特异结合膜联蛋白A2的核酸适体wh6及其应用的制作方法

本发明属于适体领域，具体涉及特异结合ANXA2的核酸适体，还涉及该适体的应用。

背景技术：

膜联蛋白A2（Annexin A2, ANXA2）是由339个氨基酸组成的分子量为36 kDa的蛋白质, 是一种Ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，在细胞中可以单体(p36)、异源二聚体(p36/p11)和异源四聚体(p362/p112)三种形式存在。它在结构上高度保守并且在几乎所有真核生物中表达，主要分布在细胞膜、细胞浆中，一小部分存在于细胞核中。ANXA2 主要表达于内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、神经细胞和一些肿瘤细胞；在脑癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌和结肠癌以及血液肿瘤中表达上调。ANXA2在肿瘤中的异常表达与肿瘤的发生、发展、浸润、转移及预后密切相关。ANXA2在高侵袭、高转移的恶性肿瘤中的异常表达，提示ANXA2有望成为判断肿瘤浸润和转移能力及肿瘤病人预后的标志物，可作为肿瘤治疗潜在的靶分子，该核酸适体可用于肿瘤早期检测及治疗。

目前，ANXA2的检测方法主要有免疫组化法，酶联免疫法等免疫学检测法。依赖抗体的免疫学检测法操作简单，灵敏度高，无需大型昂贵仪器设备，适用于大量样品的检测，但是这种方法检测的假阳性率比较高，定量也不够准确。并且抗体试剂稳定性差，储存条件较DNA核酸适体严格。核酸适体能与各种有机物或无机物靶标分子高特异性、高亲和力结合，同时具有分子量小，免疫原性低，稳定性好，制备和标记方便等优点。核酸适体作为抗体分子的替代分子，在疾病的诊断和治疗中发挥重要作用。但迄今尚无针对ANXA2的DNA核酸适体报道或公开，因此有必要开发一种可特异结合ANXA2的核酸适体。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供特异结合并作用ANXA2的核酸适体。

本发明人通过采用消减筛选的策略，利用GST-ANXA2融合蛋白作为筛选靶标，获得与融合蛋白结合的DNA序列，进一步通过将GST蛋白作为负性筛选，将与GST蛋白结合的DNA序列去掉，获得与ANXA2蛋白特异结合的核酸适体，通过筛选获得了一条特异结合ANXA2的核酸适体（命名为wh6）。所述核酸适体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提供所述特异结合ANXA2的核酸适体在制备检测ANXA2试剂中的应用。通过将ANXA2蛋白与酶标板结合，然后利用生物素标记的wh6核酸适体孵育结合；PBS洗板后，加入过氧化物酶标记的链霉亲和素孵育，加入过氧化物酶的底物显色，通过酶标仪检测并计算ANXA2的浓度。

本发明提供所述特异结合ANXA2的核酸适体在纯化和浓缩ANXA2中的应用。ANXA2蛋白与生物素标记的wh6核酸适体结合，然后加入链霉亲和素磁珠孵育，通过磁珠可将ANXA2纯化和浓缩。

本发明提供特异结合ANXA2的核酸适体在制备靶向ANXA2药物中的应用。细胞膜表面的ANXA2蛋白能与多种蛋白结合发挥其生理作用，wh6能与ANXA2蛋白结合，可能阻断ANXA2蛋白与其它蛋白的相互作用，其功能表现为wh6阻断ANXA2蛋白促进MM.1S和RMPI-8226细胞的生长，wh6能抑制MM1.S和RPMI-8226细胞对ANXA2蛋白的粘附作用。

本发明的有益效果在于：

本发明公开了特异结合ANXA2的核酸适体，该核酸适体能够与ANXA2特异性结合，为ANXA2纯化和浓缩，靶向ANXA2的药物以及定量或定性检测ANXA2提供了靶分子，同时为检测血清中ANXA2的水平，反映机体肿瘤负荷状态提供了工具，也为临床选择最佳的治疗方案提供了策略，为观察治疗效果和判断预后提供帮助。

附图说明

图1. wh6核酸适体的二级结构；

图2.采用Western blot方法检测不同多发性骨髓瘤细胞株ANXA2蛋白的表达情况；

图3.采用流式细胞仪检测低表达ANXA2和高表达ANXA2多发性骨髓瘤细胞株与wh6的结合；

图4.Western blot检测shRNA敲低ANBL-6细胞中ANXA2的表达；

图5.流式细胞仪检测敲低ANXA2后ANBL-6细胞与wh6的结合；

图6.Aptamer-pull down实验检测wh6与ANXA2蛋白结合；

图7. wh6抑制ANXA2刺激MM.1S和RPMI-8226细胞的生长；

图8. wh6抑制HS-5细胞刺激MM.1S和RPMI-8226细胞的生长；

图9. wh6抑制MM.1S和RPMI-8226细胞与ANXA2蛋白的粘附；

图10. 体内观测荷瘤小鼠尾静脉注射Cy5-wh6和Cy5-DNA-lib文库的活体成像图；

图11. 荷瘤小鼠尾静脉注射Cy5-wh6和Cy5-DNA-lib文库的器官荧光成像图。

具体实施方式

实施例1

合成长度为80 nt的核苷酸文库序列（上海生工生物工程（上海）股份有限公司），具体序列如下：5'-ACCGAC CGT GCT GGA CTC A (N)42 A CTA TGA GCGAGC CTG GCG-3'，两端为固定序列，本文库中间42N代表42个随机碱基，可保证其库容量大约为10¹⁴，足够大库容量可形成不同的三维空间结构，从而保证具有与靶标结合的空间结构的序列存在，并在后面的筛选过程中筛选出来，库的序列为P80 ss库。然后将随机寡聚ssDNA文库用如下引物进行扩增：

P80-SF：5'-FAM-ACC GACCGT GCT GGA CTC A-3' （SEQ ID NO.1）

P80-AP: 5'-biotin-CGC CAG GCT CGC TCA TAG T-3' （SEQ ID NO.2）

随机ssDNA文库（首轮筛选量为5000 pmol，相当于4个OD随机库）用1mL 1×选择缓冲液溶解于EP管中（1%BSA包被，4℃封闭过夜），95℃变性10 min，变性后立即置于0℃放置10 min。混匀包被了GST蛋白的磁珠溶液，取100 μL置于BSA包被的EP管中，用150 μL结合缓冲液洗涤3次。ssDNA文库与包被了GST蛋白的磁珠混匀，室温反应1 h，然后取上清，去除与GST蛋白结合的ssDNA序列。混匀包被了ANXA2的磁珠溶液，取100 μL置于BSA包被的EP管中，用150 μL结合缓冲液洗涤3次。将上清ssDNA文库与包被了膜联蛋白的磁珠混匀，同时加入酵母tRNA竞争结合，室温反应1 h。置磁力架2-3 min，弃上清，用1×洗涤缓冲液洗去未结合的ssDNA,如此重复3次。置磁力架3-4 min，弃上清，管中加入200 μL去离子水，95℃加热5 min，置磁力架2 min，取上清为模板，进行PCR扩增。

配置PCR体系：模板2μL，引物P80-SF（10uM）1μL,引物P80-AP（10uM）1μL，dNTP（各2.5mM）4μL，10×buffer 5μL，Taq DNA聚合酶 0.25μL，ddH₂O 36.75μL(总体积为50μL)。按如下条件，在PCR仪上扩增：95℃预变性3 min，95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共25个循环，72℃总延伸5 min。扩增后将PCR产物转移置一个1.5 mL的离心管中。将200μL 1×磁珠结合洗涤缓冲液重悬链霉亲和素琼脂糖珠，使链霉亲和素琼脂糖珠的终浓度为5μg/μL,加入1 mlPCR产物，室温摇床结合1 h， 1000 rpm，离心2 min，弃上清。用1×磁珠结合洗涤缓冲液洗涤2-3次，加入400μL的200 mM NaOH孵育5 min，使dsDNA解链，1000 rpm，离心2 min，含生物素的一条ssDNA仍留在链霉亲和素琼脂糖珠上，而另一条不带生物素的ssDNA存在于上清中，分离上清中ssDNA即为下一轮筛选的富集库，如此重复进行9个循环。

克隆测序及序列分析

将第9轮筛选得到的寡核苷酸适体富集库用无修饰的引物扩增，PCR产物经纯化后送上海生工生物工程有限公司进行高通量测序，测序成功后获得了两条与ANXA2结合的核酸适体，其中一条序列如SEQ ID NO.3所示，命名为wh6（另一条命名为wh3，另案予以申请）。具体序列如下：

5'-ACCGACCGTGCTGGACTCAGTCCGATCTCTCCACAGAGACAAACTTAGGACCCCTAGTCCCACTATGAGCGAGCCTGGCG -3’(SEQ ID NO.3)

然后通过mfold软件行对wh6核酸适体序列二级结构进行分析，结构如图1所示。

实施例2

使用RIPA蛋白裂解液（P0013B，Beyotime生物技术研究所）提取多发性骨髓瘤ANBL-6和NCI-H929细胞的总蛋白，用BCA试剂盒（购自promega公司）测定蛋白浓度，电泳，转膜，分别与ANXA2抗体（sc86235，Santa Cruz生物公司,稀释比为1：1000）和GAPDH抗体（稀释比为1：5000）孵育，加入相应HRP标记的二抗，孵育2 h，PBST洗膜，通过ECL反应液显影。检测不同多发性骨髓瘤细胞株ANXA2蛋白的表达情况。

结果见图2，发现ANXA2在多发性骨髓瘤ANBL-6细胞中表达较高，而在NCI-H929细胞中表达较低。

实施例3

多发性骨髓瘤ANBL-6细胞和NCI-H929细胞培养至对数生长期，计数将细胞调至1×10⁶个/mL；各取0.3 mL细胞，用Wash Buffer洗两次；将FITC荧光基团修饰的wh6和DNA-lib，用Binding Buffer稀释到250 nM；与细胞在冰水混合物中孵育50 min，用Binding Buffer洗两次,每次2 min；用PBS将细胞重悬至400 μL，经流式细胞仪检测并分析结果。

结果见图3显示wh6核酸适体与多发性骨髓瘤ANBL-6细胞有显著结合，而与多发性骨髓瘤NCI-H929细胞无明显结合。

实施例4

ANXA2-shRNA干扰序列（TRCN0000296322, TRCN0000056147）通过293T细胞进行病毒包装，并用NIH3T3细胞检测病毒滴度。ANBL-6细胞培养至对数生长期。经计数后，将细胞调至1×10⁶个/mL；用30×10⁶病毒感染1×10⁶个细胞。感染病毒48小时后，收集细胞，取其中一半用流式细胞仪检测ANBL-6细胞与wh6核酸适体的结合；另一半细胞提取其总蛋白，采用Western blot检测细胞ANXA2的表达。

结果见图4，发现干扰序列能敲低ANBL-6细胞中ANXA2的蛋白表达；附图5结果显示，在ANBL-6细胞中敲低ANXA2后与wh6核酸适体的结合明显下降。

实施例5

1×10⁷个ANBL-6细胞用Western blot及IP细胞裂解液(碧云天，P0013)冰上裂解30 min，提取细胞总蛋白,取20μL蛋白液作为input。平均分到三个EP管中，分别加入50 pmol的5’端生物素修饰的wh6核酸适体和DNA-Lib,并设链霉亲和素琼脂糖珠的阴性对照组，4℃摇床孵育1 h。然后加入20μL的链霉亲和素琼脂糖珠，4℃摇床孵育1 h。然后1000 rpm，离心2 min，弃上清，加入1 mL的DPBS洗5 min，1000 rpm，离心2 min，弃上清。重复用DPBS洗三次，加入40μL的Western blot上样缓冲液到EP管中，95℃加热5 min。然后1000 rpm，离心2 min，取上清。SDS-PAGE电泳，转膜，牛奶封闭后用小鼠单克隆ANXA2抗体4℃孵育过夜，TPBS洗三次，加入HRP标记的兔抗鼠的IgG，通过ECL反应液显影，检测wh6和DNA-Lib与ANXA2蛋白的结合情况。

结果显示（参见图6），DNAl-lib及链霉亲和素琼脂糖珠不与ANXA2蛋白结合，wh6能与ANXA2蛋白结合。

实施例6

将对数生长期的MM.1S和RPMI-8226细胞2×10⁵个/mL铺至24孔板中。生长过夜后，第二天加入1μg/mL的ANXA2蛋白；同时分别加入4μM的DNA-lib和wh6核酸适体。继续培养72 h，细胞计数，观察ANXA2对细胞生长的刺激作用和wh6核酸适体对细胞生长的阻断情况。

结果显示（参见图7）：ANXA2蛋白能明显促进MM.1S和RPMI-8226细胞的生长，DNA-lib对ANXA2蛋白能促进MM.1S和RPMI-8226细胞的生长无影响，而wh6能阻断ANXA2蛋白促进MM.1S和RPMI-8226细胞的生长。

实施例7

将HS-5细胞以1×10⁵个/ml铺至24孔板中。生长过夜后，第二天加入加入1×10⁶个MM.1S和RPMI-8226细胞；并分别加入4 μM的DNA-lib和wh6核酸适体，继续培养72 h。然后将上层培养的悬浮细胞，吸到96孔板中，用CCK-8试剂盒检测细胞活性。

结果显示（参见图8）：ANXA2核酸适体能阻断HS-5细胞能促进MM.1S和RPMI-8226细胞的增殖。

实施例8

ANXA2重组蛋白用结合缓冲液稀释到1μg/mL，取200μL加入到96孔板中。4℃孵育过夜，用DPBS洗四次，每次3 min。用1%BSA 37℃封闭2 h，DPBS洗三次，每次3 min。将MM.1S细胞和RPMI-8226细胞用DiI（碧云天，C1036）染色20 min。取100μL加入已经包被ANXA2蛋白的96孔板的孔中，同时分别加入4 μM的DNA-lib和wh6核酸适体，与细胞共同孵育2 h。用DPBS洗3次，每次2 min。通过全波长酶标仪测荧光（激发光549 nm，发射光635 nm）。

结果显示（参见图9），ANXA2核酸适体抑制MM.1S.和RPMI-8226细胞对ANXA2蛋白的粘附作用。

实施例9

NCG小鼠购自南京大学动物模式研究所，雄性，4-6周大小。在小鼠的左侧背部皮下注射1×10⁷个ARP-1细胞，肿瘤细胞生长约15-20天左右（直到肿瘤直径大小为0.5-1.5cm）。皮下成瘤的NCG小鼠通过尾静脉注射cy5-荧光标记wh6核酸适体和DNA-lib序列，在固定的时间点通过IVIS Lumina II小动物成像系统采集荧光信号。对于离体荧光实验，荷瘤小鼠静脉内注射用Cy5标记wh6或DNA-lib序列。在注射后1小时用乙醚麻醉，颈椎脱位处死。通过解剖取其脾、肺、心脏和肿瘤组织等组织，用IVIS Lumina II小动物成像系统采集荧光信号。

结果显示（参见图10）：通过尾静脉注射Cy5标记wh6后，肿瘤处的荧光信号在注射后30min最强，注射60 min时荧光信号有所下降，并在注射2 h后几乎消失。而尾静脉注射Cy5标记DNA-lib的荷瘤小鼠，在肿瘤组织处无明显的荧光信号。

结果显示（参见图11）：通过尾静脉注射Cy5标记wh6和DNA-lib序列1 h后，观察荧光信号的组织聚集分布结果显示，wh6主要在肿瘤组织处聚集，在肺组织，脾组织和心脏组织无荧光信号聚集。而注射DNA-lib的小鼠肿瘤组织，肺组织、脾组织和心脏组织无荧光信号的聚集。

<110> 中南大学，湖南大学

<120> 特异结合膜联蛋白A2的核酸适体wh6及其应用

<160> 3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<400> 1

ACCGACCGTGCTGGACTCA 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<400> 2

CGCCAG GCTCGCTCATAGT 19

<210> 3

<211> 80

<212> DNA

<400> 3

ACCGACCGTGCTGGACTCAGTCCGATCTCTCCACAGAGACAAACTTAGGACCCCTAGTCCCACTATGAGCGAGCCTGGCG 80