本发明涉及食品加工技术领域，具体地说，涉及一种薯类活性肽及其制备方法。
背景技术：
我国是薯类种植和生产大国，年产量居世界首位。薯类是列于稻谷、玉米、小麦之后的第四大主要粮食作物。在我国工业上，薯类主要被用于生产淀粉，在此过程中会产生大量薯浆。以甘薯为例，据不完全统计，我国每年约有900万吨甘薯用于加工淀粉，由此可产生薯浆约2000万吨，其中约含甘薯蛋白12万吨，按我国人均日消耗75克蛋白计，能满足430多万人对蛋白质的年需求，然而薯浆往往被当作废液直接排放，造成了严重环境污染和巨大资源浪费。与大多数其它植物蛋白相比，薯类蛋白必需氨基酸含量较高，具有可接受的营养价值，是植物源活性肽的潜在来源。
高静压处理技术在过去二十年经历了巨大的增长，在食品工业中的产业化应用成为现实，如食品保鲜和新型食品、质构和风味的创造等。高静压技术作用于蛋白溶液时可以使蛋白链变得更加伸展，进而暴露更多的酶切位点而有利于酶解反应的进行，还可能产生一些新的具有特殊生理活性的功能性肽。食物源生物活性肽具有分子量低、活性高、易吸收等特点，被认为是安全和健康的。更重要的是，食物源生物活性肽还呈现良好的营养和功能特性。
因此，开发一种薯类活性肽并建立其制备方法，对于促进我国薯类加工业的可持续发展，保障我国粮食安全和改善居民膳食营养具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种薯类活性肽及其制备方法。
为了实现本发明目的，本发明的一种薯类活性肽及其制备方法，包括如下步骤：
(1)采用超声波协同高压均质方法对薯类蛋白进行处理；
(2)高静压下酶解薯类蛋白，再经灭酶、离心、除盐、干燥后，即得薯类活性肽。
本发明所述的薯类活性肽的制备方法中，所述薯类为马铃薯、甘薯、木薯，优选为马铃薯和甘薯。所述薯类蛋白的制备方法如下：以薯类为原料，清洗、去皮后切块，按料液比1:1加入0.2％-0.5％柠檬酸水溶液(含vc浓度为0.01％-0.1％)后打浆，过滤除渣、离心去除淀粉、超滤浓缩后冻干，即得薯类蛋白。
本发明所述的薯类活性肽的制备方法中，超声波功率为50-400w，优选为200w；所述超声波时间为1-10min，优选5min。
本发明所述的活性肽的制备方法中，步骤(1)高压均质压力为10-150mpa，优选为120mpa；所述高压均质时间为0.5-10min，优选1min。
步骤(1)中，对薯类蛋白进行均质处理前，将薯类蛋白按g：ml＝1：20-100的比例溶解于ph值7-9的tris-hcl缓冲液中。
本发明所述的活性肽的制备方法的步骤(2)中，酶解采用碱性蛋白酶alcalase，酶解时将碱性蛋白酶alcalase与薯类蛋白按g：ml＝1：10-50的比例混合。在50-60℃酶解30-240min，优选酶解温度为57℃。
本发明所述的活性肽的制备方法步骤(2)中，高静压加压压力为100-600mpa，优选300mpa；高静压加压时间为30-240min，优选120min。
作为本发明优选的实施方式之一，本发明所述的活性肽的制备方法，包括如下步骤：
将薯类蛋白按g：ml＝1：20-100的比例溶解于ph值7-9的tris-hcl缓冲液中，采用50-400w超声波处理薯类蛋白1-10min，然后于10-150mpa下高压均质处理薯类蛋白0.5-10min，将碱性蛋白酶alcalase与薯类蛋白按g：ml＝1：10-50的比例混合，封装后置后100-600mpa高静压下，于50-60℃酶解30-240min，取出后于90-100℃灭酶10min，于7000-10000g下离心60min，除盐、干燥后，即得薯类活性肽。
本发明还提供一种由上述方法制备的薯类活性肽。
本领域技术人员应当理解，本发明上述方法制得的薯类活性肽在制备食品或化妆品中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明具有以下优点：
1)本发明所制备的活性肽抗氧化活性高、分子量低，易被人体吸收利用。
2)本发明提供的活性肽必需氨基酸含量丰富，且具有保健功效；
3)本发明提供的活性肽，克服现有蛋白肽活性低、稳定性差的缺陷，可广泛应用于食品领域中，有利于改善居民膳食营养与健康。
4)本发明提供的活性肽的制备方法操作简单，易于工业化生产。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100ml溶液中含有溶质的克数。
实施例1薯类活性肽的制备(1)
以甘薯为原料，清洗、去皮后切块，按料液比1:1加入0.2％柠檬酸水溶液(含vc浓度为0.1％)后打浆，过滤除渣、离心去除淀粉、超滤浓缩后冻干得到甘薯蛋白。将甘薯蛋白按g：ml＝1：30的比例溶解于ph值8.3的tris-hcl缓冲液中，采用200w超声波处理甘薯蛋白5min，然后于120mpa下高压均质处理甘薯蛋白1min，将碱性蛋白酶alcalase与甘薯蛋白按g：ml＝1：25的比例混合，封装后置后300mpa高静压下，于57℃酶解120min，取出后于100℃灭酶10min，于10000g下离心60min，除盐、干燥后，即得甘薯肽。
实施例2薯类活性肽的制备(2)
以甘薯为原料，清洗、去皮后切块，按料液比1:1加入0.3％柠檬酸水溶液(含vc浓度为0.05％)后打浆，过滤除渣、离心去除淀粉、超滤浓缩后冻干得到甘薯蛋白。将甘薯蛋白按g：ml＝1：25的比例溶解于ph值8.0的tris-hcl缓冲液中，采用400w超声波处理甘薯蛋白3min，然后于100mpa下高压均质处理甘薯蛋白2min，将碱性蛋白酶alcalase与甘薯蛋白按g：ml＝1：25的比例混合，封装后置后300mpa高静压下，于57℃酶解120min，取出后于100℃灭酶10min，于10000g下离心60min，除盐、干燥后，即得甘薯肽。
实施例3薯类活性肽的制备(3)
以甘薯为原料，清洗、去皮后切块，按料液比1:1加入0.25％柠檬酸水溶液(含vc浓度为0.02％)后打浆，过滤除渣、离心去除淀粉、超滤浓缩后冻干得到甘薯蛋白。将甘薯蛋白按g：ml＝1：35的比例溶解于ph值8.2的tris-hcl缓冲液中，采用100w超声波处理甘薯蛋白8min，然后于150mpa下高压均质处理甘薯蛋白0.5min，将碱性蛋白酶alcalase与甘薯蛋白按g：ml＝1：25的比例混合，封装后置后300mpa高静压下，于57℃酶解120min，取出后于100℃灭酶10min，于10000g下离心60min，除盐、干燥后，即得甘薯肽。
实施例4薯类活性肽的制备(4)
以甘薯为原料，清洗、去皮后切块，按料液比1:1加入0.45％柠檬酸水溶液(含vc浓度为0.05％)后打浆，过滤除渣、离心去除淀粉、超滤浓缩后冻干得到甘薯蛋白。将甘薯蛋白按g：ml＝1：30的比例溶解于ph值8.3的tris-hcl缓冲液中，采用200w超声波处理甘薯蛋白5min，然后于120mpa下高压均质处理甘薯蛋白1min，将碱性蛋白酶alcalase与甘薯蛋白按g：ml＝1：30的比例混合，封装后置后200mpa高静压下，于56℃酶解150min，取出后于90℃灭酶10min，于10000g下离心60min，除盐、干燥后，即得甘薯肽。
实施例5薯类活性肽的制备(5)
以甘薯为原料，清洗、去皮后切块，按料液比1:1加入0.3％柠檬酸水溶液(含vc浓度为0.03％)后打浆，过滤除渣、离心去除淀粉、超滤浓缩后冻干得到甘薯蛋白。将甘薯蛋白按g：ml＝1：30的比例溶解于ph值8.3的tris-hcl缓冲液中，采用200w超声波处理甘薯蛋白5min，然后于120mpa下高压均质处理甘薯蛋白1min，将碱性蛋白酶alcalase与甘薯蛋白按g：ml＝1：35的比例混合，封装后置后100mpa高静压下，于55℃酶解240min，取出后于90℃灭酶10min，于9000g下离心60min，除盐、干燥后，即得甘薯肽。
实施例6薯类活性肽的制备(6)
以甘薯为原料，清洗、去皮后切块，按料液比1:1加入0.25％柠檬酸水溶液(含vc浓度为0.01％)后打浆，过滤除渣、离心去除淀粉、超滤浓缩后冻干得到甘薯蛋白。将甘薯蛋白按g：ml＝1：30的比例溶解于ph值8.3的tris-hcl缓冲液中，采用200w超声波处理甘薯蛋白5min，然后于10mpa下高压均质处理甘薯蛋白1min，将碱性蛋白酶alcalase与甘薯蛋白按g：ml＝1：40的比例混合，封装后置后100mpa高静压下，于57℃酶解240min，取出后于90℃灭酶10min，于8000g下离心60min，除盐、干燥后，即得甘薯肽。
对比例1
以甘薯为原料，清洗、去皮后切块，按料液比1:1加入0.2％柠檬酸水溶液(含vc浓度为0.1％)后打浆，过滤除渣、离心去除淀粉、超滤浓缩后冻干得到甘薯蛋白。将甘薯蛋白按g：ml＝1：30的比例溶解于ph值8.3的tris-hcl缓冲液中，将碱性蛋白酶alcalase与甘薯蛋白按g：ml＝1：25的比例混合，封装后置后300mpa高静压下，于57℃酶解120min，取出后于100℃灭酶10min，于10000g下离心60min，除盐、干燥后，即得甘薯肽。
对比例2
以甘薯为原料，清洗、去皮后切块，按料液比1:1加入0.2％柠檬酸水溶液(含vc浓度为0.1％)后打浆，过滤除渣、离心去除淀粉、超滤浓缩后冻干得到甘薯蛋白。将甘薯蛋白按g：ml＝1：30的比例溶解于ph值8.3的tris-hcl缓冲液中，采用200w超声波处理甘薯蛋白5min，将碱性蛋白酶alcalase与甘薯蛋白按g：ml＝1：30的比例混合，于56℃酶解150min，取出后于90℃灭酶10min，于10000g下离心60min，除盐、干燥后，即得甘薯肽。
对比例3
以甘薯为原料，清洗、去皮后切块，按料液比1:1加入0.2％柠檬酸水溶液(含vc浓度为0.1％)后打浆，过滤除渣、离心去除淀粉、超滤浓缩后冻干得到甘薯蛋白。将甘薯蛋白按g：ml＝1：30的比例溶解于ph值8.3的tris-hcl缓冲液中，于120mpa下高压均质处理甘薯蛋白1min，将碱性蛋白酶alcalase与甘薯蛋白按g：ml＝1：35的比例混合，于55℃酶解240min，取出后于90℃灭酶10min，于9000g下离心60min，除盐、干燥后，即得甘薯肽。
对比例4
以甘薯为原料，清洗、去皮后切块，按料液比1:1加入0.2％柠檬酸水溶液(含vc浓度为0.1％)后打浆，过滤除渣、离心去除淀粉、超滤浓缩后冻干得到甘薯蛋白。将甘薯蛋白按g：ml＝1：30的比例溶解于ph值7.5的tris-hcl缓冲液中，将碱性蛋白酶alcalase与甘薯蛋白按g：ml＝1：25的比例混合，于50℃酶解60min，取出后于100℃灭酶10min，于10000g下离心60min，除盐、干燥后，即得甘薯肽。
实验例1
对实施例及对比例中活性肽的水解度、羟基自由基清除活性、fe2+螯合力、总抗氧化能力、氨基酸组成等进行分析：
(1)水解度
采用邻苯二甲醛法进行。水解度的计算公式如下：
h＝(serinenh2-β)/αmmol/g蛋白
其中，h相当于水解肽键的氨基基团的数量，表示为丝氨酸的氨基毫摩数。α和β分别为1.00和0.40。
水解度(％)＝h/htot×100
其中，htot为单位蛋白当量的肽键总数。对于大多数蛋白质分子来说，htot约为8g/kg蛋白。结果见表1。
(2)羟基自由基清除活性
采用α-脱氧核糖氧化法。将活性肽溶于蒸馏水中，配成浓度为1mg/ml的溶液。将0.1ml10mmfeso4·7h2o、0.9ml0.1m的磷酸缓冲液(ph7.4)、0.5ml10mmα-脱氧核糖、0.1ml10mmedta和0.2ml样品溶液在试管中充分混匀。添加0.2ml10mmh2o2后启动反应，置于37℃浴中反应1h。反应结束，添加1.0ml冰温的2.8％tca终止反应，随后加入1ml1％tba(50mmnaoh)混匀，沸水浴20min显色，冷却后于532nm测吸光值。·oh清除率(％)计算如下：
羟基自由基清除率(％)＝【(a0－a1)/a0】×100
其中：a0为空白对照的吸光值；a1为样品反应后的吸光值。结果见表1。
(3)fe2+螯合力
将活性肽溶于蒸馏水中，配成浓度为1mg/ml的溶液。反应混合物包括45μl2mmfecl2、450μl样品和1815μl蒸馏水。剧烈震荡混合物，然后于室温下放置30min。30min后，加入90μl5mm4,4'-[3-(2-吡啶基)-1,2,4-三嗪-5,6-二基]二苯磺酸一钠盐(ferrozine)混匀。在562nm下测定fe2+-ferrozine复合物的吸光值。用蒸馏水作空白。fe2+螯合能力(％)计算如下：
fe2+螯合力(％)＝【(a0－a1)/a0】×100
其中：a0为空白对照的吸光值；a1为样品反应后的吸光值。结果见表1。
(4)总抗氧化能力
采用氧自由基吸收能力法(orac)测定活性肽对过氧自由基的清除活性。所有溶液均用75mmol/l，ph＝7.4磷酸盐缓冲溶液进行配置和稀释。96微孔板中加入20μl待测样品(浓度为1mg/ml)、20μl磷酸盐缓冲溶液、20μl63nmol/l的荧光素钠溶液，37℃保温10min后，立即加入140μl18.28mmol/l的aaph溶液，置于多功能酶标仪中，在激发波长485nm和发射波长535nm下测定荧光值，时间间隔设为2.0min，测定次数为60次，测定温度为37℃。同时测定各反应溶液在无aaph作用时的荧光值(即用等量的磷酸盐缓冲溶液代替aaph溶液)以水溶性维生素e作为标准品，样品溶液的氧自由基吸收能力表示为μg水溶性维生素e当量(troloxequivalent,te)/ml样品溶液。结果见表1。
(5)氨基酸组成分析
利用氨基酸自动分析仪测定活性肽的氨基酸组成，具体为：称取75mg甘薯肽，用10ml6mhcl于110℃下酶解24h。水解完毕后，将混合液倒入50ml容量瓶中，用超纯水定容，取1ml水解液氮吹至干。将干燥样品溶解于ph值为2.2的柠檬酸钠缓冲液中，调节氨基酸浓度为50-250nmol/ml，然后上样至日立l-8800氨基酸分析仪进行氨基酸测定。结果见表1。
表1活性肽的抗氧化活性及氨基酸组成分析
从表1可以看出，所有实施例和对比例制备的薯类活性肽均具有一定的抗氧化活性，必需氨基酸占总必需氨基酸比例均大于40％，必需氨基酸与非必需氨基酸比值均高于60％，明显高于fao/who推荐的参考模式。
与对比例1相比，实施例1、2和3活性肽的水解度、羟基自由基清除活性、fe2+螯合力和总抗氧化能力显著提高；实施例4和实施例5活性肽的水解度、羟基自由基清除活性、fe2+螯合力和总抗氧化能力显著高于对比例2与对比例3活性肽。
与实施例5活性肽相比，实施例6活性肽的水解度、羟基自由基清除活性、fe2+螯合力和总抗氧化能力略低；而对比例4活性肽的水解度、羟基自由基清除活性、fe2+螯合力和总抗氧化能力在上述所有活性肽中最低。
实验例2
对各实施例及对比例中活性肽的分子量分布进行分析：
取一定量活性肽溶于含0.5m氯化钠的50mm磷酸盐溶液(ph7.0)，经过0.22μm膜过滤后，采用配置有superdexpeptide10/300gl柱子(10×300mm)的lc-20ahplc(日本岛津公司，京都，日本)进行分子量分布测定。洗脱液含0.5m氯化钠的50mm磷酸盐溶液(ph7.0)，流速为0.5ml/min。在215nm处测定吸光值。分子量标准曲线采用细胞色素c(12384da)、抑肽酶(6512da)、维生素b12(1855da)和甘氨酸(75da)进行。结果见表2。
表2活性肽的分子量分布(％)
从表2可以看出，与对比例1相比，实施例1、2和3活性肽中<3kda肽组分的含量显著提高；实施例4和实施例5活性肽中<3kda肽组分的含量显著高于对比例2与对比例3活性肽。与实施例5活性肽相比，实施例6活性肽中<3kda肽组分的含量略低；而对比例4活性肽中<3kda肽组分的含量在上述所有活性肽中最低。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。