能化温度敏感型聚合物的温度响应照片。

图3为温度敏感型聚合物的X射线光电子能谱分析曲线。蓝色为温度敏感型聚合物，绿色为酰肼修饰的温度敏感型聚合物，红色为三苯基磷修饰的温度敏感型聚合物。

图4为不同温度条件下功能化温度敏感型聚合物的水合半径分析曲线。

图5为功能化温度敏感型聚合物温度响应及离心沉淀回收响应照片。

图6为功能化温度敏感型聚合物反复升降温后的透光率曲线；

图7(a)为使用不同质量的功能化温度敏感型聚合物富集叠氮标记的α-crystallin和牛血清白蛋白混合物后，上清液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图；图7(b)为功能化温度敏感型聚合物富集叠氮标记的α-crystallin，不同富集反应时间后上清液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图；图7(c)为叠氮标记的α-crystallin与牛血清白蛋白的混合物(质量比1：10)经功能化温度敏感型聚合物富集前后上清液的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图8(a)为叠氮标记的α-crystallin与牛血清白蛋白的混合物(质量比1：100)经功能化温度敏感型聚合物富集前，其胰蛋白酶酶解肽段的MALDI-TOF-MS质谱图；图8(b)为样品经功能化温度敏感型聚合物富集前，其酶解肽段MALDI-TOF-MS质谱分析对牛血清白蛋白的氨基酸序列覆盖率；图8(c)为样品经功能化温度敏感型聚合物富集后，富集产物的胰蛋白酶酶解肽段的MALDI-TOF-MS质谱图；图8(d)为样品经功能化温度敏感型聚合物富集后，富集产物的酶解肽段的MALDI-TOF-MS质谱分析对牛血清白蛋白的氨基酸序列覆盖率；图8(e)为样品经功能化温度敏感型聚合物富集后，富集产物的酶解肽段的MALDI-TOF-MS质谱分析对α-crystallin的氨基酸序列覆盖率。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、功能化温度敏感型聚合物的制备以及性能测试

功能化温度敏感型聚合物的合成路线如图1a)所示。

1)温度敏感型聚合物的合成：在引发剂条件下温敏单体与功能单体进行自由基共聚。

具体如下：在100mL圆底烧瓶中加入50mL 50％甲醇，磁力搅拌并通N₂以除尽圆底烧瓶中的O₂，1h后称取800mg N-异丙基丙烯酰肼快速加入上述烧瓶中，继续通N₂ 30min，在N₂氛围下缓慢加入0.15mL丙烯酸甲酯，通N₂并搅拌30min后，缓慢滴入已由200μL除氧水溶解的80mg过硫酸钾，通N₂ 30min以保证接下来的自由基聚合反应处于N₂氛围下，撤去N₂装置，盖上塞子，封口膜封口，在塞子上插入一个充满N₂的气球，60℃反应8h。

2)酰肼修饰的温度敏感型聚合物的合成：利用水合肼的氨基与温度敏感型聚合物的丙烯酸甲酯基团进行酰肼化反应，从而在温度敏感型聚合物上引入酰肼基团。

具体如下：在冰浴环境下边搅拌边用注射器缓慢滴入1.8mL水合肼(水合肼与温度敏感型聚合物的摩尔比为6：1)，全部滴完后，在室温下搅拌反应5h，酰肼化反应完成后，使用旋转蒸发仪进行旋蒸以除去其中的有机溶剂甲醇，旋蒸至烧瓶内原来体积的二分之一，将剩余溶液转移至分子量为3KD的透析袋中，透析48h，期间要不断的更换去离子水，透析结束后转移至1.5mL离心管中，使用冷冻干燥机进行浓缩得到白色絮状固体即酰肼修饰的温度敏感型聚合物，-20℃冰箱保存备用。

3)三苯基磷修饰的温度敏感型聚合物的合成：利用施陶丁格试剂中的五氟基团与酰肼间的共价反应在温度敏感型聚合物上进行三苯基磷基团的修饰。

具体如下：称取1g已制备好的酰肼修饰的温度敏感型聚合物，溶解于2mL的去离子水中，称取0.5g施陶丁格试剂2-(二苯基磷基)对苯二甲酸-1,1-甲基-4-五氟苯基酯溶解于500μL N,N-二甲基甲酰肼中，将其与酰肼修饰的温度敏感型聚合物溶液混合，通N₂ 5min除去O₂后，使用旋转混匀器室温下旋转反应48h，反应完成后使用30KD的超滤管进行超滤以除去未反应的施陶丁格试剂，最后对溶液进行冷冻干燥得到白色絮状固体即三苯基磷修饰的温度敏感型聚合物，其结构式如式Ⅰ所示，其中，m为110～140之间的数，n为350～420之间的数，数均分子量为50000～60000。

功能化温度敏感型聚合物富集O-GlcNAc修饰蛋白质的流程如图1b)所示。

1)对O-GlcNAc修饰蛋白质进行叠氮标记：使用体外酶催化试剂盒按照说明书进行标记。

具体如下：称取适量的O-GlcNAc修饰蛋白质，用20mMHepes缓冲溶液(pH 7.9)配制成浓度为3.5μgμL^-1的蛋白溶液。

表1叠氮标记试剂及用量

按照表1中的顺序依次加入试剂盒中各种试剂，且每加一种试剂都要进行涡旋使其混合均匀后再加下一种试剂。最后管口封上封口膜，4℃过夜进行叠氮标记。O-GlcNAc修饰蛋白质叠氮标记完后，依次在管中加入600μL甲醇，150μL氯仿，400μL去离子水，涡旋混匀，14000g离心5min，用移液枪吸出上层溶液，从而除去过量的UDP-GalNAz，继续在管中加入450μL甲醇，涡旋混匀，14000g离心5min，用移液枪吸出上层溶液，用氮气将多余的甲醇吹干。最后将上述蛋白溶解于20μL 20MmHepes缓冲溶液(pH 7.9)中，-80℃冰箱保存备用。

2)富集：基于叠氮与三苯基磷间的施陶丁格反应进行O-GlcNAc修饰蛋白质的富集。

具体如下：含有叠氮标记的O-GlcNAc修饰蛋白质的混合蛋白溶解于Hepes缓冲溶液(pH 7.9)中，称取适量的功能化温度敏感型聚合物溶解于上述溶液中，涡旋混匀，在室温下进行富集反应60min，反应完成后利用聚合物的温度响应特性，使用金属浴加热至40℃并使用离心机离心，去除上清并回收沉淀实现对叠氮标记的O-GlcNAc修饰蛋白质的富集。使用20mM Hepes缓冲溶液(pH 7.9)室温下溶解沉淀并混合均匀后，再升温并离心，去除上清并回收沉淀聚合物，如此反复升降温清洗沉淀3次以去除非特异性吸附的非O-GlcNAc修饰蛋白，实现O-GlcNAc修饰蛋白质的高选择性富集。

对不同引发剂条件下所制备的温度敏感型聚合物的分子量进行分析，所得结果如表2，同时对不同分子量的温度敏感型聚合物进行温度响应表征，所得结果见图2。

表2不同引发剂条件下所制备温度敏感型聚合物的分子量。

研究发现自由基聚合反应中改变引发剂的量可以改变聚合物的分子量。通过凝胶渗透色谱对合成聚合物分子量进行了表征，如表2，引发剂使用量越少，合成的聚合物分子量越大，反之，引发剂使用量越多，合成的聚合物分子量越小。同时合成聚合物分子量的大小对其温度响应能力和在分离富集中的应用效果有直接影响。若聚合物分子量太小，在温度高于其最低临界响应温度时，聚合物链不易团聚，温度响应不明显，导致聚合物及其富集靶分子的回收率降低。若聚合物分子量太大，其在水溶液中的溶解度下降，而且空间位阻也会导致富集效率降低。从图2中看出，分子量越大，当改变温度时温度响应效果越明显。因此综合考虑聚合物的水溶性、温度响应两方面的因素，选择引发剂为1mM，分子量为64980的温度敏感型聚合物进行后续实验。

对选定分子量的温度敏感型聚合物进行功能化修饰，取上述方法所得各个合成阶段的聚合物分别进行X射线光电子能谱分析，所得结果见图3。

由图3可知，经三苯基磷修饰后的温度敏感型聚合物(从上之下第1条)在125～130eV处有明显的磷元素的特征峰出现，前面两步合成的温度敏感型聚合物(从上之下第2条)和酰肼修饰的温度敏感型聚合物(从上之下第3条)在此处没有P的特征峰出现，由此证明了三苯基磷基团已成功修饰到了温度敏感型聚合物上。

对选定分子量的功能化温度敏感型聚合物在不同温度条件下的水合半径进行分析，所得结果见图4。

由图4可知，从31℃左右开始，聚合物的水合半径随温度升高不断增大，说明聚合物开始团聚。随着温度的进一步升高，聚合物的水合半径继续增大，说明溶液中的聚合物团聚规模进一步提高并逐渐从溶液中析出，直至温度达到40℃左右，聚合物的水合半径达到最大值并趋于稳定，说明聚合物已从水溶液中完全析出。因此在应用该功能化温度敏感型聚合物对目标分子进行分离富集时，选择最适响应温度是40℃。

对选定分子量的功能化温度敏感型聚合物进行温度响应及离心沉淀回收表征，所得结果见图5。

由图5可知，当环境温度低于其最低临界响应温度时，聚合物链的亲水性酰肼基团可以与水形成氢键，从而可以与水相良好的互溶，直观表现是形成澄清透明的溶液。当环境温度高于其最低临界响应温度时，氢键逐渐断裂，疏水性异丙基基团暴露在聚合物链的外侧，聚合物在水溶液中发生相转变，从水溶液中析出，生成白色悬浊液。在温度高于其最低临界响应温度时进行离心，可使聚合物沉于离心管底部。通过此分析，表明了功能化温度敏感型聚合物具有良好的温度响应特性，而且结合其温度响应特性及离心技术可以有效的实现样品中靶分子的分离富集。

对选定分子量的功能化温度敏感型聚合物进行反复升降温循环，进行不同溶解状态下的透光率分析，所得结果见图6。

升温前，聚合物的水溶液为清澈透明，将此时使用紫外-可见分光光度计测得透光率设为100％；升高温度至40℃后，聚合物从溶液中析出，溶液变为白色悬浊液，将此时使用紫外-可见分光光度计测得透光率设为0。由图6可知，升温前，聚合物的透光率为100％；升温后，聚合物的透光率为0。经6次反复升降温循环后测定其透光率，与第一个循环的初始值是一致的。由此说明本发明温度敏感型聚合物可以多次重复使用，其水溶性及温度响应能力并不会降低。

实施例2、利用实施例1所得功能化温度敏感型聚合物对叠氮标记O-GlcNAc修饰蛋白质进行富集

1)称取适量的α-crystallin标准蛋白溶解于20mM Hepes缓冲溶液(pH 7.9)配制成浓度为3.5μgμL^-1的标准蛋白溶液。使用体外酶催化试剂盒按照说明书加入各种试剂对α-crystallin蛋白4℃过夜进行叠氮标记。α-crystallin标准蛋白叠氮标记完后，依次加入甲醇、氯仿和去离子水使蛋白沉淀，从而除去过量的UDP-GalNAz，用氮气将多余的甲醇吹干。最后α-crystallin蛋白溶解于20mM Hepes缓冲溶液(pH 7.9)中，-80℃保存备用；

2)称取4份功能化温度敏感型聚合物，分别为0.4mg、0.6mg、0.8mg和1.0mg，溶解于含有α-crystallin蛋白的20mM Hepes缓冲溶液(pH 7.9)中，室温下混合反应0-60min，富集反应完成后，升高温度至40℃使聚合物析出，并快速离心分别回收沉淀和上清液，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和质谱分析。

3)通过步骤2)优化出功能化温度敏感型聚合物的最佳使用量和富集反应时间后，将叠氮标记的α-crystallin或其与牛血清白蛋白的混合物(质量比1：10)溶解于20mMHepes缓冲溶液(pH 7.9)中，加入1.0mg功能化温度敏感型聚合物，室温下混合反应60min。富集反应完成后，升高温度至40℃使聚合物析出，并快速离心去除聚合物及其捕获O-GlcNAc修饰蛋白质，上清液冻干浓缩进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。所得结果如图7所示。

由图(a)可知，当使用1.0mg功能化温度敏感型聚合物时，在上清液中没有残留的叠氮标记的α-crystallin保留，表明富集完全。且当1.0mg功能化温度敏感型聚合物与未叠氮标记的α-crystallin(泳道C)进行富集反应时，大量的α-crystallin蛋白保留在上清液中，由此证明此富集原理是基于特异性的施陶丁格反应而不是非特异性吸附使得叠氮标记的α-crystallin被富集出来从而在上清液中去除，同时确定最佳功能化温度敏感型聚合物使用量为1.0mg进行后续实验。由图(b)可知，随着富集反应时间的延长，叠氮标记的α-crystallin在上清液中的残留不断减少，富集反应时间达到60min后，上清液中几乎没有叠氮标记的α-crystallin残留，因此确定最佳富集反应时间为60min。由图(c)可知，只有叠氮和三苯基磷同时存在时才可以实现α-crystallin的富集。同时说明此功能化温度敏感型聚合物的非特异性吸附少，从而实现在实际生物样本中低丰度O-GlcNAc修饰蛋白质的高特异性和高选择性富集。

实施例3、利用实施例1所得功能性温度敏感型聚合物进行混合样品中O-GlcNAc修饰蛋白质的富集

1)称取适量的α-crystallin标准蛋白溶解于20mM Hepes缓冲溶液(pH 7.9)配制成浓度为3.5μgμL^-1的标准蛋白溶液。使用体外酶催化试剂盒按照说明书加入各种试剂对α-crystallin蛋白4℃过夜进行叠氮标记。α-crystallin标准蛋白叠氮标记完后，依次加入甲醇、氯仿、去离子水使蛋白沉淀，从而除去过量的UDP-GalNAz，用氮气将多余的甲醇吹干。最后α-crystallin蛋白溶解于20mM Hepes缓冲溶液(pH 7.9)中，-80℃保存备用；

2)叠氮标记的α-crystallin与牛血清白蛋白的混合(质量比1：100)溶解于20mMHepes缓冲溶液(pH 7.9)中，称取适量的功能化温度敏感型聚合物溶解于上述溶液中，涡旋混匀，室温下旋转混匀器旋转进行富集反应60min，反应完成后利用聚合物的温度响应特性，使用金属浴加热至40℃并使用离心机快速离心，回收沉淀实现叠氮标记的α-crystallin与牛血清白蛋白的分离。使用20mM Hepes缓冲溶液(pH 7.9)，利用聚合物的温度响应特性，采用反复升降温溶解-沉淀的方式，清洗3次以去除非特异性吸附的蛋白。

3)将富集到的O-GlcNAc修饰蛋白质α-crystallin与功能化温度敏感型聚合物的偶联物重新溶解于含8M尿素的25mM碳酸氢铵溶液中进行变性处理，加入二硫苏糖醇56℃水浴中还原1小时，之后加入碘乙酰胺于暗处放置30min进行烷基化处理。取变性蛋白按质量比1:50(胰蛋白酶：蛋白质)加入胰蛋白酶，放置于37℃水浴孵育12小时，得到酶解产物。使用金属浴升温至40℃，功能化温度敏感型聚合物离心析出将聚合物除去，上清液为所富集O-GlcNAc修饰蛋白质α-crystallin酶解后的肽段。

4)酶解后的肽段需经过C₁₈Zip-Tips脱盐小柱脱盐。脱盐主要步骤为柱体的活化，平衡，上样，淋洗，洗脱。洗脱液冷冻干燥后，使用0.1％FA溶液重溶，取1μL重溶液体点在基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪靶上，干燥后，点上5μLα-氰基-4-羟基肉桂酸(5mg mL^-1，5％ACN，0.1％FA)作为基质，靶上溶液结晶后进行MALDI-TOF-MS质谱分析。所得结果如图8所示。

由图可知，从质谱图上明显观察到富集前后的变化，富集前谱图图8(a)中有大量来自高丰度牛血清白蛋白肽段的质谱峰，将谱图以肽指纹图谱模式与数据库进行比对，牛血清白蛋白的氨基酸序列覆盖率高达90％，如图8(b)；而α-crystallin肽段的质谱峰全部被牛血清白蛋白肽段的信号所掩盖，无法得到有效鉴定，对应的氨基酸序列覆盖率为0％。富集后的谱图如图8(c)，绝大部分牛血清白蛋白肽段被去除，氨基酸序列覆盖率显著降低至22％，如图8(d)；低丰度α-crystallin对应肽段的信号得到明显提升，其中a链的氨基酸序列覆盖率为75％，b链达到91％，如图8(e)。以上结果说明本发明功能化温度敏感型聚合物可以特异性富集叠氮标记的α-crystallin，且非特异性吸附小，具有良好的选择性和高特异性，由此功能化温度敏感型聚合物对复杂样品中O-GlcNAc修饰蛋白质具有明显富集效果，基本在存在大量非O-GlcNAc修饰蛋白质干扰的条件下仍可获得极高的富集选择性。