草鱼呼肠孤病毒的核酸适配体及其衍生物、筛选方法和应用与流程

本发明属于分子生物学领域，更具体地，涉及草鱼呼肠孤病毒的核酸适配体及其衍生物、筛选方法和应用。

背景技术：

草鱼呼肠孤病毒(grasscarpreovirus,gcrv)被公认为是水生呼肠孤病毒中致病力最强的毒株，引起草鱼出血病，造成鱼体大量死亡，死亡率高达85％以上。迄今为止，鱼体一旦被gcrv感染，没有有效的抗病毒治疗方法。虽然疫苗可以有效的预防该病，但是近年来不断出现病毒变异株，单一化的疫苗使用受到了限制。因此，这些疾病的预防在草鱼养殖中仍然是一个巨大的挑战。

核酸适配体是一种可以特异性结合靶标的dna或者rna寡核苷酸；由于其分子量较小，可化学合成、稳定性好、没有毒性，与靶标亲和力高等优点，有望应用于分子检测领域。此外，只有少部分核酸适配体具有阻断病毒与宿主细胞结合并抑制病毒感染的能力，这些具有抗病毒能力的核酸适配体在病毒性疾病治疗中有非常广阔的前景。

然而，核酸适配体经过了二十多年的发展，至今并没有得到广泛的应用，其原因在于：核酸适配体的筛选需要从一个高容量的随机库中筛选出针对靶标的适配体，其筛选过程十分困难，要获得某种靶标的适配体，往往需要不断的摸索和创造，才能获得的具有良好应用价值的核酸适配体序列。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供草鱼呼肠孤病毒的核酸适配体及其衍生物、筛选方法和应用。

本发明所采取的技术方案是：

草鱼呼肠孤病毒的核酸适配体，其核苷酸序列为下述seqidno:1～10所示序列的任意一条序列：

ft1：5’-catttttcctttgcttgccgagctccagtgtatca-3’(seqidno:1)；

ft2：5’-aattgtctgttacctctcggcactctaacacaatg-3’(seqidno:2)；

ft3：5’-gattgtgcaacgttcctgtcgtgttgtccatagat-3’(seqidno:3)；

ft4：5’-ttcttattgacttttgggtgaatgtctcttatat-3’(seqidno:4)；

ft5：5’-tcatagtgggcggtctttgcagtcgttactctcca-3’(seqidno:5)；

ft6：5’-cattgtgttatacgagaatgactccgttaaaatt-3’(seqidno:6)；

ft7：5’-gacagtatactatattttttctaaatgtttctttt-3’(seqidno:7)；

ft8：5’-taccgagtggtagaatttgcttggattatttttta-3’(seqidno:8)；

ft9：5’-gattgtgcaacgttcctgtcgtgttgtccatagat-3’(seqidno:9)；

ft10：5’-tttttaaatttttgttcttattcctatcttcaaa-3’(seqidno:10)。

核酸适配体，其包含以下三种序列中的任意一种：

(1)与seqidno:1～10所示的核酸适配体序列的序列同源性在60％以上的序列；

(2)能够与seqidno:1～10所示的核酸适配体的序列进行杂交的序列；

(3)由seqidno:1～10所示的核酸适配体的序列反转录的序列。

核酸适配体衍生物，所述衍生物是以上所述的核酸适配体的1个或多个核苷酸进行衍生获得：衍生的方式为下述修饰或化学改造或连接标记物中的一种或多种：聚乙二醇修饰、锁核酸修饰、磷酸化修饰；甲基化修饰；氨基化修饰、巯基化修饰、同位素化修饰、连接荧光标记物、连接放射性物质、连接治疗性物质、连接生物素、连接地高辛、连接纳米发光材料、连接酶标记。

如上所述的核酸适配体或核酸适配体衍生物在制备预防和/或治疗草鱼呼肠孤病毒感染药物中的应用。

如上所述的核酸适配体或核酸适配体衍生物在制备草鱼呼肠孤病毒分子探针、检测试剂或靶向介质中的应用。

草鱼呼肠孤病毒的核酸适配体的筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)合成ssdna随机适配体库和pcr扩增引物：

ssdna随机适配体库：

5’-atccagagtgacgcagca-(35n)-actaagccaccgtgtcca-3’；

pcr扩增引物：

正向引物：5’-atccagagtgacgcagca-3’；

反向引物：5’-actaagccaccgtgtcca-3’，所述反向引物5’端用生物素标记；

(2)病毒纯化：

分别将草鱼呼肠孤病毒感染的fhm细胞及未感染的fhm细胞，进行反复冻融和梯度离心，分别获得草鱼呼肠孤病毒液和fhm细胞液，备用；

(3)selex筛选：

正向筛选：

将步骤(1)中的ssdna随机适配体库进行变性处理，随后快速置于冰上放置8～15min，加入到绑定有步骤(2)草鱼呼肠孤病毒液的96孔板中，孵育50～70min；用缓冲液洗脱2～4次，去除未绑定序列，再进行变性处理，回收绑定的序列；

以绑定的序列作为模板，采用步骤(1)中的引物，进行pcr扩增，得到ssdna文库；

将ssdna文库替代前述的ssdna随机适配体库，进行下一轮筛选；

当正向筛选重复4～5轮后，进入反向筛选；

反向筛选：

将上一轮正向筛选获得的ssdna文库加入到绑定有步骤(2)fhm细胞液的96孔板中，孵育50～70min；回收未绑定序列，用于替代正向筛选步骤中的ssdna随机适配体库，再重复正向筛选；

重复筛选至获得草鱼呼肠孤病毒的核酸适配体序列，终止筛选。

作为上述筛选方法的优选，步骤(3)中，随筛选轮数的增加，孵育温度由2～6℃逐步提高至26～30℃。

作为上述筛选方法的优选，步骤(2)中，反复冻融条件为：–85～–75℃反复冻融2～4次，梯度离心条件为2500～3500rpm/min，13～17min；4500～5500rpm/min，13～17min；7500～8500rpm/min，18～22min；9500～10500rpm/min，28～32min。

作为上述筛选方法的优选，变性处理的条件是94～96℃作用5～10min。

作为上述筛选方法的优选，pcr扩增反应条件为：94℃5min，94℃30s，53℃30s，72℃20s，16个循环，72℃7min。

本发明的有益效果是：

本发明的草鱼呼肠孤病毒的核酸适配体是针对gcrv病毒的ssdna库，应用selex方法获得的核酸适配体，采取了纯化的病毒，逐步提高孵育温度，增加反向筛选等技术改进使针对靶标的序列更容易富集，最终筛选到针对gcrv的适配体，其核苷酸序列为seqidno:1～10所示的任意一条序列，经过实验表明：以上核酸适配体对细胞活力没有明显影响，能形成茎-环的二级结构，甚至可以抑制gcrv的感染，其中ft6和ft7适配体的抗病毒效果最佳，其形成的都是从约十三个寡核苷酸到第二十七个寡核苷酸的茎环。

本发明的草鱼呼肠孤病毒的核酸适配体可特异性的抑制抑制gcrv感染，具有制备预防和治疗草鱼呼肠孤病毒感染药物的应用前景，同时，根据适配体的自身特性，也具有制备草鱼呼肠孤病毒分子探针、检测试剂或靶向介质的应用前景。

附图说明

图1：selex技术示意图；

图2：核酸适配体的二级结构图，图a为ft1～5核酸适配体的二级结构，图b为ft6～10核酸适配体的二级结构；

图3：实施例3的mtt法检测细胞活力结果；

图4：核酸适配体对gcrv病毒的抑制作用，图a为核酸适配体和gcrv同时加入细胞；图b为gcrv感染1小时后加入核酸适配体；图c为核酸适配体提前加入细胞，1小时后gcrv感染，*表示p<0.05。

具体实施方式

本发明中，所述的核酸适配体序列可选自天然存在或人工合成的序列，或任何其他来源的同样的序列。

本发明中，所述的可以为：

(1)seqidno：1～10所示的任意一条序列；

(2)与seqidno：1～10所示的任意一条序列的序列同源性在60％以上的序列；

(3)能够与seqidno：1～10所示的任意一条序列进行杂交的序列；

(4)由seqidno：1～10所示的任意一条序列反转录的序列。

本发明中，核酸适配体衍生物是通过以上核酸适配体序列的1个或多个核苷酸进行衍生获得：所述衍生的方式为下述修饰或化学改造或连接标记物中的一种或多种：聚乙二醇(peg)修饰、锁核酸修饰、磷酸化修饰；甲基化修饰；氨基化修饰、巯基化修饰、同位素化修饰、连接荧光标记物、连接放射性物质、连接治疗性物质、连接生物素、连接地高辛、连接纳米发光材料、连接酶标记。其中，peg修饰可以克服核酸适配体在应用中存在一些弊端，如核酸适配体由于分子量太小而易被酶降解；在机体内也容易被巨噬细胞吞噬清除，半衰期短，不利于适配体的后期应用的弊端。本发明通过peg5000对适配体进行修饰，提高了筛选适配体的稳定性，利于适配体后期应用与研究。

本发明的selex筛选在每轮筛选中，逐步提高孵育温度，从2～6℃逐步提高到26～30℃，其目的是在低温下利于形成结构和靶标结合，逐步提高温度是增加筛选条件的苛刻性，使特异性的适配体留下，非特异性的排除。

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中的实验材料如无特殊说明，均是从常规的生化试剂公司购买所得到。

本发明所用的gcrv毒株和胖头鱥肌肉细胞(fhm细胞)由珠江水产研究所鱼病室提供，其中，fhm细胞28℃培养于含10％的胎牛血清m199培养基；gcrv毒株置于–80℃备用。

实施例1、草鱼呼肠孤病毒的核酸适配体的筛选

利用指数富集配体系统进化技术(selex技术)进行草鱼呼肠孤病毒的核酸适配体的筛选，selex技术示意图参见图1，具体实施方法如下：

(1)病毒纯化

将gcrv接种于fhm细胞置于28℃培养直至80％左右出现病变收获，收获后于–80℃反复冻融3次，细胞碎片按梯度离心除去：3000rpm/min，15min；5000rpm/min，15min；8000rpm/min，20min；10000rpm/min，30min，获得gcrv病毒液。同时未感染的fhm细胞作为对照，用于筛选过程的反向筛选，也进行相同条件反复冻融和梯度离心的处理，获得fhm细胞液，–80℃保存备用。

(2)合成selex筛选的库和引物

20nmol的ssdna随机适配体库：中间为35个碱基的随机序列，两端各为18个碱基的固定序列：5′-atccagagtgacgcagca-3′和5′-actaagccaccgtgtcca-3′；两端序列用于pcr扩增，pcr扩增引物为：正向引物：5’-atccagagtgacgcagca-3’(seqidno:11)和反向引物：5’-actaagccaccgtgtcca-3’(seqidno:12)，反向引物5′端用生物素标记。

(3)selex筛选

将步骤(2)的gcrv病毒液按100ul/孔加入96孔板4℃，过夜，然后细胞用pbs洗脱3次，除去未绑定的序列，获得绑定有纯化的gcrv病毒的96孔板；将步骤(1)ssdna随机适配体库于95℃作用5min使其变性，然后快速置于冰上放置10min，加入到绑定有gcrv病毒液的96孔板中，4℃孵育60min；用pbs洗脱96孔板3次，除去未绑定的序列，然后96孔板于95℃作用10min，使绑定序列解离，回收绑定的序列。

绑定的序列作为模板进行pcr扩增，采用步骤(1)所示的pcr扩增引物，按反应条件扩增：94℃5min，94℃30s，53℃30s，72℃20s，16个循环，72℃7min，分离获得ssdna文库；

将ssdna文库替代前述的ssdna随机适配体库，进行下一轮筛选；

当正向筛选重复4轮后，进入反向筛选。

(4)反向筛选

将上一轮正向筛选获得的ssdna文库加入到绑定有步骤(2)fhm细胞液的96孔板中，4℃孵育60min；回收未绑定序列，用于替代正向筛选步骤中的ssdna随机适配体库，再重复正向筛选；

(5)重复筛选

前4轮为正向筛选，然后在第5轮，第10轮，第15轮进行反向筛选，筛选的温度逐渐提高，从4℃逐渐提高到28℃，重复筛选15轮，终止筛选，将pcr纯化产物连接于peasy-t1载体，转化后挑取单菌落进行测序，测序并分析获得适配体序列，如下所示：

ft1：5’-catttttcctttgcttgccgagctccagtgtatca-3’(seqidno:1)；

ft2：5’-aattgtctgttacctctcggcactctaacacaatg-3’(seqidno:2)；

ft3：5’-gattgtgcaacgttcctgtcgtgttgtccatagat-3’(seqidno:3)；

ft4：5’-ttcttattgacttttgggtgaatgtctcttatat-3’(seqidno:4)；

ft5：5’-tcatagtgggcggtctttgcagtcgttactctcca-3’(seqidno:5)；

ft6：5’-cattgtgttatacgagaatgactccgttaaaatt-3’(seqidno:6)；

ft7：5’-gacagtatactatattttttctaaatgtttctttt-3’(seqidno:7)；

ft8：5’-taccgagtggtagaatttgcttggattatttttta-3’(seqidno:8)；

ft9：5’-gattgtgcaacgttcctgtcgtgttgtccatagat-3’(seqidno:9)；

ft10：5’-tttttaaatttttgttcttattcctatcttcaaa-3’(seqidno:10)。

实施例2、核酸适配体的空间结构预测

将上述筛选出序列进行分析以及重复出现的频率确定的10个核酸适配体预测其空间结构：根据mfold软件的能量原理选择最小能量结构为适配体的最稳定结构。

结果如图2所示，所有适配体可以形成茎-环结构，其形成的都是从约十三个寡核苷酸到第二十七个寡核苷酸的茎环，该结构可能是适配体结合靶标并发挥作用的关键性位点。

实施例3、核酸适配体对fhm细胞活力的影响

将fhm细胞接种于96孔板，待细胞生长至80％时，分别加入0μm至10μm的浓度的适配体ft1，28℃培养48小时，加入20μl/孔mtt溶液，28℃培养4小时，使用elisa板读数器在490nm读数。

实验结果如图3所示，核酸适配体ft1按0um到10um浓度添加到细胞后，细胞活力均没有显著变化，说明核酸适配体对宿主细胞不会产生毒副作用，有利于后期制备药物及检测试剂的应用。

实施例4、核酸适配体抑制gcrv感染实验

(1)peg修饰

0.1m的peg5000，0.4m的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(edc.hcl)和0.1m的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，在水中混合并以80rpm温育15分钟；然后将核苷酸序列如seqidno:1～10所示的核酸适配体分别加入到混合物中，反应在80rpm下继续进行4小时，获得peg修饰后的每条核酸适配体，保存备用。

(2)gcrv感染实验

将fhm细胞接种于96孔板，待生长至80％时，进行以下三组实验：gcrv(moi＝0.5)和peg修饰的核酸适配体(200nm)同时加入fhm细胞；fhm细胞gcrv(moi＝0.5)感染1小时后，将peg修饰的适配体(200nm)加入培养基中；细胞与peg修饰的适配体(200nm)孵育1小时后，用gcrv(moi＝0.5)感染fhm细胞。最后，将fhm细胞在28℃培养48小时，并使用reed-muench方法测定病毒滴度。

考察核酸适配体对病毒复制的抑制作用，结果如图4所示，图c中，当适配体提前1个小时加入到细胞，然后再加入病毒时，核酸适配体抑制病毒复制能力显著，其中核酸适配体ft6和ft7对gcrv病毒的抑制效果显著，说明本发明核酸适配体可用于制备预防gcrv感染的药剂；此外，图b显示病毒感染1小时后加入适配体，也有一定的抑制病毒复制能力，说明核酸适配体可用于制备治疗gcrv感染的药剂。

sequencelisting

<110>中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120>草鱼呼肠孤病毒的核酸适配体及其衍生物、筛选方法和应用

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