一种猪组织染色质免疫沉淀处理方法与流程

本的发明属于家畜免疫学
技术领域：
，具体涉及一种猪组织染色质免疫沉淀(chip)处理方法。
背景技术：
：目前有关3d基因组的研究越来越火热,组蛋白修饰也成为其中的热点,其对基因表达调控起着至关重要的作用。研究3d基因组的方法有很多,如:3-c(chromosomeconformationcapture),4-c(chromosomeconformationcapture-on-chip),5-c(chromosomeconformationcapturecarboncopy),chip(chromatinimmunoprecipitation),chia-pet(chromatininteractionanalysisbypaired-endtagsequencing)等技术(bonevandcavalli2016),并且这些技术尤其chip在人与小鼠无论细胞还是组织上已经应用地成熟,而有关在猪上面的chip技术却一直没有系统的研究方法。chip方法,是指在活细胞状态下,通过甲醛固定蛋白质-dna复合物,并将其打断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,然后特异性地富集目的蛋白结合的dna片段,通过对目的片段的纯化与后期检测,从而获得蛋白质与dna相互作用的信息。猪组织水平的表观基因组学研究一直备受关注，通过组织chip-seq手段解析机体生长发育、繁殖、抗病等规律是目前本领域研究的热点和难点。由于组织前处理技术的缺乏，使得组织chip-seq的研究停滞不前，是目前该领域亟待解决的关键技术。该技术的难点在于如何得到蛋白质-dna复合物，在细胞中，通过细胞膜裂解液以及细胞核裂解液发挥作用得以释放复合物，所以在细胞水平该技术已经被广泛运用。然而，在许多生物中细胞模型并不能包括所有的研究领域，于是领域逐渐扩大到组织，并且有关人与小鼠各个组织的chip数据已经发表了很多(roadmapepigenomicsetal2015；yueetal2014)。然而在猪上，细胞系的稀少也是阻碍猪3d基因组发展的一个重要因素，所以发明一种能够在猪组织上开展的chip方法是很关键的。而在组织上开展chip的难点也在于组织的处理。技术实现要素：本发明的目的是提供一种基于染色质免疫沉淀技术(chip)的猪组织处理方法。通过对组织进行特殊处理，实现chip技术在猪组织上的成功应用。本发明方法专门针对猪组织进行优化设计，采用组织裂解液与dounce研磨器相结合，开发适合猪组织匀浆的方法、步骤和流程，使得组织裂解充分，组织悬液均匀，得到的chromatin量大质量高，后续chip-seq实验的峰图质量高。本发明通过以下方案实现本发明提供了一种优化的操作的方法，专门化用于在猪组织上开展chip实验的前期处理流程，在处理细胞方法的基础上进行了改进。由于组织的复杂结构，细胞膜裂解液采用tsankova等报道的配方(tsankovaetal2004)，1％的细胞核裂解液(fa)则是使用50mm的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)，150mm的nacl，1mm的edta，1％浓度的tritonx-100，0.1％浓度的sod和1％浓度的sds等成分。除此之外，在裂解时不仅仅需要试剂发挥作用，还需要通过机械研磨对组织进行匀浆裂解。本发明使用的研磨器材是douncehomogenizer，该器材不仅能起到研磨的作用，还能对组织进行匀浆处理，使组织达到裂解均一的效果。本发明对染色质进行打断时，是将其重悬于0.1％的fa中(含有50mm的hepes，150mm的nacl，1mm的edta，1％浓度的tritonx-100，0.1％浓度的sod和0.1％浓度的sds)中，其目的是避免dna的降解。由于研磨以及打断的过程会产生一定的热量，所以我们在多个裂解液中通过适量添加蛋白酶抑制剂，从而避免了复合体中蛋白质的降解，进而提高沉淀所得的dna的量。具体地，本发明的技术方案如下所述：一种猪组织染色质免疫沉淀(chip)处理方法，包括组织的前处理和在细胞中做染色质免疫沉淀,即chip，其特征包括下列步骤：(1)称取1g新鲜的猪组织，置于50ml离心管中，将猪组织剪成约1-3mm3的小块；(2)加入23.75ml的1％甲醛溶液，在室温下处理15min，在组织被充分晃动条件下进行交联；(3)加入1.25ml的2.5m的甘氨酸至终浓度为125mm时终止交联，在室温下处理5min，继续在交联条件下使组织晃动，5min后，在2500rpm，25℃下离心5min；(4)弃上清，取沉淀，用20ml复配的磷酸盐缓冲液重悬沉淀，用电动移液枪上下吹匀，进行清洗，然后以2500rpm，25℃下离心5min；将所得的沉淀再次用20ml复配的磷酸盐缓冲液重悬，吹匀，然后在2500rpm，25℃下离心5min，最后弃上清；其中：复配的磷酸盐缓冲液是在50ml的磷酸盐缓冲液中加入两片蛋白酶抑制剂，摇晃至溶解；(5)加入10ml复配的细胞膜裂解液重悬沉淀，并将沉淀与液体全部转移至dounce匀浆器中，将所述的dounce匀浆器提前放在冰上，在中空把手中装上冰块，在冰上慢慢研磨，避免产生太多热量，直到组织块被磨碎且成为匀浆状态；将匀浆好的组织转移至新的50ml离心管中，在5500g，4℃下离心5min，将所得的沉淀再次用10ml复配的细胞膜裂解液重悬，吹匀，然后在2500rpm，25℃下离心5min；最后一次离心前在显微镜下观察组织的裂解状态；其中：复配的细胞膜裂解液是在50ml细胞膜裂解液中加入两片蛋白酶抑制剂，摇晃至溶解；(6)用6ml，1％的细胞核裂解液重悬沉淀，并将沉淀与液体全部转移至dounce匀浆器中，置于室温下，在室温下研磨5min，将匀浆好的组织转移至新的50ml离心管中，5500g，25℃下离心5min，得到的沉淀再次用6ml，1％的细胞核裂解液重悬，吹匀，然后在2500rpm，25℃下离心5min；最后一次离心前在显微镜下观察组织的裂解状态；(7)弃上清，留白色透明状的沉淀，用15ml复配的0.1％细胞核裂解液重悬沉淀，用电动移液枪上下吹匀，进行清洗，然后5500g，4℃下离心5min，得到的沉淀再次用15ml复配的0.1％细胞核裂解液重悬，吹匀，然后在2500rpm，25℃下离心5min；其中，复配的0.1％细胞核裂解液是在50ml0.1％的细胞核裂解液溶液中加入两片蛋白酶抑制剂，摇晃至溶解；(8)用6-10ml复配的0.1％细胞核裂解液重悬，立即进行超声波裂解，超声波参数为：功率为34％；处理时间:6min；操作20s,停30s；(9)在细胞中做染色质免疫沉淀,即chip(后续步骤同细胞中的chip实验流程)；其中：1)细胞膜裂解液的配制：tris·hcl8.010mm；nacl10mm；np-400.2％；补充双蒸水195.6ml；2)1％细胞核裂解液的配制：4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)50mm；nacl150mm；edta1mm；tritonx-1001％；sod0.1％；sds1％；补充双蒸水798ml；3)0.1％细胞核裂解液的配制：4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)50mm；nacl150mm；edta1mm；tritonx-1001％；sod0.1％；sds0.1％；补充双蒸水888ml。本发明的积极效果在于：本发明中的组织处理方法操作简单，更重要的是利用本发明获得的组织裂解液可用于进一步chip实验并能得到与细胞一致甚至于更好的结果，与传统的细胞学方法对比，本发明应用的组织chip中需要处理的原材料少，成本低，并且组织chip的结果并不比常规细胞学的方法差，在使用相同量的抗体与相同量的磁珠进行实验的条件下，通过本发明制备的的组织样品得到的chip-dna明显多于常规细胞学的方法，这样有利于后续的建库实验，也为在组织上开展chia-pet实验奠定一个很好的基础。本发明使得猪3d基因组的研究不再受限于细胞，可直接取组织进行实验和获得结果。为以后深入研究猪各个组织的3d基因组结构奠定了基础。本发明可以简单、快速、有效的制备组织悬液，满足chip-seq实验的核心要求，为开展组织表观基因组学研究提供有效途径。更详细的技术方案参见《具体实施方式》。附图说明图1：本发明的猪组织处理图。附图标记说明：图1中的a图是将组织剪碎成1-3mm3的小块；图1中的b图是裂解后得到的沉淀为白色并透亮。图2：利用复配的细胞膜裂解液(clb)处理猪的组织样品的结果(放大至200x)。附图标记说明：图2中的a图是在显微镜下观察组织细胞膜裂解状态，若为肌肉组织，可看到断截的单根肌纤维；图2中的b图是显示胎盘绒毛膜的图，可看到散落的比较完整的细胞。图3：利用1％复配的细胞核裂解液(fa)处理猪的组织的结果(放大200x)。附图标记说明：图2中的a图是在显微镜下观察组织细胞核裂解状态，图2中的a图是肌肉组织，可看到断截的单根肌纤维变得分散并且更加短小；图2中的b图是胎盘绒毛膜，细胞核变得突出明显，细胞膜与细胞质都已消失。图4：利用chip数据在igv上展现的结果。附图标记说明：各种组蛋白以及rnapolymerseⅱ和ctcf的chip数据呈现很好的峰形。图5：利用chip数据质量检测结果。附图标记说明，图5中的a图和b图是ngs.plot分析结果，可以看出h3k4me3在基因的启动子区域进行了修饰，该结果与以前的研究相吻合；图5中的c图是利用spp检测chip质量的结果，可以看出本发明应用chip后样品质量是过关的。具体实施方式实施实例1一种猪组织染色质免疫沉淀(chip)处理方法，包括组织的前处理和在细胞中做染色质免疫沉淀,即chip，其特征包括下列步骤：(1)称取1g新鲜的猪组织，置于50ml离心管中，将猪组织剪成约1-3mm3的小块；(2)加入23.75ml的1％甲醛溶液，在室温下处理15min，在组织被充分晃动条件下进行交联；(3)加入1.25ml的2.5m的甘氨酸至终浓度为125mm时终止交联，在室温下处理5min，继续在交联条件下使组织晃动，5min后，在2500rpm，25℃下离心5min；(4)弃上清，取沉淀，用20ml复配的磷酸盐缓冲液重悬沉淀，用电动移液枪上下吹匀，进行清洗，然后以2500rpm，25℃下离心5min；将所得的沉淀再次用20ml复配的磷酸盐缓冲液重悬，吹匀，然后在2500rpm，25℃下离心5min，最后弃上清；其中：复配的磷酸盐缓冲液是在50ml的磷酸盐缓冲液中加入两片商购的蛋白酶抑制剂，摇晃至溶解；(5)加入10ml复配的细胞膜裂解液重悬沉淀，并将沉淀与液体全部转移至dounce匀浆器中，将所述的dounce匀浆器提前放在冰上，在中空把手中装上冰块，在冰上慢慢研磨，避免产生太多热量，直到组织块被磨碎且成为匀浆状态；将匀浆好的组织转移至新的50ml离心管中，在5500g，4℃下离心5min，将所得的沉淀再次用10ml复配的细胞膜裂解液重悬，吹匀，然后在2500rpm，25℃下离心5min；最后一次离心前在显微镜下观察组织的裂解状态；其中：复配的细胞膜裂解液是在50ml细胞膜裂解液中加入两片商购的蛋白酶抑制剂，摇晃至溶解；(6)用6ml，1％的细胞核裂解液重悬沉淀，并将沉淀与液体全部转移至dounce匀浆器中，置于室温下，在室温下研磨5min，将匀浆好的组织转移至新的50ml离心管中，5500g，25℃下离心5min，得到的沉淀再次用6ml，1％的细胞核裂解液重悬，吹匀，然后在2500rpm，25℃下离心5min；最后一次离心前在显微镜下观察组织的裂解状态；(7)弃上清，留白色透明状的沉淀，用15ml复配的0.1％细胞核裂解液重悬沉淀，用电动移液枪上下吹匀，进行清洗，然后5500g，4℃下离心5min，得到的沉淀再次用15ml复配的0.1％细胞核裂解液重悬，吹匀，然后在2500rpm，25℃下离心5min；其中，复配的0.1％细胞核裂解液是在50ml0.1％的细胞核裂解液溶液中加入两片蛋白酶抑制剂，摇晃至溶解；(8)用6-10ml复配的0.1％细胞核裂解液重悬，立即进行超声波裂解，超声波参数为：功率为34％；处理时间:6min；操作20s,停30s；(9)在细胞中做染色质免疫沉淀,即chip(后续步骤同细胞中的chip实验流程)；其中：1)细胞膜裂解液的配制：tris·hcl8.010mm；nacl10mm；np-400.2％；补充双蒸水195.6ml；2)1％细胞核裂解液的配制：4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)50mm；nacl150mm；edta1mm；tritonx-1001％；sod0.1％；sds1％；补充双蒸水798ml；3)0.1％细胞核裂解液的配制：4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)50mm；nacl150mm；edta1mm；tritonx-1001％；sod0.1％；sds0.1％；补充双蒸水888ml。主要试剂及其配制方法(1)主要试剂及来源：甲醛(cat#344198,millipore,usa)；甘氨酸(glycine)(cat#50046,sigma,usa)；pbs(cat#sh3025601,hyclone,usa)；蛋白酶抑制剂即片剂(completeminiedta-freeproteininhibitor)，货号cat#4693159001,roche,usa)；tris·hcl8.0(货号cat#am9856,ambion,usa)；nacl(货号cat#am9760g,ambion,usa)；nonidetp40substitute(cat#11754599001,roche,usa)；4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)(cat#15630-080,life,usa)；edta(cat#am9261,ambion,usa)；tritonx-100(cat#0694,amresco,usa)；脱氧胆酸钠(sod)(sodiumdeoxycholate)(cat#30970-500g,sigma,usa)；十二烷基硫酸钠(sds)(cat#am9822,ambion,usa)；(2)、试剂的配制方法：1)1％甲醛的配制：取储存浓度为37％的甲醛0.675ml，加pbs至终体积25ml。放置室温待用。2)2.5mglycine的配制：46.9g甘氨酸(glycine)粉末溶于250ml水中，摇匀，室温保存。3)细胞膜裂解液(clb)的配制见表1(配制后在4℃下储存)。表1：细胞膜裂解液配制储存浓度工作浓度200ml(ml)tris·hcl8.01m10mm2nacl5m10mm0.4np-4020％0.2％2双蒸水195.64)1％细胞核裂解液(fa)的配制见表2(配制后在4℃下储存)。表2：1％细胞核裂解液配制储存浓度工作浓度1l(ml)hepes1m50mm50nacl5m150mm30edta0.5m1mm2tritonx-100100％1％10sod10％0.1％10sds10％1％100双蒸水7985)0.1％细胞核裂解液fa的配制见表3(配制后在4℃下储存)表3：0.1％细胞核裂解液的配制储存浓度工作浓度1l(ml)hepes1m50mm50nacl5m150mm30edta0.5m1mm2tritonx-100100％1％10sod10％0.1％10sds10％0.1％10双蒸水888具体应用步骤(1)称取1g新鲜的猪组织，置于50ml离心管中，将猪组织剪成约1-3mm3的小块(见图1中的a图)；(2)加入23.75ml的1％甲醛溶液，在室温下处理15min，在组织被充分晃动条件下进行交联；(3)加入1.25ml的2.5m的甘氨酸至终浓度为125mm时终止交联，在室温下处理5min，继续在交联条件下使组织晃动，5min后，在2500rpm，25℃下离心5min；(4)弃上清，取沉淀，用20ml复配的磷酸盐缓冲液重悬沉淀，用电动移液枪上下吹匀，进行清洗，然后以2500rpm，25℃下离心5min；将得到的沉淀再次用20ml复配的磷酸盐缓冲液重悬，吹匀，然后以2500rpm，25℃下离心5min，最后弃上清；其中：复配的磷酸盐缓冲液是在50ml的磷酸盐缓冲液(pbs)中加入两片商购的蛋白酶抑制剂，摇晃至溶解；(5)加入10ml复配的细胞膜裂解液重悬沉淀，并将沉淀与液体全部转移至dounce匀浆器中，将所述的dounce匀浆器提前放在冰上，在中空把手中装上冰块，在冰上慢慢研磨，避免产生太多热量，直到组织块被磨碎且成为匀浆状态；将匀浆好的组织转移至新的50ml离心管中，在5500g，4℃下离心5min，得到的沉淀再次用10ml复配的细胞膜裂解液重悬，吹匀，然后以2500rpm，25℃下离心5min；最后一次离心前在显微镜下观察组织的裂解状态(见图2)；其中：复配的细胞膜裂解液是在50ml细胞膜裂解液(clb)中加入两片蛋白酶抑制剂，摇晃至溶解；(6)用6ml，1％的细胞核裂解液重悬沉淀，并将沉淀与液体全部转移至dounce匀浆器中，置于室温下，在室温下研磨5min，将匀浆好的组织转移至新的50ml离心管中，5500g，25℃下离心5min，得到的沉淀再次用6ml，1％的细胞核裂解液重悬，吹匀，然后在2500rpm，25℃下离心5min；最后一次离心前在显微镜下观察组织的裂解状态，结果见图3所述；(7)弃上清，留沉淀，此时沉淀应该为白色透明状(见图1中的b图)。用15ml复配的0.1％细胞核裂解液重悬沉淀，用电动移液枪上下吹匀，进行清洗，然后5500g，4℃下离心5min，得到的沉淀再次用15ml复配的0.1％细胞核裂解液重悬，吹匀，然后然后以2500rpm，25℃下离心5min；其中，复配的0.1％细胞核裂解液是在50ml0.1％的细胞核裂解液溶液中加入两片蛋白酶抑制剂，摇晃至溶解；(8)用6-10ml复配的0.1％细胞核裂解液重悬，立即进行超声波裂解，超声波参数为：功率(amp)为34％；时间(time)为6min；操作(on)为20s,停止(off):30s；在细胞中做染色质免疫沉淀,即chip(后续步骤同细胞中的chip实验流程)；其中：1)细胞膜裂解液的配制：tris·hcl8.010mm；nacl10mm；np-400.2％；补充双蒸水195.6ml；2)1％细胞核裂解液的配制：4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)50mm；nacl150mm；edta1mm；tritonx-1001％；sod0.1％；sds1％；补充双蒸水798ml；3)0.1％细胞核裂解液的配制：4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)50mm；nacl150mm；edta1mm；tritonx-1001％；sod0.1％；sds0.1％；补充双蒸水888ml。数据分析采用分析chip数据特定的的方法与共享软件对产生的数据进行检测与分析，分析结果如下：(1)数据igv的呈现对得到的组织chip数据进行分析，将结果呈现在igv上，粗略查看每个chip的峰形，结果见图4。(2)数据质量的分析用spp(kharchenkoetal2008)和ngs.plot(shenetal2014)软件对组织chip数据进行传统的质量检测分析，查看组织chip质量的好坏，结果见图5。从以上数据分析结果来看，通过本发明的处理方法获得的chip数据无论在峰形还是分布位置上，都与已有的研究报道相吻合，并且数据质量过关。这就说明可以将本发明的方法应用在猪组织上开展chip实验。主要参考文献：1.bonevb,cavallig.organizationandfunctionofthe3dgenome.natrevgenet,2016,17(11):661-678；2.kharchenkopv,tolstorukovmy,parkpj.designandanalysisofchip-seqexperimentsfordna-bindingproteins.natbiotechnol,2008,26(12):1351-1359；3.roadmapepigenomicsc,kundajea,meulemanw,ernstj,bilenkym,yena,heravi-moussavia,kheradpourp,zhangz,wangj,zillermj,aminv,whitakerjw,schultzmd,wardld,sarkara,quong,sandstromrs,eatonml,wuycetal.integrativeanalysisof111referencehumanepigenomes.nature,2015,518(7539):317-330；4.shenl,shaon,liux,nestlere.ngs.plot:quickminingandvisualizationofnext-generationsequencingdatabyintegratinggenomicdatabases.bmcgenomics,2014,15:284；5.tsankovanm,kumara,nestlerej.histonemodificationsatgenepromoterregionsinrathippocampusafteracuteandchronicelectroconvulsiveseizures.journalofneuroscience,2004,24(24):5603-5610；6.yuef,chengy,breschia,vierstraj,wuw,rybat,sandstromr,maz,davisc,popebd,sheny,pervouchinedd,djebalis,thurmanre,kaulr,rynese,kirilushaa,marinovgk,williamsba,troutdetal.acomparativeencyclopediaofdnaelementsinthemousegenome.nature,2014,515(7527):355-364。当前第1页12