检测食品中副溶血弧菌的RPA特异性引物及试剂盒与应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种检测食品中副溶血弧菌的rpa特异性引物及试剂盒与应用。

背景技术：

副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)是水产品中引起食物中毒的重要病原菌之一，在海产品中的携带率高达45.7％。在我国沿海地区，由副溶血弧菌引起的食物中毒占细菌性食物中毒事件首位，其中也包括台湾省；在日本，由该菌引起的食物中毒占第二位。所以，副溶血弧菌是食品安全检测中的一项重要指标。但目前法定的副溶血弧菌检测方法仍然是传统培养方法，操作繁琐、费时、费力，常常需要5～6天才能完成，而且鉴定副溶血弧菌的生化指标非常不稳定，常常需要重复实验才能最终确定是否为副溶血弧菌，此类方法已不能满足目前对大量食品样品快速检测的需求，急切需要建立一种快速、有效的检测方法。

扩增内标是添加到pcr反应体系中用以指示假阴性现象的一段人工构建dna序列或者是一段致病菌的保守基因序列。扩增内标作用的主要原理是：将扩增内标添加到pcr反应体系中，使之与目的基因进行共同扩增，如果在反应体系中存在一些抑制因素，则扩增内标和目的基因的扩增反应都将受到抑制，从而达到指示pcr反应假阴性的目的。

目前，扩增内标(internalamplificationcontrol，以下简称iac)已广泛应用于rt-pcr定量检测和常规pcr定性检测中，检测范围覆盖动植物及微生物，欧洲标准化委员会(theeuropeanstandardizationcommittee，cen)与国际标准化组织(internationalstandardorganization，iso)联合制定的针对食源性致病菌的pcr检测标准(eniso22174：2005)中明确规定检测体系中必须添加扩增内标，且许多研究也已证明扩增内标可有效指示pcr假阴性结果。

目前副溶血弧菌的检测方法主要有培养法、实时荧光定量pcr(real-timepcr)方法、环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)和酶联免疫吸附方法(enzymelinkedimmunosorbentassay，elisa)等。已有报道利用elisa方法检测副溶血弧菌，该方法灵敏度高，操作简单，但所需检测时间也在1～2天，而且抗体制备周期长，费用较高，灵敏度不及实时荧光定量pcr。国内外已有很多利用实时荧光pcr方法检测副溶血弧菌的报道，检测结果更为快速、灵敏、准确。但传统基于pcr的方法需要变性、退火、延伸三个步骤，每个步骤的温度不一样，需要专门的较昂贵的热循环仪(pcr仪)来进行，限制了其使用范围。因此许多不依赖pcr仪的等温扩增技术被发明出来，尤其以lamp应用最为广泛。

rpa(recombinasepolymeraseamplifcation)是一项新型的等温扩增技术，其主要原理为利用重组酶和引物形成微丝在模板dna上搜索到与之完全互补配对的序列时，在单链dna结合蛋白的帮助下使模板dna解链，引物于模板dna开始配对，并在dna聚合酶的作用下复制延伸。该方法主要具备以下优点：(1)仅需1对引物即可完成扩增，不需要复杂的引物设计过程；(2)只需要37℃下恒温反应即可，不需要特殊的热循环设备；(3)反应时间仅需20min；(4)结果易于判断，不像lamp产物的弥散带，rpa扩增产物根据引物设计位点具有特定大小的条带。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种检测食品中副溶血弧菌的rpa特异性引物。

本发明的另一目的在于提供一种检测食品中副溶血弧菌的rpa试剂盒。

本发明的另一目的在于提供上述rpa特异性引物或rpa试剂盒的应用。

本发明的再一目的在于提供一种检测食品中副溶血弧菌的rpa-iac方法。

本发明用生物信息学的方法，根据副溶血弧菌toxr基因设计特异性检测引物，同时人工合成了一段扩增内标的序列，在确保目标序列扩增效率的同时与副溶血弧菌及其它细菌的基因组非同源。本发明将所构建的扩增内标片段添加到rpa反应体系中，能有效检测假阴性的发生。

通过试验证明：本发明的rpa扩增引物特异性好、灵敏度高、检测时间短、不需要特殊的仪器和适用范围广，且本发明检测方法灵敏、准确、简便和快速，对进出口相关货物及产品检验检疫具有指导意义。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种检测食品中副溶血弧菌的rpa特异性引物，其序列如下：

上游引物f14：5′-actcgtatgagaacgtgacattgcgtattt-3′；(seqidno：1)

下游引物r14：5′-ttgaactcagaaggagaaacaagcaggtag-3′。(seqidno：1)

一种检测食品中副溶血弧菌的rpa试剂盒，包括上述rpa特异性引物和扩增内标；

所述的扩增内标的序列为seqidno：8：

actcgtatgagaacgtgacattgcgtatttgaaagttgaacatcatcagcacgaacacggtgtagaaacggcgcagcctgagtatgcaccgacagaattgttaccacagctaccgaaacagaccttacgtacgcgggcaacccaatcggttgaagcggcaagcgtgtttgtgacgtagaattgttcacaaccaccaacagcaacgacttgatcagcgcgataaaaactcaaggtgcaagttgcatcaacgaactgttctctgctcaaagccgagtgcaagaagcggcgtttgattctgaccctacctgcttgtttctccttctgagttcaa。

所述的检测食品中副溶血弧菌的rpa特异性引物在检测副溶血弧菌中的应用。

所述的检测食品中副溶血弧菌的rpa试剂盒在检测副溶血弧菌中的应用。

一种检测食品中副溶血弧菌的rpa-iac方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品dna；

(2)利用上述rpa特异性引物构建合成扩增内标；

(3)将扩增内标克隆到载体mach1-t1，质粒命名为pyhl-1；

(4)以待测样品dna为模板，利用rpa特异性引物和pyhl-1进行rpa反应，得到rpa扩增产物；

(5)向步骤(4)得到的rpa扩增产物中加入苯酚/氯仿(1：1)溶液，混匀、离心，取上清液，进行琼脂糖凝胶电泳检测。

扩增产物电泳目标判定区内既出现426bp特异性条带又出现331bp扩增内标条带时，则判定为含有副溶血弧菌；扩增产物电泳目标判定区内只出现426bp特异性条带而没有出现331bp扩增内标条带时，则判定为含有副溶血弧菌；扩增产物电泳目标判定区内只出现331bp扩增内标条带而没有出现426bp特异性条带时，则判定为无副溶血弧菌；扩增产物电泳目标判定区内既无331bp扩增内标条带也无426bp特异性条带时，则检测结果为假阴性。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

(1)用时短：pcr反应通常耗时2～3个小时。rpa技术仅需要20min即可完成扩增；

(2)常温下即可扩增：只需要37℃下恒温反应即可，不需要特殊的热循环设备；

(3)结果易于判断，不像lamp产物的弥散带，rpa仅需1对引物即可完成扩增，扩增产物根据引物设计位点具有特定大小的条带。

(4)含扩增内标，能指示rpa反应的假阴性。

附图说明

图1是上游引物f14序列对比图。

图2是下游引物r14序列对比图。

图3是iac构建示意图

图4是含扩增内标的rpa检测方法的建立；其中，1：副溶血弧菌；2：阴性对照。

图5是rpa-iac的时间优化图。

图6是rpa-iac的特异性实验；其中，1：副溶血弧菌；2：溶藻弧菌；3：拟态弧菌；4：创伤弧菌；5：哈维氏弧菌；6：阪崎肠杆菌；7：大肠杆菌；8：金黄色葡萄球菌；9：枯草芽孢杆菌；10：植物乳酸杆菌；11：空白对照。

图7是rpa-iac的灵敏度实验；其中，1：副溶血弧菌为3×10⁷cfu/ml；2：副溶血弧菌为3×10⁶cfu/ml；3：副溶血弧菌为3×10⁵cfu/ml；4：副溶血弧菌为3×10⁴cfu/ml；5：副溶血弧菌为3×10³cfu/ml；6：副溶血弧菌为3×10²cfu/ml；7：副溶血弧菌为3×10¹cfu/ml；8：空白对照。

图8是pcr灵敏度实验；其中，1：副溶血弧菌为3×10⁷cfu/ml；2：副溶血弧菌为3×10⁶cfu/ml；3：副溶血弧菌为3×10⁵cfu/ml；4：副溶血弧菌为3×10⁴cfu/ml；5：副溶血弧菌为3×10³cfu/ml；6：副溶血弧菌为3×10²cfu/ml；7：副溶血弧菌为3×10¹cfu/ml；8：空白对照。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1目的基因的选取与rpa引物的设计

利用生物信息学对副溶血弧菌的已知特异基因进行分析，从中选出用于检测的目的基因toxr。通过genbank中公用的blast软件，将toxr基因的序列与其他微生物进行比对，选出特异性较高的序列区段(genebankid：ab029908)。用软件primer5.0在这段序列中，根据rpa设计引物的要求，设计特异性引物，并将引物用bioedit与副溶血弧菌同源度高的物种进行比对，见图1、2，从中选取与其他物种同源度低的引物对。本发明设计副溶血弧菌的rpa引物，产物大小为426bp。具体序列如下：

上游引物f14：5′-actcgtatgagaacgtgacattgcgtattt-3′；(seqidno：1)

下游引物r14：5′-ttgaactcagaaggagaaacaagcaggtag-3′。(seqidno：1)

实施例2扩增内标的设计和构建

经扩增内标引物yxf、yxr，pcr扩增后，反应条件为：94℃5min；94℃30s，59℃60s，72℃30s，30个循环；72℃10min。得到与目的基因片段同源度极低的副溶血弧菌片段cp011406(271bp)。在扩增内标引物yxf、yxr的5′末端连接上目标检测引物f14、r14，得到长引物iacf、iacr。cp011406经长引物iacf、iacrpcr扩增后得到331bp的扩增内标片段，反应条件为：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃60s，30个循环；72℃10min。将所设计的扩增内标序列人工合成，并克隆到载体mach1-t1(北京全式金有限公司，peasy-t1cloningkit，货号：ct101-01)，质粒命名为pyhl-1，内标构建示意图如图3所示。nanodrop测出质粒pyhl-1浓度之后，通过以下公式转换成拷贝数ncopies/μl＝pcr片段的质量(g/μl)/(660g/mol×碱基数)×(6.023×10²³)，并把质粒浓度稀释至8.6×10³copies。

引物序列如下：

扩增内标引物yxf：5′-gaaagttgaacatcatcagcacga-3′；(seqidno：3)

扩增内标引物yxr：5′-ggtcagaatcaaacgccg-3′；(seqidno：4)

长引物iacf：5′-actcgtatgagaacgtgacattgcgtatttgaaagttgaacatcatcagcacga-3′；(seqidno：5)

长引物iacr：5′-ttgaactcagaaggagaaacaagcaggtagggtcagaatcaaacgccg-3′。(seqidno：6)

所述的与目的基因片段同源度极低的副溶血弧菌片段cp011406，其序列为seqidno：7：

gaaagttgaacatcatcagcacgaacacggtgtagaaacggcgcagcctgagtatgcaccgacagaattgttaccacagctaccgaaacagacgttacgtacgcgggcaacccatcggttgaagcggcaagcgtggtttgtgacgtagaatcgttcacaaccaccaacagcaacgacttgatcagcgcgataaaaactcaaggtgcaagttgcatcaacgagctgttctctgctcaaagccgagtgcaagaagcggcgtttgattctgacc。

实施例3、用于检测副溶血弧菌的rpa-iac检测方法的初步构建

1、待测样品dna的提取

取1ml菌液于1.5ml离心管中，12000rpm离心1min，弃去上清，参照试剂盒操作(细菌基因组dna提取试剂盒，天根生物科技有限公司，货号：dp302)提取副溶血弧菌的菌液dna。将获得的dna保存于-20℃备用。

2、rpa-iac扩增

采用twistampbasickit(twistdx，tabas03kit，cambridge，uk)，用于检测副溶血弧菌的rpa-iac的配置方法如下：

向含有冻干酶粉的0.2mltwistamp反应管中加入下列溶液：

将上述混合液涡旋混合均匀，简短离心以除去壁上的水珠。往0.2mltwistamp反应管中加入280mmmgac，混合均匀后，置于37℃的金属浴(上海博通化学科技有限公司)上反应20min，得到rpa-iac扩增产物。

3、rpa-iac扩增产物的电泳检测

rpa反应结束后，向rpa扩增产物中加入50μl苯酚/氯仿(1：1)溶液，充分混匀后12000rpm离心2min，取5μl上清液于2％琼脂糖凝胶电泳，85v，60min，电泳结束后在凝胶成像系统上观察结果。并对rpa扩增产物进行测序。

结果如图4所示：两条泳道均有扩增内标大小为331bp的条带，证明反应没有假阴性的产生。副溶血弧菌的rpa扩增产物含有2个条带，副溶血弧菌的扩增产物条带为426bp，而阴性对照无特异性条带。说明本发明用于副溶血弧菌的rpa-iac试剂盒可以有效指示反应中的假阴性，并检测食品样品中的副溶血弧菌。

4、rpa-iac方法的时间优化

为了优化rpa-iac反应体系的时间，将本实施例步骤2的反应体系的反应时间分别设为10min，20min，30min，40min，50min，60min，80min，100min。每个反应结束后，rpa反应结束后，向rpa扩增产物中加入50μl苯酚/氯仿(1：1)溶液，充分混匀后12000rpm离心2min，取5μl上清液于2％琼脂糖凝胶电泳，85v，60min，电泳结束后在凝胶成像系统上观察结果。通过软件quantityone测出每个条带的密度，每个条带测三次平行，用origin软件做出时间条带密度图。

结果如图5所示：反应在20min的时候开始出现扩增条带。40min，331bp的扩增内标条带和426bp的特异性条带密度增长的速度很快，当反应时间超过40min速度变慢。为了保证反应能够快速有效的进行，所有的rpa-iac反应均设为20min。

实施例4、rpa-iac方法的特异性检测

1、dna的提取

参照实施例3的dna提取步骤，分别提取了，副溶血弧菌(vibrioparahaemolyticus)atcc17802，溶藻弧菌(v.alginolyticus)atcc17749，拟态弧菌(v.mimicus)atcc33653，创伤弧菌(v.vulnificus)atcc27562，哈维氏弧菌(v.harveyi)atcc33846，阪崎肠杆菌(enterobactersakazakii)atcc29544，大肠杆菌(escherichiacoli)atcc25922，金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)atcc25923，枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)atcc9372，植物乳酸杆菌(lactobacillusplanetarium)atcc8014的dna，放于-20℃保存，待用。

2、rpa-iac扩增

参照实施例3的rpa扩增体系的配制方法配置完成后，置于37℃的金属浴上反应20min，得到rpa扩增产物。

3、rpa-iac扩增产物的电泳检测

rpa反应结束后，向rpa扩增产物中加入50μl苯酚/氯仿(1：1)溶液，充分混匀后12000rpm离心2min，取5μl上清液于2％琼脂糖凝胶电泳，85v，60min，电泳结束后在凝胶成像系统上观察结果。

结果如图6所示：从图中可以看出，每个泳道都有扩增内标条带，指示反应无假阴性的产生。只有副溶血弧菌的扩增产物含有1个大小为426bp的特异性条带，溶藻弧菌，拟态弧菌，创伤弧菌，哈维氏弧菌，阪崎肠杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，植物乳酸杆菌的dna均无特异性条带。说明本发明的引物特异性高。

实施例5、rpa-iac方法的灵敏度检测及与普通pcr灵敏度的对比

1、菌落计数及dna的提取

将副溶血弧菌的菌液梯度稀释，分别得到稀释度为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8的副溶血弧菌稀释液。按照国标gb47889.2-2010的方法对副溶血弧菌的菌液进行平板计数，得到副溶血弧菌菌液浓度为：3×10⁷cfu/ml，将不同稀释度的菌液分别取1ml，按照实施例1的提取步骤提取dna。

2、rpa-iac扩增

分别以上述步骤得到的3×10¹～3×10⁷cfu/ml副溶血弧菌的dna为模版，采用f14，r14进行rpa扩增。

参照实施例3的rpa-iac扩增体系的配制方法配置完成后，置于37℃的金属浴上反应20min，得到rpa-iac扩增产物。

3、pcr扩增

分别以上述步骤得到的3×10¹～3×10⁷cfu/ml副溶血弧菌的dna为模版，采用引物tox-f，tox-r进行pcr扩增，产物大小为375bp。

引物序列如下：

tox-f：5′-tcatttgtactgttgaacgccta-3′；(seqidno：9)

tox-r：5′-aatagaaggcaaccagttgttgat-3′；(seqidno：10)

pcr扩增的体系和反应条件参考文献“amultiplexpcrassayforsimultaneousdetectionofescherichiacolio157:h7,bacilluscereus,vibrioparahaemolyticus,salmonellaspp.,listeriamonocytogenes,andstaphylococcusaureusinkoreanready-to-eatfood”。

4、电泳检测

1)rpa反应结束后，向rpa扩增产物中加入50μl苯酚/氯仿(1：1)溶液，充分混匀后12000rpm离心2min，取5μl上清液于2％琼脂糖凝胶电泳，85v，60min，电泳结束后在凝胶成像系统上观察结果。电泳结果如图7所示。

2)pcr反应结束后，取5μl的pcr扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果。pcr电泳结果如图8所示。

从图7和图8中可以看出，本发明的rpa-iac检测引物的灵敏度为3×10³cfu/ml高于pcr检测的灵敏度3×10⁴cfu/ml。

实施例6、实际样品的检测

1、采集水产品样品

无菌采集100个水产品样品，每个样品取25g样品用无菌均质袋均质2min，与225ml3％nacllb培养液混合，置于37±1℃增菌培养8～12h，得到增菌液；

2、传统国标方法的检测

将增菌液按照国标gb4789.7-2013的方法，检测是否有副溶血弧菌。

3、dna的提取

增菌液振荡混匀后取1.5ml增菌液至离心管中，1000r/min离心1min去除食品碎片，取上清10000r/min离心10min，弃上清，用无菌去离子水重悬沉淀，10000r/min离心。参照实施例3的dna提取步骤，分别提取dna，放于-20℃保存，待用。

4、rpa-iac扩增

参照实施例3的rpa扩增体系的配制方法配置完成后，置于37℃的金属浴上反应20min，得到rpa扩增产物。

5、rpa-iac扩增产物的电泳检测

rpa反应结束后，向rpa扩增产物中加入50μl苯酚/氯仿(1：1)溶液，充分混匀后12000rpm离心2min，取5μl上清液于2％琼脂糖凝胶电泳，85v，60min，电泳结束后在凝胶成像系统上观察结果。

检测结果：rpa-iac的方法和国标方法进行对比，其中有10个样品两种方法检测的结果均呈阳性，其余90个样品呈阴性。本发明的rpa-iac方法能够应用于食品中副溶血弧菌的检测。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>暨南大学

<120>检测食品中副溶血弧菌的rpa特异性引物及试剂盒与应用

<130>1

<160>10

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>上游引物f14

<400>1

actcgtatgagaacgtgacattgcgtattt30

<210>2

<211>30

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>下游引物r14

<400>2

ttgaactcagaaggagaaacaagcaggtag30

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>扩增内标引物yxf

<400>3

gaaagttgaacatcatcagcacga24

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>扩增内标引物yxr

<400>4

ggtcagaatcaaacgccg18

<210>5

<211>54

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>长引物iacf

<400>5

actcgtatgagaacgtgacattgcgtatttgaaagttgaacatcatcagcacga54

<210>6

<211>48

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>长引物iacr

<400>6

ttgaactcagaaggagaaacaagcaggtagggtcagaatcaaacgccg48

<210>7

<211>271

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>与目的基因片段同源度极低的副溶血弧菌片段cp011406

<400>7

gaaagttgaacatcatcagcacgaacacggtgtagaaacggcgcagcctgagtatgcacc60

gacagaattgttaccacagctaccgaaacagacgttacgtacgcgggcaacccatcggtt120

gaagcggcaagcgtggtttgtgacgtagaatcgttcacaaccaccaacagcaacgacttg180

atcagcgcgataaaaactcaaggtgcaagttgcatcaacgagctgttctctgctcaaagc240

cgagtgcaagaagcggcgtttgattctgacc271

<210>8

<211>331

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>扩增内标的序列

<400>8

actcgtatgagaacgtgacattgcgtatttgaaagttgaacatcatcagcacgaacacgg60

tgtagaaacggcgcagcctgagtatgcaccgacagaattgttaccacagctaccgaaaca120

gaccttacgtacgcgggcaacccaatcggttgaagcggcaagcgtgtttgtgacgtagaa180

ttgttcacaaccaccaacagcaacgacttgatcagcgcgataaaaactcaaggtgcaagt240

tgcatcaacgaactgttctctgctcaaagccgagtgcaagaagcggcgtttgattctgac300

cctacctgcttgtttctccttctgagttcaa331

<210>9

<211>23

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>tox-f

<400>9

tcatttgtactgttgaacgccta23

<210>10

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>tox-r

<400>10

aatagaaggcaaccagttgttgat24