一种具有体内抗氧化和神经保护功能的白蛤多肽及其制备方法与应用与流程

本发明属于海洋生物技术领域，具体涉及一种白蛤多肽及其制备方法与应用。

背景技术：

随着社会人口老龄化加剧，与衰老相关的神经变性病在世界范围内发病也呈逐年上升趋势，患病人数逐年增多，其临床表现主要分为两种：运动功能障碍和记忆与认知功能障碍。组织病理学研究表明神经元缓慢渐进性凋亡，大多在神经细胞内存在蛋白质的异常聚集，形成包涵体，提示它们可能具有相类似的发病机制。因此，积极寻找具有缓解细胞凋亡老化、抑制神经毒性蛋白异常聚集作用的生物活性物质，将为衰老相关神经变性疾病的防治提供一定的物质基础。

我国海洋面积辽阔，海产品类资源丰富。其中，鱼贝类等水产食品不仅是人类蛋白质的重要来源，而且也显现出多种保健和疾病防治功能，对促进人类健康有很重要作用。贝类性平、味甘、咸，具有滋阴补肾、调中的功效。《本草从新》记载着贝肉下气调中、利五脏、疗消渴的功效。其中，白蛤，学名为四角蛤蜊(mactraveneriformis,reeue)，俗称白蚬子、泥蚬子、布鸽头，属瓣鳃纲、真瓣鳃目、蛤蜊科。白蛤是我国沿海常见的底栖经济贝类，其肉细味美、营养丰富。中医认为其肉性味咸寒，有滋阴、利水、化痰、软坚功能，可用于治疗水肿、痰积、癖块、癖瘤、崩漏、痔疮等。每百克白蛤的鲜肉中含蛋白质10.8克，其中包含了9种人体必需氨基酸，且比例适中，属完全蛋白质。然而，国内外有关白蛤的研究大多集中在对其生长环境、养殖繁育、食品加工、种属鉴定上，也有部分对其小分子提取物和多糖类物质在降血糖、抗凝血等方面的研究，而有关白蛤多肽在生物活性方面的研究报道则较少，具有广阔的开发前景。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有抗氧化和神经保护功能的白蛤多肽及其制备方法与应用。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案。

一种白蛤多肽的制备方法，取白蛤软体加水匀浆后加入木瓜蛋白酶水解，超滤后收集截留分子量小于10kda的组分。

其中，所述白蛤软体为新鲜的白蛤去壳后和内脏后用水清洗3～4次得到。

在一些实施方案中，所述匀浆时水的加入量为白蛤软体的体积的2倍。

在一些实施方案中，本发明所述白蛤多肽的制备方法中，所述木瓜蛋白酶水解前还包括将匀浆后得到的肉糜干燥后加水重溶的步骤。

其中，所述肉糜干燥后的重溶时水的加入量为干燥的肉糜的体积的20倍。

本领域技术人员还可以按照公知的干燥的方法对白蛤软体匀浆后得到的肉糜进行干燥。优选采用冷冻干燥。

在一些实施方案中，所述木瓜蛋白酶水解具体为调节ph至6.0，加入木瓜蛋白酶50～80℃水解4～10小时，灭酶。

在一些优选实施方案中，所述木瓜蛋白酶水解温度为60℃以下，所述水解时间6h。

进一步的，作为优选，所述木瓜蛋白酶每毫升的酶活力为30000u。

作为优选，所述木瓜蛋白酶水解时木瓜蛋白酶的加入量为所述木瓜蛋白酶与底物的体积比为1:400。

本发明所述制备方法超滤后收集截留分子量小于10kda的组分。其中，所述超滤经0.45μm水系微孔膜过滤，收集到的滤液再经10kda的超滤膜截留。

在一些实施方案中，本发明所述白蛤多肽的制备方法中，所述超滤前还包括酶解液干燥后加水重溶的步骤。

其中，所述酶解液干燥后的重溶优选为配制成浓度为20mg/ml的溶液。

本领域技术人员还可以按照公知的干燥的方法对木瓜蛋白酶酶解液进行干燥。优选采用冷冻干燥。

本发明还提供了上述制备方法制得的白蛤多肽。

百草枯，学名甲基紫精，是一种强氧化剂，可诱导体内活性氧自由基(ros)的大量产生，而常被用作秀丽线虫氧化损伤造模的化学试剂。本实施例中以80mm的百草枯溶液诱导秀丽线虫急剧死亡，来建立秀丽线虫的百草枯急性氧化损伤模型，用于评估本发明所述白蛤多肽的体内抗氧化能力的强弱。本发明将所述白蛤多肽加入到成虫初期的野生型秀丽线虫中培养，加入百草枯对秀丽线虫进行氧化胁迫造模，定时统计秀丽线虫存活的比率，检测所述白蛤多肽对百草枯诱导的氧化胁迫的影响，结果显示本发明所述白蛤多肽可以显著提高秀丽线虫在急性氧化胁迫条件下的存活率。表明本发明所述白蛤多肽具有较好的体内抗氧化能力。

无荧光的dcfh-da探针可被体内的ros氧化为呈现绿色荧光的产物dcf，通过检测某一时间点dcf的荧光强度可以间接反映样本中ros的相对含量。本发明将所述白蛤多肽加入到成虫初期的野生型秀丽线虫中培养一定时间后，匀浆、离心收集上清液，加入dcfh-da探针进行荧光强度检测，检测所述白蛤多肽对秀丽线虫体内ros水平的影响，结果显示，经本发明所述白蛤多肽饲喂后，秀丽线虫体内ros水平较对照组有一定程度的下降。表明本发明所述白蛤多肽能够促进体内ros的清除而发挥抗氧化能力。

超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，sod)是生物体内一种重要的抗氧化酶，能催化超氧化物阴离子发生歧化反应，生成过氧化氢(h2o2)和氧气(o2)，减少相关自由基对机体的氧化损伤。本发明将所述白蛤多肽加入到成虫初期的野生型秀丽线虫中培养一定时间后，匀浆、离心收集上清液，测定秀丽线虫匀浆上清液中总蛋白含量和sod活力。结果显示，本发明所述白蛤多肽能显著地提高秀丽线虫体内抗氧化酶sod的活力，从而增强机体的抗氧化能力。

本发明还选择了以哺乳细胞为模型，评估白蛤多肽的抗氧化能力。本发明利用h2o2对人神经母细胞瘤细胞sh-sy5y进行氧化损伤造模，然后将所述白蛤多肽按100、500、1000μg/ml的浓度加入细胞培养基中培养后，mtt比色法计算细胞存活率。结果显示，本发明所述白蛤多肽可显著地缓解双氧水对sh-sy5y细胞产生的损伤，具有较好的抗氧化作用。

因此，本发明提供了所述白蛤多肽在制备抗氧化的药物中的应用。

在较高温度诱导下，cl2355转基因型的秀丽线虫可泛神经表达人aβ1-42毒性蛋白(与阿尔兹海默病的发病机制相关)，引起毒性蛋白的聚集，从而导致其化学感知神经元受到损伤，显现出对化学引诱剂的敏感性(即趋化性)下降的表型。本发明用所述白蛤多肽处理cl2355秀丽线虫，通过检测线虫上述表型的缓解状况，可评估白蛤多肽对毒性蛋白的聚集的影响。结果显示本发明所述白蛤多肽可以缓解aβ聚集引起的神经毒性。

ha759转基因秀丽线虫可在其头部ash、asi和尾部pha、phb四类神经元中表达htnq150(人源亨廷顿蛋白中含150个残基的多聚谷氨酰胺片段polyq)，在线虫生长发育的过程中，polyq聚集产生神经毒性，损伤ash神经元，导致其对高渗环境感知能力和回避行为丧失，因此检测该模型的对高渗条件的避化行为可作为评估ash神经元功能的一种手段。本发明用所述白蛤多肽处理ha759秀丽线虫，通过检测线虫对不利的高渗条件的回避行为，评估白蛤多肽对ash神经元功能的影响。结果显示经白蛤多肽给药处理后，秀丽线虫ha759对不利的高渗条件的回避行为有改善。表明本发明所述白蛤多肽可以缓解polyq聚集引起的神经毒性。

因此，本发明提供了所述白蛤多肽在制备神经保护的药物中的应用。

本领域技术人员可将本发明所述白蛤多肽直接或间接加入制备不同剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料，如填充剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂等，以常规药物制剂方法，制成常用制剂如片剂、胶囊剂、注射液、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂和滴丸剂等。其中，填充剂如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和硅酸；崩解剂如琼脂，碳酸钙，土豆淀粉或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸盐和碳酸钠，低取代羟丙基纤维素；润滑剂如滑石粉，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，月桂硫酸钠；粘合剂如羧甲基纤维素，藻酸盐，明胶，聚乙烯吡咯酮，蔗糖和阿拉伯胶。

本发明所述白蛤多肽还可以制备成抗氧化和神经保护的保健品。

由上述技术方案可知，本发明提供了一种白蛤多肽及其制备方法与应用。本发明所述白蛤多肽的制备方法为取白蛤软体加水匀浆后加入木瓜蛋白酶水解，超滤后收集截留分子量小于10kda的组分。实验结果表明本发明所述制备方法制得的白蛤多肽具有很好的抗氧化和神经保护作用，可以用于制备成 抗氧化和神经保护药物或者抗氧化和神经保护保健品，应用范围广泛，具有良好的经济和社会效应。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例2抗百草枯诱导的氧化胁迫实验中实施例1制备的白蛤多肽对秀丽线虫存活率影响的生存曲线；

图2示实施例3活性氧(ros)水平的检测实验中饲喂不同浓度实施例1制备的白蛤多肽后秀丽线虫体内dcf荧光密度图；

图3示实施例4sod酶活的测定实验中饲喂不同浓度实施例1制备的白蛤多肽后对秀丽线虫体内sod活力的影响图；

图4示实施例5哺乳动物细胞模型上的抗氧化能力实验中不同浓度实施例1制备的白蛤多肽对h2o2诱导的人神经母细胞瘤细胞sh-sy5y氧化损伤模型的作用效果图；

图5示实施例6趋化试验实验中不同浓度实施例1制备的白蛤多肽处理cl2355秀丽线虫对其趋化能力的影响图；

图6示实施例7避化试验实验中不同浓度实施例1制备的白蛤多肽处理ha759秀丽线虫对其回避能力的影响图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明做详细阐述。

实施例1、白蛤多肽的制备

新鲜的白蛤进行去壳取肉处理，用水先后清洗3～4次，洗净泥沙后，取其软体组织加入2倍体积的三级水进行匀浆，得到肉糜经冷冻干燥后称重。 称取一定量的白蛤蛋白，加20倍体积的三级水进行重溶，在60℃的水浴温度下，加1mhcl溶液将体系的ph值调至6.0，再以酶母液(30000u/ml)与底物间1:400的体积比加入木瓜蛋白酶，酶解反应6h后，100℃煮沸10min灭酶活，酶解液经真空冷冻干燥后得到白蛤蛋白酶解物。

将上述白蛤蛋白酶解物配制成20mg/ml的溶液，先经0.45μm水系微孔膜过滤，收集到的滤液再经10kda的超滤膜截留，得到的滤出组分真空冷冻干燥，即为mw<10kda的白蛤多肽。

实施例2、抗百草枯诱导的氧化胁迫实验

经同步化后的野生型秀丽线虫(n2)培养至l4期，加入终浓度为75μg/ml的5-fudr以抑制其产卵，生长至成虫初期，将秀丽线虫以10～15条/孔的量与作为食物的大肠杆菌e.colina22一起加至96孔板中，各组分别喂以0.5mg/ml、1mg/ml和2mg/ml的实施例1制备的白蛤多肽，对照组加入等体积的smedium，置于20℃培养24h后，加入终浓度为80mm的百草枯进行氧化胁迫造模，之后每隔12h统计各浓度下秀丽线虫的存活情况，直至其全部死亡。统计过程中将身体僵直不动、对轻微震动无反应的线虫记为死亡状态。各组线虫的样本量为100～150条，结果用kaplan-meier法进行分析。结果如图1所示。

结果显示，经0.5，1，2mg/ml的实施例1制备的白蛤多肽饲喂后的实验组，相对于未给药的对照组，秀丽线虫在急性氧化胁迫条件下的存活率显著提高，并呈现出剂量依赖性。表明本发明所述白蛤多肽具有较好的体内抗氧化能力。

实施例3、活性氧(ros)水平的检测

经同步化后的n2秀丽线虫培养至l4期，以4000条/孔的量与5-fudr、e.colina22、1mg/ml和2mg/ml的实施例1制备的白蛤多肽加至24孔培养板中，每孔终体积1ml，继续培养48h后，收集各组线虫，并在冰浴条件下匀浆，将匀浆液4℃、10000g条件下离心5分钟，收集上清液，加入终浓度为50μm的dcfh-da探针溶液孵育2h后，利用荧光酶标仪在485nm激发波长和538nm发射波长下检测荧光强度。结果如图2所示。

结果显示，经1mg/ml和2mg/ml的实施例1制备的白蛤多肽饲喂后，秀丽线虫体内ros水平较对照组均有一定程度的下降。表明本发明所述白蛤多肽能够促进体内ros的清除而发挥抗氧化能力。

实施例4、sod酶活的测定

按照实施例3所述方法分别进行秀丽线虫的培养、给药及组织匀浆，匀浆液离心后收集上清液，利用bca法测定总蛋白含量，利用氧化歧化酶(sod)活力检测试剂盒测定秀丽线虫匀浆上清液中sod活力。结果如图3所示。

结果显示，经1mg/ml和2mg/ml的实施例1制备的白蛤多肽饲喂后，均能显著地提高秀丽线虫体内抗氧化酶sod的活力，从而增强机体的抗氧化能力。

实施例5、哺乳动物细胞模型上的抗氧化能力

利用150μm的h2o2对人神经母细胞瘤细胞sh-sy5y进行氧化损伤造模，调整细胞密度至1×10⁵个/ml，按照100μl/孔加至96孔板，于37℃下孵育24h后吸弃旧培养基，再加入90μl细胞培养基，分别加入10μl终浓度为100、500、1000μg/ml的白蛤多肽，在37℃孵育24h后，加入5mg/ml的mtt溶液，继续在37℃孵育4h后，吸弃上清，以100μl/孔加入dmso，在摇床上振摇10min以充分溶解甲臜结晶，于570nm处测定吸光值，计算细胞存活率，结果如图4所示。

其中，细胞存活率计算公式如下：

式中，asample和acontrol分别表示给药组和对照组的吸光值。

结果显示，当给药浓度达到500μg/ml以上时，白蛤多肽可显著地缓解双氧水对sh-sy5y细胞产生的损伤，具有较好的抗氧化作用。

实施例6、趋化试验

分别将1mg/ml和2mg/ml的白蛤多肽和菌液混匀后涂板，再将cl2355秀丽线虫的卵转移至涂有药物和菌液混合物的板上，16℃培养箱中孵育36h 后，升温至23℃继续诱导培养36h，分别收集每板上的秀丽线虫进行趋化实验，以无水乙醇配制的0.5％苯甲醛作为化学诱导剂滴加在趋化板的一侧(a区域)，无水乙醇滴在板子另一侧的相同位置(b区域)作为对照，将秀丽线虫转移至趋化板中线处，盖上盖子，放回23℃培养箱继续孵育，使得各组线虫自由爬行1h后，55℃高温急速杀死线虫以固定其位置，分别统计板a、b区域的线虫数a0、b0，以及板上的总虫数n0，并计算趋化指数(chemotaxisindex；ci)。结果如图5所示。

其中，趋化指数ci的计算公式如下：

结果显示，1mg/ml和2mg/ml的白蛤多肽均有一定的缓解aβ聚集毒性的作用，且与对照相比，2mg/ml的白蛤多肽具有统计学意义上的差异性。表明本发明所述白蛤多肽可以缓解aβ聚集引起的神经毒性。

实施例7、避化试验

将同步化后的l1期ha759幼虫、大肠杆菌na22、实施例1制备的白蛤多肽加至24孔板中，给药终浓度分别为0.25mg/ml、0.5mg/ml，每孔1000～1500条虫，将板置于15℃摇床中培养3天后，收集各组虫液，离心弃上清，经m9缓冲液反复吹洗3次。用30μl8m甘油在制备好的固体培养板中央划一条中线，将其分为n和t两个半圆区域。在t区平皿的边缘处滴加微量1％的双乙酰用作引诱剂，在n区等距处10μl虫液，液滴干后将避化板放回23℃培养箱中自由爬行90min后，于55℃高温急速杀死线虫并固定其位置，分别统计板n、t区域的线虫数n0、t0，并计算回避指数(avoidanceindex；ai)。

其中，回避指数ai的计算公式如下：

结果显示，经0.25mg/ml和0.5mg/ml的白蛤多肽给药处理后，秀丽线虫ha759对不利的高渗条件的回避行为有一定的改善，说明其对体内polyq聚集引起的神经毒性有一定的缓解作用。且与对照相比，这种神经保护作用 在0.5mg/ml时具有统计学意义上的差异性。表明本发明所述白蛤多肽可以缓解polyq聚集引起的神经毒性。