本发明属于细胞
技术领域：
：，更具体涉及一种团头鲂骨组织细胞的培养方法，适用于日后有关骨组织细胞分化过程、骨骼发育、骨组织矿化过程、基因筛选与功能分析等方面的研究。技术背景鱼类相较于哺乳动物而言具有很多技术性的优点，因此越来越多的研究学者选择用鱼类作为研究模型(请见:rafaelms,marquescl,parameswaranv,etal.fishbone-derivedcelllines:analternativeinvitrocellsystemtostudybonebiology[j].journalofappliedichthyology,2010,26(26):230-234)，截止目前一些鱼类已作为研究模型成功用以骨骼发育及相关疾病的研究。现今国外已有利用组织块培养法进行鱼类骨组织细胞培养的报道，如vijayakumar等利用颌部、椎骨及鳃弓组织块成功培养了斑马鱼骨组织细胞(请见:vijayakumarp,laizév,cardeiraj,etal.developmentofaninvitrocellsystemfromzebrafishsuitabletostudybonecelldifferentiationandextracellularmatrixmineralization[j].zebrafish,2013,10(4):500-509.)；marques等以鳃弓及椎骨组织块为材料培养了金头鲷钙化组织细胞(请见:marquescl,rafaelms,cancelaml,etal.establishmentofprimarycellculturesfromfishcalcifiedtissues[j].cytotechnology,2007,55(1):9-13.)；另外rafael等利用颌部及脊柱培养了大西洋鲑的骨组织细胞(请见：rafaelms,marquescl,parameswaranv,etal.fishbone-derivedcelllines:analternativeinvitrocellsystemtostudybonebiology[j].journalofappliedichthyology,2010,26(26):230-234.)。目前国内还无针对鱼类骨组织细胞培养的相关报道。骨组织细胞的主要成分包括骨细胞(osteocyte)及成骨细胞(osteoblast,ob)。成骨细胞是一种结缔组织细胞，一般存在于骨小梁的表面及骨膜内侧，是骨生成代谢过程中起关键作用的细胞，其主要介导骨细胞的生成，使骨的生成维持在动态平衡。骨细胞位于胞外矿物质沉积形成的骨陷窝内，由成骨细胞分化而来，是骨组织中机械应力的主要感受器。国内对哺乳动物如人类，小鼠成骨细胞及骨细胞的培养技术已经较成熟，通常选用酶消化法消化组织分离出单细胞进行培养(请见：谢艳芳,陈克明,马小妮,等.大鼠颅骨成骨细胞和骨细胞的分离纯化与比较研究[j].解放军医药杂志,2015(3):1-5.陈建庭,杨德鸿,景宗森,等.人成骨细胞培养方法改进及细胞成骨特性观察[c]//全国老年骨质疏松专题学术研讨会论文汇编.2000)。由于细胞培养通常受到个体不同组织及年龄大小的限制，在鱼类骨骼生长发育相对快速的幼鱼时期，个体还较小，组织也相对较小，利用酶消化法可能会对组织及细胞造成损伤，这一特点对鱼类骨组织细胞培养起到了一定的限制作用。团头鲂(megalobramaamblycephala)，俗称武昌鱼，隶属于鲤形目(cypriniformes)，鲤科(cyprinidae)，鲌亚科(culterinae)，鲂属(megalobrama)，俗称武昌鱼，是我国特有的重要草食性经济鱼类之一。其具有存活率高、生长快、营养价值高和易捕捞的特点。目前关于团头鲂细胞培养方面的研究还很少，仅有祝冬梅在2013年成功建立了团头鲂肌肉、鳍条和心脏细胞系(请见:祝冬梅.团头鲂三种细胞系的建立、鉴定及其初步应用[d].华中农业大学,2013)。团头鲂骨组织细胞系(megalobramabonecells,mbcs)的建立可为日后鱼类骨组织生长代谢的体外研究提供一定的材料基础。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种团头鲂骨组织细胞培养的方法，方法易行，操作简便，解决了由于样品个体大小限制及胰蛋白酶消化法使用受限等问题。采用组织块法获得原代骨组织细胞，为日后研究鱼类骨骼生长发育等相关研究提供基础材料。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术方案：其技术构思是：一种团头鲂原代骨组织细胞分离培养方法，取团头鲂的尾椎骨及肋骨及周围结缔组织，在细胞培养瓶中用培养基浸泡组织块，使细胞从组织块内迁出；待汇合度达到80％后，用胰蛋白酶消化收集贴壁生长的细胞，即获得团头鲂原代骨组织细胞；在此基础上，将细胞重悬后，进行传代培养。一种团头鲂骨组织细胞培养的方法，其步骤是：1)选取3月龄生长状况良好的团头鲂为材料，实验前用体积比为0.01％高锰酸钾溶液浸泡20分钟。放入无菌操作台内，用75％酒精对鱼体进行消毒。2)用消毒过的手术刀剪去尾鳍，剥离鱼体表皮肤后，在解剖显微镜下剥离尾椎及肋骨周围的肌肉，仅取靠近团头鲂(新鲜或已死亡)尾椎和肋骨的结缔组织。3)pbs(ph＝7.4)冲洗3次后，用眼科剪将组织块剪碎至2mm3。将组织块在胎牛血清中润湿后，用镊子将其放入培养瓶底部，25cm2培养瓶约接种20个组织块；4)将培养瓶放入28℃培养箱倒置培养4小时后，轻轻翻面，使组织块慢慢浸润在m-199培养基[含体积分数为1％双抗、20％胎牛血清、表皮细胞生长因子(egf)25ng/ml、人碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)25ng/ml]中；5)每日观察细胞迁出情况，大概3天更换一次培养基，每次换液量为1/3。6)20天左右细胞汇合度达到80％后进行胰蛋白酶消化传代，一瓶细胞1：1传至两个细胞培养瓶，获得团头鲂原代骨组织细胞；7)待团头鲂原代骨组织细胞的汇合度达到70～80％时使用胰蛋白酶进行细胞的消化传代，细胞离心后重悬，接种于两个新的培养瓶中继续培养，获得传代细胞。作为可选方式，在上述方法中，利用骨细胞及成骨细胞特性采用碱性磷酸酶(alp)、茜素红(alizarinred)染色、vonkossa’s染色、giemsa染色、鱼骨钙素elisa检测对所得原代细胞进行鉴定。作为可选方式，在上述方法中，取第10代细胞，秋水仙素处理后，统计中期分裂相染色体数目并制作染色体分析模型。作为可选方式，在上述方法中，提取传代细胞rna，对成骨细胞分化起重要作用的转录因子runx2a/b及osterix进行半定量及定量检测。采用组织块法培养团头鲂骨组织细胞，方法简单易行且成本较低，解决了因样品大小而造成的技术困难，并且避免了酶消化培养法中胰蛋白酶给组织块带来的伤害。通过此方法，可培养纯度较高的骨组织细胞，细胞的生物学特性稳定且增殖能力强，为日后关骨组织细胞分化过程、骨骼发育、骨组织矿化过程、基因筛选与功能分析等方面的研究提供了基础材料。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：以团头鲂3月龄幼鱼尾椎骨及肋骨及周围结缔组织为实验材料，采用组织块法培养骨组织细胞，有效避免了酶消化培养方法对细胞的伤害。获取的团头鲂骨组织细胞，细胞呈梭形或多边形，轮廓清晰。细胞生物学特性鉴定结果显示细胞碱性磷酸酶，钙化结节茜素红染色，矿化结节vonkossa’s法染色均呈阳性结果，表明所培养的细胞具有典型骨细胞及成骨细胞生物学活性；鱼骨钙素elisa试剂盒检测实验细胞中骨钙素含量为997.25ng/l；另外，荧光定量pcr结果显示特异性调节成骨细胞分化的转录因子runx2a、runx2b和osterix基因在团头鲂骨组织细胞系中均有表达，且runx2b和osterix的表达量显著高于团头鲂肌肉细胞系(p<0.05)。获得具有良好的增殖活性，生长速度快，且能连续传代增殖的团头鲂骨组织细胞系(megalobramabonecells,mbcs)，为日后鱼类骨组织体外实验研究奠定了一定基础。附图说明图1为一种组织块培养20天后在放大倍数为10倍的光镜下拍的照片示意图；此时可见大量细胞已从组织块边缘迁出；图2为一种细胞经传代2天后在10倍的光镜下拍摄的照片示意图；图3为一种采用茜素红染色后放大倍数为10倍的光镜下拍摄的照片示意图，钙化结节被染成红色(箭头所指为阳性区域)；图4为一种采用碱性磷酸酶试剂盒染色后在放大倍数为10倍的光镜下拍摄的照片示意图，阳性区域胞内可见棕色沉淀(箭头所指为阳性区域)；图5为一种采用vonkossa’s染色后在放大倍数为10倍的光镜下拍摄的照片示意图，矿化结节被染成黑色(箭头所指为阳性区域)；图6为一种采用geimsa染色后在放大倍数为10倍的光镜下拍摄的照片示意图，可见细胞核被染成深蓝色，位于细胞中央；图7为一种采用秋水仙素处理后，染色体中期分裂相图及制备的染色体模型图，计数得骨组织细胞中期分裂相的染色体数目2n＝48，进行核型分析后结果显示，团头鲂骨组织细胞48条染色体中有13对中部着丝粒染色体(m)，9对亚中部着丝粒染色体(sm)及2对亚端部着丝粒染色体(st)，核型公式为2n＝26m+18sm+4st，符合团头鲂的染色体特征(请见：祝冬梅.团头鲂三种细胞系的建立、鉴定及其初步应用[d].华中农业大学,2013)；图8为一种采用鱼骨钙素(ot)elisa试剂盒检测所培养细胞内的骨钙素含量的标准曲线示意图，计算可得细胞样品中鱼骨钙素浓度平均值为997.25ng/l；图9为一种runx2a，runx2b和osterix在样品中的半定量表达结果(β-actin为内参基因)示意图，可见三个基因在团头鲂骨组织细胞中均有一定表达；图10为一种runx2a，runx2b和osterix在样品及团头鲂肌肉细胞中的定量表达结果，结果显示runx2a的表达最为丰富，runx2b及osterix次之，且团头鲂骨组织细胞各基因的表达量显著高于团头鲂肌肉细胞系(p<0.05)，此结果表明根据本实验方法所培养的团头鲂骨组织细胞具有较高的纯度。具体实施方式实施例1：一种团头鲂骨组织细胞培养的方法，其步骤是：1)选取3月龄生长状况良好的团头鲂为材料(新鲜或已死亡)，实验前用体积比为0.01％高锰酸钾溶液浸泡20分钟。放入无菌操作台内，用75％(体积比)酒精对鱼体进行消毒；2)用消毒过的手术刀在无菌条件下剪去尾鳍，自泄殖孔后方向上切下整个尾部，镊子小心剥离皮肤后，将组织块浸润在pbs中，在解剖显微镜下用眼科镊及手术刀剥离尾椎及肋骨周围的肌肉，取靠近团头鲂(新鲜或已死亡)尾椎和肋骨的结缔组织；3)在培养皿内使用pbs冲洗组织块3次后，用眼科剪将其剪碎至2mm3；将组织块逐一在胎牛血清中润湿后，用镊子将其小心放入培养瓶底部，25cm2培养瓶约接种20个组织块；4)放入28℃培养箱倒置培养4小时后，轻轻翻面，使组织块慢慢浸润在m-199培养基(含1％双抗、20％胎牛血清、25ng/mlegf、25ng/mlbfgf)中；5)每日观察细胞迁出情况，大概3天更换一次培养基(m-199培养基)，每次换液量为1/3；6)20天后可观察到细胞逐渐迁移占据大部分底部(图1)，单个细胞呈梭形或多边形，轮廓清晰；7)待瓶底贴壁细胞汇合度达到80％后，使用体积分数为0.25％的胰蛋白酶消化传代，一瓶细胞传至两个细胞培养瓶，获得团头鲂原代骨组织细胞(图2)；8)待团头鲂原代骨组织细胞的汇合度达到70～80％时继续使用胰蛋白酶进行细胞的消化传代，细胞离心后重悬，接种于两个新的培养瓶中继续培养；9)取第二代骨组织细胞，接种于6孔细胞培养板，2天待细胞汇合度达到80％时，经茜素红钙化结节染色(图3)、碱性磷酸酶试剂盒染色(图4)、vonkossa’s矿化结节染色(图5)及giemsa细胞核染色(图6)对所培养的骨组织细胞进行鉴定。染色结果显示团头鲂骨组织细胞细胞核位于细胞中央，生物学特性鉴定结果呈大量阳性区域；10)取第10代团头鲂骨组织细胞，传代2天后，更换5ml新鲜培养液，加入0.1ml秋水仙素(1μg/ml)培养12小时，胰蛋白酶消化重悬后，进行染色体制片，高倍显微镜下观察并统计染色体数目(图7)；11)根据上海双赢生物鱼骨钙素elisa试剂盒使用说明，利用机械法(反复冻融)破坏第5代骨组织细胞，释放细胞内成分。使用鱼骨钙素elisa试剂盒对实验细胞骨钙素含量进行测定。抗体-抗原-酶标抗体复合物使底物显色后，使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度，通过标准曲线即可计算得到样品中鱼骨钙素浓度(图8)；12)取汇合度达到80％的第5代骨组织细胞，pbs洗涤两次后，每个25cm2培养瓶内加入1mltrizol，混匀后室温(20-25℃)静置5分钟。提取rna，琼脂糖电泳鉴定，紫外分光光度计测定od值。将rna反转录后，以β-actin为内参，利用primerpremier5.0合成runx2a，runx2b，osterix上下游引物(表1)，通过琼脂糖电泳条带亮度初步判断基因表达情况(图9)。采用sybrgreenⅱdye试剂，按照荧光定量pcr操作指南运行，利用2－△△ct法(请见：livakkj,schmittgentd.analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativepcrandthe2-△△ctmethod[j].methods,2001,25(4):402-408.)计算，得到基因在骨组织细胞内的表达情况(图10)。表1基因表达所用引物及pcr信息当前第1页12当前第1页12