一种可抗肿瘤的金属络合物的制作方法

本发明涉及一种新型抗肿瘤化合物，尤其涉及一种可抗肿瘤的金属络合物。
背景技术：
：近年来随着人们生活方式的改变和医疗技术的提高，肿瘤检出人数也呈增高趋势，肿瘤已成为对人类健康造成严重威胁的重要疾病之一，由于对患者机体具有较高的损害性和较高的病死率，抗肿瘤药物的应用和研究一直是人们所关注的焦点，新的治疗理论和新型药物不断被开发和应用。科学家们合成了许多分子靶标明确的抗肿瘤分子药物，但是由于化学合成药物的开发周期长以及研发费用昂贵，且临床毒副作用大，制约了药物的进一步研发和应用。中草药和植物药等天然药用材料中存在着广泛的生物活性物质，研究者可从中药中寻找毒副作用小、药理作用独特的抗肿瘤药物及抗肿瘤辅助药物。技术实现要素：本发明的目的是提供一种新型抗肿瘤药物，对免疫巨噬细胞则有明显的激活作用，通过刺激机体的免疫功能来消灭肿瘤细胞，而不是通过细胞毒作用直接抗肿瘤。本发明的技术方案如下：一种可抗肿瘤的金属络合物，制备方法为：(1)取干燥黑灵芝药材100g，加95％乙醇室温浸泡提取48h，过滤，重复一次，药渣于室温下置通风处晾干，然后将药渣与蒸馏水按质量体积(kg/L)比为1：20的比例混合，回流提取两次，每次提取时间依次为2h，1h，合并提取液，离心分离，减压浓缩；所得样品加入适量的95％乙醇使溶液中使得乙醇的体积分数为80％，然后进行沉淀，4℃下静置24h，离心过滤；沉淀物合并，依次以无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤沉淀物，冷冻干燥得样品；取得到的干燥样品，以Sevag法除蛋白，即Sevag试剂(体积比氯仿∶正丁醇＝5∶1)和干燥样品以质量比1∶1混匀，静置，除去下层蛋白质变性层；将样品浓缩，重复除蛋白操作10次；浓缩除蛋白样品后用95％乙醇洗涤，再浓缩，冻干得粗提物样品；将粗提物样品使用透析袋透析3天，将袋内样品浓缩至小体积，冷冻干燥，得黑灵芝精提物；(2)取上述得到的黑灵芝精提物500mg，加入蒸馏水配成浓度为3～5mg/mL的溶液，离心，上清液过凝胶柱层析，使用的层析系统是Purifier100生物大分子纯化系统，凝胶柱Hiload26/60Superdex-200prepgrade，上样前将样品和洗脱液过0.22μm微孔滤膜以保护分离柱，洗脱液为蒸馏水，流速为2mL/min，上样体积为5mL，分部收集体积为8mL/管，紫外检测器和示差折光检测器检测(RID-10A示差检测器)在线监测洗脱情况；取第6-14管合并，浓缩，冷冻干燥得到黑灵芝提取物PSG，为黄色或棕色的絮状固体；(3)将PSG与金属离子进行络合得到PSG-Fe或PSG-Ca。本发明金属络合产物PSG-Fe或PSG-Ca，对DPPH自由基的清除效果较好，还原力强，能够中和更多的亚油酸自由基和其他在体系中形成的自由基，减缓β-胡萝卜素的褪色，可用于抗肿瘤。附图说明图1为PSG-Fe的高效凝胶渗透色谱图。图2为PSG、PSG-Fe的红外光谱图。图3为PSG、PSG-Ca的红外光谱图。图4为PSG、PSG-Fe，PSG-Ca清除DPPH自由基的能力示意图。图5为硫酸亚铁标准曲线图。图6为PSG及PSG-Fe、PSG-Ca抑制β–胡萝卜素-亚油酸体系氧化的能力示意图。具体实施例实施例1：一种可抗肿瘤的金属络合物，制备方法为：(1)取干燥黑灵芝药材100g，加95％乙醇室温浸泡提取48h，过滤，重复一次，药渣于室温下置通风处晾干，然后将药渣与蒸馏水按质量体积(kg/L)比为1：20的比例混合，回流提取两次，每次提取时间依次为2h，1h，合并提取液，离心分离，减压浓缩；所得样品加入适量的95％乙醇使溶液中使得乙醇的体积分数为80％，然后进行沉淀，4℃下静置24h，离心过滤；沉淀物合并，依次以无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤沉淀物，冷冻干燥得样品；取得到的干燥样品，以Sevag法除蛋白，即Sevag试剂(体积比氯仿∶正丁醇＝5∶1)和干燥样品以质量比1∶1混匀，静置，除去下层蛋白质变性层；将样品浓缩，重复除蛋白操作10次；浓缩除蛋白样品后用95％乙醇洗涤，再浓缩，冻干得粗提物样品；将粗提物样品使用透析袋透析3天，将袋内样品浓缩至小体积，冷冻干燥，得黑灵芝精提物；(2)取上述得到的黑灵芝精提物500mg，加入蒸馏水配成浓度为3～5mg/mL的溶液，离心，上清液过凝胶柱层析，使用的层析系统是Purifier100生物大分子纯化系统，凝胶柱Hiload26/60Superdex-200prepgrade，上样前将样品和洗脱液过0.22μm微孔滤膜以保护分离柱，洗脱液为蒸馏水，流速为2mL/min，上样体积为5mL，分部收集体积为8mL/管，紫外检测器和示差折光检测器检测(RID-10A示差检测器)在线监测洗脱情况；取第6-14管合并，浓缩，冷冻干燥得到黑灵芝提取物PSG，为黄色或棕色的絮状固体；(3)PSG-Fe的制备：称取PSG300mg，加入0.5g的柠檬酸钠作为催化剂，溶于30mL去离子水中，在60℃恒温水浴中不断搅拌，同时滴加2mol/L三氯化铁溶液和20.0％的NaOH溶液，调节滴加速度至1滴(约0.05毫升)/30秒，控制反应液的pH值为8，反应中刚滴入的FeCl3溶液开始形成沉淀，而后随反应进行又溶解，当反应中产生的沉淀不再溶解时，表明反应系统的络合能力已达到饱和，即停止滴加FeCl3溶液和NaOH溶液，继续在60℃水浴中搅拌lh，反应冷却后，经离心、透析、醇沉，制得PSG-Fe配合物。实施例2：一种可抗肿瘤的金属络合物，制备方法为：(1)取干燥黑灵芝药材100g，加95％乙醇室温浸泡提取48h，过滤，重复一次，药渣于室温下置通风处晾干，然后将药渣与蒸馏水按质量体积(kg/L)比为1：20的比例混合，回流提取两次，每次提取时间依次为2h，1h，合并提取液，离心分离，减压浓缩；所得样品加入适量的95％乙醇使溶液中使得乙醇的体积分数为80％，然后进行沉淀，4℃下静置24h，离心过滤；沉淀物合并，依次以无水乙醇、无水乙醚、丙酮洗涤沉淀物，冷冻干燥得样品；取得到的干燥样品，以Sevag法除蛋白，即Sevag试剂(体积比氯仿∶正丁醇＝5∶1)和干燥样品以质量比1∶1混匀，静置，除去下层蛋白质变性层；将样品浓缩，重复除蛋白操作10次；浓缩除蛋白样品后用95％乙醇洗涤，再浓缩，冻干得粗提物样品；将粗提物样品使用透析袋透析3天，将袋内样品浓缩至小体积，冷冻干燥，得黑灵芝精提物；(2)取上述得到的黑灵芝精提物500mg，加入蒸馏水配成浓度为3～5mg/mL的溶液，离心，上清液过凝胶柱层析，使用的层析系统是Purifier100生物大分子纯化系统，凝胶柱Hiload26/60Superdex-200prepgrade，上样前将样品和洗脱液过0.22μm微孔滤膜以保护分离柱，洗脱液为蒸馏水，流速为2mL/min，上样体积为5mL，分部收集体积为8mL/管，紫外检测器和示差折光检测器检测(RID-10A示差检测器)在线监测洗脱情况；取第6-14管合并，浓缩，冷冻干燥得到黑灵芝提取物PSG，为黄色或棕色的絮状固体；(3)PSG-Ca的制备：称取300mg的PSG，用20mL0.01MCaC12溶液(用三蒸水配制)溶解。50℃温度下电磁搅拌反应l2h。完毕后以4000r/min的速度离心10min得上清液。将上清液放入三蒸水中充分透析1d。然后将透析液在旋转蒸发器上45℃进行浓缩，向旋转蒸发浓缩溶液中加入过量的乙醇中，析出沉淀，过滤或离心，收集沉淀，用无水乙醇多次洗涤，至滤液中无氯离子(用硝酸银溶液检查是否产生沉淀)检出。将沉淀放入真空干燥箱进行干燥(50℃，真空度为0.09个大气压)2h，得到灰白色粉末状多PSG-Ca配合物。一、产物的理化性质对实施例1-2制得PSG-Fe和PSG-Ca进行红外光谱分析，同时测定纯度、平均分子量、络合物的铁、钙质量分数。(1)纯度鉴定用高效渗透凝胶色谱法进行纯度的检测，取测试样品3mg溶于1mL蒸馏水，1000rpm离心10min，用微孔过滤膜过滤后自动上样20μL，记录洗脱曲线用于判定该组分的纯度。实验所用的HPLC的具体测试条件如下：色谱柱为UltrahydrogelTM500300mm×7.8mmid；流动相为0.1MNaCl；流速0.6mL/min；柱温35℃。(2)分子量测定液相色谱柱为UltrahydrogelTM500300mm×7.8mmid，流动相为0.1MNaCl，流速为0.6mL/min，柱温为35℃。配制各标准品Glc，T10，T40，T70，T500，T20002％溶液，各溶液在HPLC进样后得到相应的液相图谱。设定T2000的洗脱体积为柱的空体积V0，Glc的洗脱体积作为柱的总体积Vt，以公式Kav＝(Ve-V0)/(Vt-V0)计算，以LogMw-Kav作图得标准曲线。根据样品的Ve，从标准曲线上即得样品的分子量。由于洗脱液的流速恒定，所以可以绘制出保留时间与分子量关系的标准曲线，根据其回归方程即可求得各产物的分子量。(3)络合物的铁、钙质量分数的测定：准确称取0.0100g上述所制备的样品，加入5mL的浓硝酸用微波消解仪进行消化。得到的消化液用ICP-AES测定其中的Ca、Fe金属元素的含量，进而比较PSG对这两种有益金属元素的络合能力和络合量。(4)红外光谱(IR)分析取1-2mg样品，用KBr压片进行常规IR分析，红外光谱仪测定参数如下：背景扫描次数：128次；分辨率：4.0cm-1；检测器：DTGS。表1产物的平均分子量和Fe、Ca的元素含量PSG分子中存在大量的活性基团如羟基、羧基，使得其具有良好的金属配位能力，可与金属离子形成配合物。由表1可知，PSG-Ca的平均分子量高，络合程度低，而PSG-Fe平均分子量非常低，络合程度则相对较高。这可能有以下原因：络合工艺不同，PSG降解程度不一样，络合程度高低也不一样；络合程度高低与金属离子所带电荷也有一定关系。由于铁的络合是在碱性条件下反应的，因此在络合过程中有可能发生PSG分子的降解，导致分子量大幅下降。透析除盐后的PSG-Fe溶于水，以K4[Fe(CN)6]检验其水溶液，结果不显示Fe(Ⅲ)离子的特殊效应。证实TPC水溶液中不存在游离的Fe3+。说明生成了较为稳定的配合物。图3、4为PSG-Fe、PSG-Ca的红外光谱图。同PSG红外吸收光谱图相比较，可以看出，PSG-Fe配合物的谱图的基本的骨架发生了明显变化，尤其在500-1000cm-1附近，说明PSG在铁络合后分子基本结构发生了部分降解。PSG-Ca配合物的谱图的基本的骨架并没有发生变化，但PSG在3395cm-1附近的羟基(-OH)吸收峰在PSG-Ca、PSG-Fe中明显增强，且向高波数移动，原因是与PSG的羟基配位后，使得-OH的氢键缔合作用减弱；PSG位于1413cm-1处羧基(-COOH)的C-O的伸缩振动或次甲基的-C-H变角振动在在钙配合物移向高波数1419cm-1处，铁配合物中移向高波数1429cm-1，说明羧基(-COOH)的C-O参与了配位；位于1075cm-1的仲羟基吸收峰在钙配合物中移向1094cm-1，在铁配合物中移向1070cm-1；位于1035.03cm-1处羧基(-COOH)的O-H吸收峰，在两种配合物仍然存在，但是吸收峰强度明显减少。二、体外抗氧化活性实验1.对DPPH自由基的清除作用由于本发明产物不溶于高浓度的乙醇溶液，所以要测定本发明产物对DPPH自由基的清除作用，还需要对其方法进行一定的改良，改良后的方法如下：DPPH以95％乙醇配成0.2mmol/L溶液。取1mL不同浓度的样品溶液，2mL新鲜配制的DPPH乙醇溶液和2mL95％乙醇于同一具塞试管中，充分混匀，于暗处反应30min后，取出于525nm处测定吸光度。空白组用2mL95％乙醇代替DPPH溶液，对照组为2mLDPPH溶液与3mL95％乙醇混合。每组样品一式三份，取平均值。反应体系吸光度越低，说明清除DPPH自由基能力越强，DPPH自由基清除率计算公式为：清除率＝[1-(Ai-Aj)/Ac]×100％(9.1)其中，Ai为样品组吸光度值，Aj为空白组吸光度值，Ac为对照组吸光度值。2.总还原能力的测定样品总还原能力的测定采用铁离子还原能力法(FRAP)。试剂配制：10mmol/L2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪(TPTZ)溶液：称取0.0312gTPTZ，用40mmol/L盐酸溶液定容至10mL；FRAP工作液：300mmol/LpH3.6的醋酸盐缓冲液，10mmol/LTPTZ溶液以及20mmol/L的三氯化铁溶液以10:1:1组成。标准曲线：取不同浓度0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mmol/L的硫酸亚铁标准液0.2mL于反应管中，分别加入6mLFRAP工作液以及0.6mL超纯水，混匀后，准确反应5min，在593nm下测定吸光度，超纯水作为空白。以硫酸亚铁溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，作标准曲线。在相同条件下测定一定浓度的样品，平行三次，取平均值。样品的还原能力以FRAP值来表示，单位为mmol/g，FRAP值越大，表示还原能力越强。3.抑制β-胡萝卜素-亚油酸体系氧化实验采用胡萝卜素漂白法考察样品对β-胡萝卜素-亚油酸氧化体系的抑制效果。取5mgβ-胡萝卜素溶解于50mL氯仿中，向其中加入40mg亚油酸以及400mg曲二通X-100，40℃下旋转蒸发浓缩5min以去除氯仿，加入100mL氧饱和的蒸馏水，充分混合而制得乳浊液体系。取4.5mL上述制备好的乳浊液，加入不同浓度的样品溶液或者超纯水0.5mL，混合均匀后，于470nm下测定吸光度值作为零时刻的吸光度。将反应液置于50℃水浴2h后，再次于470nm处测定吸光度。以不加β-胡萝卜素的反应液为空白试剂，BHT作为阳性对照。样品抗氧化率(％)根据β-胡萝卜素的褪色情况按如下公式进行计算：其中，A0、A0′分别为样品和空白组在零时刻的吸光度；At、At′分别为反应2h后的吸光度。4.结果与讨论(1)各受试物对DPPH自由基的清除作用由图4可知，PSG及其金属络合物在同浓度下，清除DPPH自由基的能力大小顺序为：PSG-Ca＞PSG＞PSG-Fe，可以推测：PSG的糖环上的-OH或-COOH与不同的金属离子络合后，空间结构发生变化，造成清除自由基的活性也不同。PSG-Fe清除DPPH自由基的能力降低，可能是PSG与Fe络合以后其结构和构象发生了很大的变化，使得一部分PSG的活性位点被隐藏，从而对抗氧化活性有一定的影响。(2)各受试物总还原能力的测定许多研究证实，抗氧化活性与还原力有关。还原力是表示抗氧化物质提供电子能力的重要指标，可以通过提供电子使自由基变为稳定的物质，以中断自由基的连锁反应。也有研究表明还原能力与还原酮的存在有关，还原酮可提供氢原子，中止自由基的链式反应；同时，它还能够与过氧化物的前提物质反应阻止过氧化物的产生，从而起到抗氧化的作用。本实验利用铁离子还原能力的方法测定PSG及其衍生物的还原能力。抗氧化剂能将Fe3+还原为Fe2+，Fe2+与三吡啶三吖嗪(TPTZ)络合生成蓝色物质，在593nm处有特征吸收，吸光度与浓度呈正相关，吸光度越大，FRAP值也越大，也就说明抗氧化剂效果越好。硫酸亚铁含量的标准曲线如图5所示，同时对不同样品进行测定，平行三次，通过标准曲线换算出FRAP值，所得结果见表2。从表2中可知，PSG具有较强的还原能力，甚至超过对照物BHT。PSG和铁络合后发现络合产物的还原能力非常低，其原因可能与PSG络合的是三价铁离子而非二价铁离子，及本身颜色干扰，还有络合后分子结构的变化有关。PSG-Ca的还原能力稍低于PSG，但是差异不明显，说明PSG-Ca不仅可以起到补钙的作用，其还原作用也没有受到很大影响。表2各产物的总还原能力(FRAP值)处理(Treatment)FRAPValue(mmol/g)PSG0.2066PSG-Fe0.0138PSG-Ca0.2026BHT0.1594(3)各受试物抑制β-胡萝卜素-亚油酸体系氧化能力的测定在评价总抗氧化能力的β-胡萝卜素-亚油酸体系中，β-胡萝卜素的褪色是一种由亚油酸产生的氢过氧化物引起的自由基氧化β-胡萝卜素所引起的。在这个体系中，亚油酸从其中一个二烯丙基的亚甲基中夺取一个氢原子形成亚油酸自由基，进攻高度不饱和的β-胡萝卜素，使得β-胡萝卜素被氧化，失去生色团和其特有的橙色。抗氧化剂的存在能够清除反应体系中的自由基，保护β-胡萝卜素不被氧化，阻止β-胡萝卜素的褪色。PSG及PSG-Fe、PSG-Ca的总氧化能力见图6，从图6中看出，PSG-Fe、PSG-Ca的总抗氧化能力比PSG要好。说明PSG-Fe、PSG-Ca的存在能够中和更多的亚油酸自由基和其他在体系中形成的自由基，减缓β-胡萝卜素的褪色。当前第1页1 2 3