一种金属硫堇配位化合物Co‑Thi及其制备方法和应用与流程

本发明属于金属配位化合物，具体涉及一种金属硫堇配位化合物co-thi及其制备方法和应用。

背景技术：

肿瘤已成为人类健康的全球性问题，蛋白酪氨酸激酶-7(ptk7k)是在多种人类恶性肿瘤中过表达的缺陷型受体蛋白酪氨酸激酶的成员。目前已有的检测方法难以定性地评价和定量癌组织中ptk7k蛋白的表达。而sgc8c适配体(apt)是能够特异性结合蛋白酪氨酸激酶-7(ptk7k)的dna。硫堇(thi)是具有环状平面结构并具有正电荷的芳香环结构的噻吩类小分子化合物，硫堇的分子结构可以使其容易插入dna分子，但也可以产生强烈的静电吸引力与dna，所以它可以与dna结合。针对这种情况，需要合成一种具有硫堇配位的金属配位化合物，该化合物可以与sgc8c适配体结合，并运用到检测ptk7k中。目前对ptk7k的检测主要有免疫组化方法检测，以及蛋白印迹法。但是该检测的方法检测线较高，成本高，检测方法复杂，无法实现恶性肿瘤的早期检测。因此提出新的检测ptk7k的方法是十分必要的。如肿瘤标志物为ptk7k的急性白血病的检测，早期用聚硫堇进行检测，主要通过在电极上聚合硫堇。通过硫堇和适配体结合，产生位阻，导致电流变化产生信号来检测急性白血病。但由于形成聚硫堇会对电极造成损坏，且其本身的稳定性较差，所以现在逐渐采用国外的层层自组装模式来检测。用层层自组装的模式来检测。一般都是将纳米金修饰在电极上再利用纳米金的生物相容性结合适配体为第一层。适配体结合肿瘤标记物为第二层，负载有适配体和相关酶的材料能够结合肿瘤标志物为第三层，最后通过酶来催化相关物质，产生电信号。由于层层自组装的成功率和效率都很低，就导致其检测限不是太低。而且纳米金相对比较昂贵也造成成本较高，实际应用价值不高。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种金属硫堇配位化合物co-thi(thi表示硫堇)，该化合物可以使用滴涂的方法滴涂在电极上并且稳定，不需要使用高电压聚合，同时该金属硫堇配位化合物co-thi可以有效地结合适配体sgc8c形成co-thi-sgc8c用于制备电化学生物传感器，用于检测ptk7k，并且检测效果好，重现性高。

本发明还提供了金属硫堇配位化合物co-thi的制备方法和应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种金属硫堇配位化合物co-thi，由摩尔比为1：(10-12)：(10-12)的硫堇、乙酸钴和乙醇钠制备而成。

作为优选，所述的金属硫堇配位化合物co-thi，由摩尔比为1：12：10的硫堇、乙酸钴和乙醇钠制备而成。

其中，所述化合物的配体为硫堇，配位中心为co，co与硫堇的摩尔比为1：1。

本发明所述的金属硫堇配位化合物co-thi的制备方法，包括如下步骤：

(1)将硫堇、乙酸钴和乙醇钠按比例混合并溶于乙醇中，得混合溶液a；

(2)将混合溶液a加入到反应釜中加热反应，自然降温后将产物离心洗涤干燥，得到co-thi金属硫堇配位化合物。

其中，步骤(2)所述加热反应的温度为140-160℃，时间为5-7d。

本发明所述的金属硫堇配位化合物co-thi在制备蛋白检测器上的应用。

其中，所述蛋白检测器为用于检测恶性肿瘤标志物蛋白酪氨酸激酶-7(ptk7k)的电化学生物传感器。

所述电化学生物生物传感器上由金属硫堇配位化合物co-thi和适配体sgc8c结合，生成co-thi-sgc8c，并滴涂于玻碳电极表面制成。

进一步地，所述电化学生物生物传感器为co-thi-sgc8c电极，由金属硫堇配位化合物co-thi和适配体sgc8c结合，生成co-thi-sgc8c，将co-thi-sgc8c制成悬浊液并滴涂于玻碳电极表面制成。

所述金属硫堇配位化合物co-thi和适配体sgc8c按摩尔比(10-1):(1-2)进行结合。

更进一步地，所述电化学生物传感器具体制备方法，包括如下步骤：将金属硫堇配位化合物co-thi和适配体sgc8c结合，生成co-thi-sgc8c；将co-thi-sgc8c溶于二次蒸馏水和萘酚中，超声分散，得到co-thi-sgc8c悬浊液，将悬浊液滴涂到处理后的玻碳电极表面，室温下放置晾干，即制得电化学生物传感器co-thi-sgc8c/玻碳电极(co-thi-sgc8c/gce)。

电化学生物传感器co-thi-sgc8c/玻碳电极可以用于检测ptk7k，具体步骤为：将co-thi-sgc8c/gce置于三电极体系中在0-0.9v的范围内进行循环伏安测试，不断地加入不同浓度的ptk7k得到不同的电流绘制标准曲线。检测时加入样品得到电流，根据标准曲线上的电流得到对应的浓度。

有益效果：现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明的制备合成的金属硫堇配位化合物co-thi为一种新的化合物，相对于已有材料聚硫堇，由于合成聚硫堇需要在高电位下长时间进行，而本发明的化合物不需要在高电位下长时间制备，可以降低对电极的破坏，并且制备方法简单，成本低，无污染。

(2)本发明金属硫堇配位化合物co-thi制备的生物传感器，制备简单，使用方便，可以有效地检测ptk7k，使用方便，可以有效地检测ptk7k，并且该检测器灵敏度高，响应时间短，特异性强，具有重现性和稳定性。相对于层层自组装的电极组装方法，不需要进行层层组装，减少组装层，能够提高效率；并且由于层层组装经常采用纳米金，纳米金本身带有负电荷，且在玻碳电极上没有氧化还原峰会阻碍硫堇电子传递，而本发明制备的生物传感器能够提高传递电子能力，电化学活性高，能够降低检测线。

(3)本发明金属硫堇配位化合物co-thi制备的生物传感器可以用于电化学生物传感，相对于对于检测蛋白的技术中的蛋白印迹和和免疫组化的方法，电化学生物传感方法具有特异性高，检测性能好的优点。

附图说明

图1是本发明实施例1所制备的金属硫堇配位化合物co-thi的xrd；

图2是本实施例1所制备的金属硫堇配位化合物co-thi的红外和紫外图谱(a为红外，b为紫外，a为thi，b为co-thi)；

图3是本发明实施例7制备的co-thi-sgc8c/gce在氨基钌溶液中的差分脉冲伏安图(dpv)；

图4是本发明实施例7制备的co-thi-sgc8c/gce在pbs溶液中加入ptk7k的循环伏安图，其中a为裸电极的cv，b为co-thi/gce的cv；c为co-thi/gc加入2.5×10^-5mgml^-1ptk7k的cv，d为co-thi-sgc8c/gce的cv，e为co-thi-sgc8c/gce加入2.5×10^-5mgml^-1ptk7k的cv；

图5是本发明实施例7制备的co-thi-sgc8c/gce的定量循环伏安图以及标准曲线图(insert)；

图6是本发明实施例11中的加入不同浓度ptk7k重现性图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

金属硫堇配位化合物co-thi的制备：

取0.05mmol的硫堇和0.5mmol的乙醇钠加入0.6mmol的乙酸钴溶于10ml乙醇于反应釜中150℃反应6d，自然降温，将产物用乙醇和热水离心分离洗涤，得到金属硫堇配位化合物co-thi。

实施例2

金属硫堇配位化合物co-thi的制备：

取0.05mmol的硫堇和0.6mmol的乙醇钠加入0.5mmol的乙酸钴溶于10ml乙醇于反应釜中150℃反应5d，自然降温。将产物用乙醇和热水离心分离洗涤，得到金属硫堇配位化合物co-thi。

实施例3

实施例3与实施例1配方和制备方法相同，不同之处在于反应釜中140℃反应7d。

实施例4

实施例4与实施例2配方和制备方法相同，不同之处在于反应釜中160℃反应5d。

实施例5

co-thi-sgc8c的合成：

将1odsgc8c适配体置于3ml的离心管中12000转，离心30-60s，加入25ul去离子水于sgc8c适配体中，稀释至100μm；取1.86ul的100um适配体，稀释到2ml，95℃水浴加热5min，自然冷却至室温。加入实施例1制备co-thi配位化合物1.86umol，超声30min后反应16h，加入0.0032gnacl，浓度为0.05m，反应6h，在加入0.0032gnacl，浓度增加的0.1m.反应10h，离心，再加入去离子水洗涤离心分离，得到固体即为co-thi-sgc8c。

实施例6

实施例6与实施例5配方和制备方法相同，不同之处在于金属硫堇配位化合物co-thi和适配体sgc8c摩尔比为1:2。

实施例7

co-thi-sgc8c/gce(co-thi-sgc8c/玻碳电极)的制备：

将实施例5制备的co-thi-sgc8c取3.7mg溶于800μl二次蒸馏水和200ul的萘酚中，超声分散，得到co-thi-sgc8c悬浊液。用移液枪将6μlco-thi-sgc8c滴涂到处理后的玻碳电极表面(玻碳电极gce的处理方法为通过直径为3mm经尼龙抛光布打磨，然后用粒径大小分别为1.0、0.3、0.05μm的al2o3依次抛光至镜面，然后在二次蒸馏水和乙醇中超声清洗交替超声，每次30s，取出后晾干备用)，室温下放置晾干，即为电化学生物传感器co-thi-sgc8c/玻碳电极(co-thi-sgc8c/gce)。

实施例8

用显微镜观察实施例1制备的金属硫堇配位化合物co-thi没有杂质，说明合成的物质为纯物质。其xrd如图1所示，由于xrd和钴的金属氧化物(pdf#01-1227,pdf#02-1217,pdf#09-0402,pdf#09-0418)的xrd峰不能重合排除了物质是氧化物的可能性，且不能和其他已知存在的xrd重合，说明生成了一种新的物质。峰的强度较大，较为密集说明结晶度好，且通过显微镜观察该物质没有杂质，通过显微镜观察和xrd峰形尖锐确定该物质是一种纯物质，为晶体，通过xrd表明co-thi化合物为新型的化合物。

实施例9

对实施例1所制备的金属硫堇配位化合物co-thi的进行红外检测，红外如图2a所示。图2a中：a为硫堇的红外吸收峰，1450-1600cm^-1左右有苯环的吸收峰，1232cm^-1为c＝s的特征峰，1598cm^-1处的弱峰推测为c＝n的吸收，3174cm^-1峰为n-h的伸缩振动吸收峰，b为金属硫堇配位化合物co-thi红外吸收峰，co-thi红外吸收峰中1450-1600cm^-1左右有苯环的吸收峰，1232cm^-1为c＝s的特征峰，1598cm^-1处c＝n的伸缩振动吸收峰都存在。说明了在合成物质中，硫堇没有被破坏，而n-h的伸缩振动吸收峰都消失，氮参与了配位，且一个n可能与两个金属原子配位。500-600cm^-2处的强峰为co-n的吸收峰。由红外吸收表明参与配位的硫堇为配体，配位的原子为n，且一个n和两个金属原子配位。确定配体为硫堇，配位原子为n。

对实施例1所制备的金属硫堇配位化合物co-thi的进行紫外检测，紫外图谱如图2b所示，在紫外图中，a为硫堇的紫外峰，b为co-thi的紫外吸收峰，a-b，s带由280nm蓝移至260nm苯的紫外吸收带。由于配位聚合，降低了苯环的电子云密度导致s带蓝移，同时q带消失，配位后，分子对称性降低导致的。

根据紫外推断，此物质为配合物，通过以上分析得到我们合成了一种以硫堇为配体，以co为配位中心的新型的金属有机化合物。

根据元素分析，co-thi元素分析：c40.88％，n12.06％，s9.21％，h3.89％，co15.93％，其中c：s摩尔比为12:1，和配体中c元素和s元素比例相同，配合物中没有醋酸根离子，co:s摩尔比为1:1，配位化合物的配位中心co和配体硫堇的摩尔比为1：1。

实施例10

通过合成方法水热反应，将实施例5合成的co-thi-sgc8c并均匀分散在水溶液中并滴于玻碳电极表面，并用电化学的方法差分脉冲伏安，在浓度为5um的氨基钌溶液中测dpv，电位范围为-0.6v-1.0v。判断sgc8c是否与co-thi相结合。

将实施例7制备的co-thi-sgc8c/gce在氨基钌溶液中的差分脉冲伏安图(dpv)，如图3所示(a没有加入氨基钌，b加入氨基钌)，co-thi与sgc8c结合以后由于sgc8c能够和钌静电结合，结合后，电极上存在钌离子，在施加电压的情况下，就会出现钌离子的氧化峰，二价到三价，在0.3v左右，因而表明co-thi和sgc8c结合。

实施例11

循环伏安法检测ptk7k：

将实施例7制备的co-thi-sgc8c/gce在0-0.9v的范围内进行循环伏安测试。循环伏安如图4所示，首先采用循环伏安法(cv)研究了co-thi-sgc8c/gce的电化学性质，测试在ph＝7的0.1moll^-1pbs电解质溶液中裸电极和co-thi/gce的cv曲线。在0到0.9v范围内，裸电极没有出现氧化还原峰(曲线a)，而co-thi-sgc8c/gce(曲线d)在此电位范围内电流增大，且在0.85v处电流明显增大，出现一个不可逆的氧化峰，归为co(ⅲ)/cu(ⅱ)的氧化过程，当2.5×10^-5mgml^-1ptk7k加入后，峰的电流都有明显的减弱(曲线d→e)。结果表明活性位点co的电流下降，表明电极上的物质的阻抗增大，即ptk7k属于高分子蛋白质和电极上的适配体sgc8c结合，使得阻抗增大，因而电流减少。co-thi/gce(曲线b)，且在0.85v处电流明显增大，出现一个不可逆的氧化峰，归为co(ⅲ)/cu(ⅱ)的氧化过程，当2.5×10^-5mgml^-1ptk7k加入后，峰没有明显的变化(曲线b-c)。结果表明在co-thi-sgc8c/gce电极中，能够和ptk7k发生特异性结合的只有sgc8c，而裸电极以及co-thi不能够和ptk7k发生特异性的结合，表明电极co-thi-sgc8c/gce能够特异性结合sgc8c。

将实施例7制备的co-thi-sgc8c/gce在-1-1v的范围内进行循环伏安测试。不断地加入不同浓度的ptk7k(浓度参见图5的标准曲线的横坐标)，根据浓度和电流的关系探索标准曲线，得到标准曲线，其最小检出限为4.56×10^-4mgml^-1，灵敏度为0.36mamlmg^-1cm^-2，线性范围2.5×10^-3-9×10^-3mgml^-1(r＝0.99)。

改变伏安曲线扫描范围为0-1v，其最小检出限为2.45×10^-6mgml^-1，灵敏度为1.33mamlmg^-1cm^-2，线性范围1.56×10^-5-1.36×10^-4mgml^-1(r＝0.993)。

改变伏安曲线扫描范围为0-0.9v，如图5所示，其最小检出限为1.67×10^-6mgml^-1，灵敏度为1.66mamlmg^-1cm^-2，线性范围1.25×10^-5-2×10^-4mgml^-1(r＝0.995)，选择0-0.9v的电位的电极具有最优越的电化学性能。

居于以上的分析，由于适配体和ptk7k的结合不是瞬间完成，因而选择循环伏安法对co-thi-sgc8c/gce检测ptk7k进行定量的研究。在ph＝7的0.1m^-1pbs电解质溶液中在0到0.9v范围内，加入不同浓度的ptk7k(浓度见图5的标准曲线横坐标)。并进行循环伏安扫描，至曲线稳定，选择每个浓度稳定的曲线进行作图，不断地加入不同浓度的ptk7k，根据浓度和电流的关系探索标准曲线，得到标准曲线，如图5所示，此电化学方法检测线性范围为1.25×10^-5-2×10^-4mgml^-1，最小检出限为1.67×10^-6mgml^-1，灵敏度为1.66mamlmg^-1cm^-2。图5中a-q表示加入不同浓度的ptk7k电流的响应，q为最大浓度，a为最小浓度。

结果表明在0-0.9v电位该传感器具有较好的性能，灵敏度高，响应时间短，特异性强。目前关于ptk7k的检测主要为免疫组化的方法，以及蛋白印迹的方法。未见用电化学的方法来检测ptk7k。

实施例11

稳定性检测以及重现性检测：

根据实施例10循环伏安测试检测的结果选择0-0.9v作循环伏安法的工作电位，在指定的浓度下，重复3次平行试验检测ptk7k，进行重复性的检测，加入的ptk7k浓度分别为加入的浓度分别为6.25×10^-6，1.25×10^-5，2.5×10^-5，3.75×10^-5，5×10^-5，6.25×110^-5，7.5×10^-5，8.75×10^-5，1×10^-4，1.25×1×10^-4，1.5×1×10^-4，1.75×1×10^-4，2×1×10^-4，2.25×1×10^-4mgml^-1进行平行实验。每个浓度的重现性都很好说明该电化学生物传感器对ptk7k的检测具有较好的重现性和稳定性，如图6所示。