一种含非变性II型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法与流程

本发明涉及到一种软骨提取物的制备方法，特别涉及一种含非变性ⅱ型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法。

背景技术：

胶原蛋白是皮肤、骨骼和关节等组织的重要的组成部分，是多细胞动物的细胞外基质的主要成分。目前从哺乳动物中已经发行27种不同类型的胶原蛋白，其中由三条相同的α链组成的ⅱ型胶原蛋白主要存在于软骨组织中和眼玻璃体中，因此ⅱ型胶原蛋白被视为软骨的一种结构功能性元素。

目前市面在销售胶原蛋白多为经过水解后的胶原蛋白，其主要成分是多肽，分子量分布在200-20000da的范围内。虽然这些多肽也具有一定的保持皮肤水分、增强骨密度和增强免疫力等作用，但并无预防和治疗因自身免疫机能变化引起的风湿性关节炎的功效，也不具有预防和治疗退行性关节炎的作用。

非变性ⅱ型胶原蛋白是具有完整三螺旋结构的蛋白，当人体摄入非变性ⅱ型胶原蛋白后，体内免疫细胞尤其是淋巴细胞的免疫耐受会发生改善，免疫耐受的原因是由于摄入的ⅱ型胶原蛋白中含有抗原决定簇。抗原决定簇是抗原的一个特殊结构单元，能够被抗体识别和绑定，当抗体绑定到生物大分子时，抗体不能识别整个有机体或物质，但是能识别标位并进行绑定。活性抗原决定基被绑定在淋巴集结上作为一个组织存于小肠，去刺激免疫细胞、信息传递分子如细胞因子和参与增殖分化趋化因子并抑制细胞分泌去抑制炎症。

目前国内外也有一些非变性ⅱ型胶原蛋白的提取工艺，但或是未对其原料进行除杂等预处理、或未对杂蛋白进行处理、或是提取率低、或是保存条件受限制。

技术实现要素：

本发明目的之一是至少克服上述缺陷中的一种，提供一种新的含非变性ⅱ型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法。

因此，本发明提供了一种含非变性ii型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，其特征在于，该方法依次包括以下步骤：脱脂、消毒、匀浆、酶解、过滤、干燥；其中，在所述酶解步骤中：将在匀浆步骤中获得的浆状物的ph调节为2.5～8.5，加入软骨重量的0.001％-2％的酶，加入软骨重量的1/20～1/500的木瓜和/或菠萝低温榨汁后过滤获得的清液，酶解12～48h，酶解温度为25-50℃。

本发明提供的制备方法获得的软骨提取物纯度高、提取率高、易保存、易规模化生产，且富含非变性ⅱ型胶原蛋白和硫酸软骨素。

附图说明书

图1为实施例1获得的非变性ii型胶原蛋白的透射电镜图片。

图2表示实施例1和2获得的ii型胶原蛋白的western印迹的结果，其中左侧泳道是实施例2获得的ii型胶原蛋白，右侧泳道是实施例1获得的ii型胶原蛋白。

具体实施方式

本发明提供了一种含非变性ii型胶原蛋白的软骨提取物的制备方法，其特征在于，该方法依次包括以下步骤：脱脂、消毒、匀浆、酶解、过滤、干燥；其中，在所述酶解步骤中：将在匀浆步骤中获得的浆状物的ph调节为2.5～8.5，加入软骨重量的0.001％-2％的酶，加入软骨重量的1/20～1/500的木瓜和/或菠萝低温榨汁后过滤获得的清液，酶解12～48h，酶解温度为25-50℃。

本申请的发明人意外发现，在上述酶解条件下进行酶解，能够获得较高浓度的非变性ⅱ型胶原蛋白。

在酶解步骤，所述酶可以采用本领域所用的任何酶，但是在一种优选的实施方式中，所述酶优选为胃蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、碱性蛋白酶、金属蛋白酶中的一种或几种；最优选为胃蛋白酶。

在一种优选的实施方式中，所酶的用量为软骨重量的0.5-2％，木瓜和/或菠萝低温榨汁后过滤获得的清液的用量为软骨重量的1/20-1/50，酶解时间为12～20h，酶解温度25～40℃。

在另一种优选的实施方式中，加入的清液是木瓜和菠萝低温榨汁后过滤获得的混合清液，其中，木瓜和菠萝的重量比为1-10：1，优选为3-6：1。在该优选条件下，获得的软骨提取物中非变性ⅱ型胶原蛋白浓度更高。

在一种优选的实施方式中，在干燥步骤后进行粉碎，其中，

脱脂：用一定浓度的脱脂剂浸泡软骨丁状物0.2h～6h，然后用水清洗至清洗后的水的ph到5.5～8.5；

消毒：用一定浓度消毒液浸泡脱脂后的软骨丁状物1～3次，然后用水清洗至软骨丁状物无味；

匀浆：将消毒后的软骨丁状物进行匀浆处理，匀浆后软骨的粒度为50～300目；

过滤：利用5～100目筛网进行过滤，去除溶液中大颗粒物质，收集过滤液；

干燥：将过滤收集的过滤液进行低温干燥，干燥温度不高于30℃，干燥后获得软骨提取物；

粉碎：干燥后的软骨提取物在4℃以下进行超微粉碎，粉碎物的目数控制在100目-500目。

在另一种优选的实施方式中，所述脱脂剂是naoh溶液、koh溶液、na2co3溶液、nacl溶液、kcl溶液中的一种或几种。

在另一种优选的实施方式中，所述脱脂剂的浓度为0.01～3重量％，所述脱脂剂与软骨的重量比为1～10:1

在另一种优选的实施方式中，消毒步骤中所使用的消毒液是次氯酸钠和/或双氧水，消毒过程中消毒液的浓度控制在100ppm～2000ppm，消毒时间控制在0.2h～12h。

在另一种优选的实施方式中，匀浆步骤在37℃以下进行。

在另一种优选的实施方式中，低温干燥方法是滚筒烘干法、低温长网烘干法、冷冻干燥法。

在另一种优选的实施方式中，在有预冷的步骤时，预冷温度不高于-10℃，干燥后软骨提取物的含水量控制在6％以下。

在另一种优选的实施方式中，所述制备方法在脱脂前进行预处理，以获得更加纯净的胶原蛋白。该预处理可以按照现有技术进行，优选地该预处理包括：去除软骨原料上存在的脂肪、筋膜、残留的肉或红骨等非软骨物质，然后将其切成2mm～20mm的丁状物。

在另一种优选的实施方式中，使用的原料软骨可以是鸡软骨、鸭软骨、牛软骨或其混合物。

实施例1

(1)预处理：选取鸡胸软骨3.5kg，解冻后除去软骨上的鸡肉、筋膜和红骨，然后利用切丁机切成3*3mm的丁状。

(2)脱脂：用终0.01％浓度的na2co3和2％nacl的混合脱脂剂溶液7kg，常温脱脂4h，脱脂排水后用纯化水清洗至ph6.5。

(3)消毒：加浓度400ppm次氯酸钠溶液开始消毒，消毒2次，每次12h，消毒结束后用纯化水清洗至无消毒也气味无余氯检出，ph控制在6.5-7.0。

(4)匀浆：将步骤(3)处理的软骨丁状物加入6kg纯化水，用胶体磨将软骨磨成100-200目。

(5)酶解：将步骤(4)获得的浆液ph调节至2.5，加入70克胃蛋白酶，加入60低温榨汁后过滤获得的新鲜木瓜清液和10g低温榨汁后过滤获得的新鲜菠萝清液，在温度25℃进行酶解20h。

(6)过滤：利用5目筛网进行过滤，去除溶液中大颗粒物质，收集过滤液。

(7)干燥：将步骤(6)收集的过滤液进行真空冷冻干燥，预冷温度不高于-40℃，干燥过程终温度控制在30℃，冻干后获得软骨提取物。

(8)粉碎：冷冻干燥后的软骨提取物在4℃以下进行超微粉碎，粉碎物的目数控制在200目，获得冻干品。

采用gb5009.5的方法检测胶原蛋白含量为55.2％，采用gb/t20365检测硫酸软骨素含量为7.9％，采用elisa方法检测(试剂盒供应商为上海江莱生物科技有限公司)非变性ⅱ型胶原蛋白含量为11.3％。采用透射电镜检测非变性ⅱ型胶原蛋白的形态，结果如图1所示。采用western印迹检测ii型胶原蛋白，结果如图2右侧泳道所示。

实施例2

(1)预处理：选取新鲜鸭胸软骨20kg，解冻后除去软骨上的鸭肉、筋膜和红骨，然后利用切丁机切成约2mm*2mm的丁状.

(2)脱脂：用终浓度为0.01％的naoh和0.9％的kcl溶液200kg，常温脱脂6h，然后用纯化水清洗ph6.0。

(3)消毒：加浓度500ppm次氯酸钠溶液(含100ppm的双氧水)开始消毒，消毒3次，每次6h，消毒结束后用纯化水清洗至无消毒也气味无余氯检出，ph控制在6.5-7.0。

(4)匀浆：向步骤(3)处理的软骨丁状物中加入40kg的纯化水，用胶体磨将软骨磨成约100-200目。

(5)酶解：将步骤(4)获得的浆液ph调节至8.5，加碱性蛋白酶0.2克，加入1kg低温榨汁后过滤获得的新鲜菠萝清液，在温度50℃，进行酶解12h。

(6)过滤：利用100目筛网进行过滤，去除溶液中大颗粒物质，收集过滤液。

(7)干燥：将步骤(6)收集的过滤液冷却成型后通过低温长网烘干法干燥，预冷温度-10℃，干燥过程终温度控制在30℃，干燥后获得软骨提取物。

(8)粉碎：冷冻干燥后的软骨提取物在4℃以下进行超微粉碎，粉碎物的目数控制在180目左右，得到一定干重的冻干品。

采用gb5009.5的方法检测胶原蛋白含量为45.6％，采用gb/t20365检测硫酸软骨素含量为4.8％，采用elisa方法检测(试剂盒供应商为上海江莱生物科技有限公司)非变性ⅱ型胶原蛋白含量为3.9％。采用western印迹检测ii型胶原蛋白，结果如图2左侧泳道所示。

实施例3

(1)预处理：选取鸡胸软骨20kg，解冻后除去软骨上的鸡肉、筋膜和红骨，然后利用切丁机切成3*3mm的丁状。

(2)脱脂：用终0.2％naoh和0.6％nacl的溶液100kg，常温脱脂0.2h，然后用纯化水清洗ph6.0。

(3)消毒：加浓度2000ppm次氯酸钠溶液开始消毒，消毒1次，每次0.2h，消毒结束后用纯化水清洗至无消毒也气味无余氯检出，ph控制在6.5-7.0。

(4)匀浆：向步骤(3)处理的软骨丁状物中加入50kg的纯化水，用胶体磨将软骨磨成100-200目。

(5)酶解：将步骤(4)获得的浆液ph调节至7.0，加20g枯草杆菌蛋白酶，加入200g低温榨汁后过滤获得的新鲜木瓜清液和20g低温榨汁后过滤获得的新鲜菠萝清液，在温度40℃进行酶解24h。

(6)过滤：利用50目筛网进行过滤，去除溶液中大颗粒物质，收集过滤液。

(7)干燥：将步骤(6)收集的过滤液进行真空冷冻干燥，预冷温度不高于-30℃，干燥过程终温度控制在20℃，冻干后获得软骨提取物。

(8)粉碎：冷冻干燥后的软骨提取物在4℃以下进行超微粉碎，粉碎物的目数控制在200目，获得冻干品。

采用gb5009.5的方法检测胶原蛋白含量为53.6％，采用gb/t20365检测硫酸软骨素含量为9.2％，采用elisa方法检测(试剂盒供应商为上海江莱生物科技有限公司)非变性ⅱ型胶原蛋白含量为10.3％。

实施例4

(1)预处理：选取鸡胸软骨70kg，解冻后除去软骨上的鸡肉、筋膜和红骨，然后利用切丁机切成3*3mm的丁状。

(2)脱脂：用终0.15％koh和0.3％kcl的溶液140kg，常温脱脂2h，然后用纯化水清洗ph6.0。

(3)消毒：加浓度100ppm次氯酸钠溶液(含1000ppm双氧水)开始消毒，消毒2次，每次0.5h，消毒结束后用纯化水清洗至无消毒也气味无余氯检出，ph控制在6.5-7.0。

(4)匀浆：向步骤(3)处理的软骨丁状物中加入140kg的纯化水，用胶体磨将软骨磨成100-200目。

(5)酶解：将步骤(4)获得的浆液ph调节至7.5，加21g金属蛋白酶，加入700g低温榨汁后过滤获得的新鲜菠萝清液在温度40℃进行酶16h。

(6)过滤：利用50目筛网进行过滤，去除溶液中大颗粒物质，收集过滤液。

(7)干燥：将步骤(6)收解集的过滤液进行真空冷冻干燥，预冷温度不高于-30℃，干燥过程终温度控制在20℃，冻干后获得软骨提取物。

(8)粉碎：冷冻干燥后的软骨提取物在4℃以下进行超微粉碎，粉碎物的目数控制在200目，获得冻干品。

采用gb5009.5的方法检测胶原蛋白含量为48.3％，采用gb/t20365检测硫酸软骨素含量为6.8％，采用elisa方法检测(试剂盒供应商为上海江莱生物科技有限公司)非变性ⅱ型胶原蛋白含量为8.3％。

实施例5

1)预处理：选取鸡胸软骨30kg，解冻后除去软骨上的鸡肉、筋膜和红骨，然后利用切丁机切成5*5mm的丁状。

(2)脱脂：用终0.05％naoh和0.1％kcl的溶液90kg，常温脱脂1h，然后用纯化水清洗ph6.0。

(3)消毒：加浓度300ppm次氯酸钠溶液60kg开始消毒，消毒2次，每次8h，消毒结束后用纯化水清洗至无消毒也气味无余氯检出，ph控制在6.5-7.0。

(4)匀浆：向步骤(3)处理的软骨丁状物中加入70kg的纯化水，用胶体磨将软骨磨成100-200目。

(5)酶解：将步骤(4)获得的浆液ph调节至3.0，加150g胃蛋白酶，加入135g低温榨汁后过滤获得的新鲜木瓜清液和45g低温榨汁后过滤获得的新鲜菠萝清液，在温度25℃进行酶16h。

(6)过滤：利用50目筛网进行过滤，去除溶液中大颗粒物质，收集过滤液。

(7)干燥：将步骤(6)收集的过滤液进行真空冷冻干燥，预冷温度不高于-30℃，干燥过程终温度控制在25℃，冻干后获得软骨提取物。

(8)粉碎：冷冻干燥后的软骨提取物在4℃以下进行超微粉碎，粉碎物的目数控制在200目，获得冻干品。

采用gb5009.5的方法检测胶原蛋白含量为57.3％，采用gb/t20365检测硫酸软骨素含量为12.3％，采用elisa方法检测(试剂盒供应商为上海江莱生物科技有限公司)非变性ⅱ型胶原蛋白含量为12.6％。

实施例6

1)预处理：选取牛软骨5kg，解冻后除去软骨上的牛肉、筋膜和红骨，然后利用切丁机切成5*5mm的丁状。

(2)脱脂：用终0.3％naoh和1％nacl的溶液20kg，常温脱脂3h，然后用纯化水清洗ph6.0。

(3)消毒：加浓度500ppm次氯酸钠溶液10kg开始消毒，消毒3次，每次1.5h，消毒结束后用纯化水清洗至无消毒也气味无余氯检出，ph控制在6.5-7.0。

(4)匀浆：向步骤(3)处理的软骨丁状物中加入10kg的纯化水，用胶体磨将软骨磨成100-200目。

(5)酶解：将步骤(4)获得的浆液ph调节至3.0，加75g胃蛋白酶，加入25g低温榨汁后过滤获得的新鲜木瓜清液和25g低温榨汁后过滤获得的新鲜菠萝清液，在温度25℃进行酶20h。

(6)过滤：利用50目筛网进行过滤，去除溶液中大颗粒物质，收集过滤液。

(7)干燥：将步骤(6)收解集的过滤液进行真空冷冻干燥，预冷温度不高于-30℃，干燥过程终温度控制在30℃，冻干后获得软骨提取物。

(8)粉碎：冷冻干燥后的软骨提取物在4℃以下进行超微粉碎，粉碎物的目数控制在200目，获得冻干品。

采用gb5009.5的方法检测胶原蛋白含量为54.8％，采用gb/t20365检测硫酸软骨素含量为10.1％，采用elisa方法检测(试剂盒供应商为上海江莱生物科技有限公司)非变性ⅱ型胶原蛋白含量为10.3％。