一种六色荧光STR分型方法和系统与流程

本发明涉及一种分型方法和系统，尤其涉及一种六色荧光str分型方法和系统。
背景技术：
：目前法医str检测均使用成熟的荧光标记str复合扩增试剂盒，主要针对案件及dna数据库建设两方面的新需求来进行研究。从案件角度来讲，目前公安机关dna办案的难点就是如何用尽量少的检材获得更多正确的遗传信息，在一些特殊案件(如：强奸、轮奸案)及亲权鉴定(如：父女、姐妹亲缘关系鉴定)案件中还要进行y-str、x-str等遗传标记；另一方面随着我国dna数据库规模的不断扩大，为有助于更清楚地判别检索出来的匹配数据，迫切需要引入更多的str基因座。在打拐专项行动中，由于str基因座突变现象的存在，常常需要检验更多的str基因座才能作出更加明确的判定。因此，在同一复合扩增体系中整合更多地str基因座是目前主流的发展方向。此外，提高dna检测试剂的抗抑制能力和系统的灵敏度、简化操作步骤、缩短检测时间，提高检测效率也是对该体系的重要要求。目前我国自主研发的试剂盒仍以五色荧光为主，通过近年来研究，由于扩增目标片段长度限制，每种颜色所能容纳的基因座个数是有限，荧光种类是决定试剂盒可检测基因座数目的重要因素之一，五色荧光成为制约我们提高试剂盒检测效能的一大瓶颈。虽然某些进口试剂盒已可检测六色荧光，但其价格昂贵，而且由于不同地域、民族基因座多态性差异巨大，进口试剂盒在很大程度上并不能满足针对中国人群的str分型要求。如何开发针对中国人群的六色荧光str分型方法和系统，满足案件分析要求，提高检测效率成为有待解决的技术问题。技术实现要素：本发明提供了一种六色荧光str分型方法，通过采用特定str基因座组合以及针对这些基因座设计的特定引物以及荧光标记，能够对中国人群个体正常检材和微量降解检材进行准确高效分型，从而为进行个体识别或亲权鉴定等提供数据支持。本发明还提供了一种六色荧光str分型系统，通过该系统可以实现对针对25个基因座的准确分型。本发明还提供了一种复合检测体系，所述检测体系能准确获得25个str基因座的基因型。本发明还提供了一种检测试剂盒，包括所述的复合检测体系。本发明提供的一种六色荧光str分型方法，包括：1)获得个体dna；2)获得所述个体dna包括24个常染色体str基因座和1个性别决定基因座amelogenin在内共25个基因座的基因型，所述24个常染色体str基因座为d5s818,d21s11,d7s820,csf1po,d2s1338,d3s1358,vwa,d8s1179,d16s539,pentae,tpox,th01,d19s433,d18s51,fga,d6s1043,d13s317,d12s391,pentad,d2s441,d1s1656,d22s1045,d10s1248和d11s4463，包括采用与所述25个基因座一一对应的扩增引物对其进行扩增以获得扩增产物的步骤，所述各基因座对应的扩增引物的荧光标记为：amelogenin，d5s818,d21s11,d7s820,csf1po和d2s1338的扩增引物的荧光标记为fam；d3s1358,vwa,d8s1179,d16s539和pentae的扩增引物的荧光标记为hex；tpox,th01,d19s433,d18s51和fga的扩增引物的荧光标记为tamra；d6s1043,d13s317,d12s39和pentad的扩增引物的荧光标记为rox；d2s441,d1s1656,d22s1045,d10s1248和d11s4463的扩增引物的荧光标记为syp；3)根据所述25个基因座的基因型获得所述个体的str分型结果。在本发明的方案中，所述25个基因座是申请人通过对大量中国人群的生存环境、种族起源等进行综合分析获得的。针对上述基因座的引物也是申请人通过大量实验获得的，这些特定基因座的组合实现对正常检材和微量降解检材(如：接触性dna，脱落细胞，腐败检材等)的dna分型。进一步的，在本申请的方案中，“获得个体dna”指的是提取该个体的例如血液、组织等样本中的dna，或者直接获得含有所述个体dna的血卡。“所述个体的str分型结果”指的是能用于对该进行个体识别或亲权鉴定的str分型结果。在本发明的一个具体实施方式中，所述扩增引物为序列表中seqidno.1至seqidno.50的核苷酸序列。在本发明的另一个具体实施方式中，其中2)还包括在获得扩增产物后，使用遗传分析仪分析该扩增产物，以获得所述25个基因座的基因型的步骤。在本发明的方案中，所述遗传分析仪可以是本领域技术人员常规使用的遗传分析仪，例如abi3130或abi3500型遗传分析仪，通过id-x软件或其他genemapper软件等分析该pcr扩增产物中所述25个基因座的基因型。本发明提供的一种六色荧光str分型系统，包括dna获取体系，复合检测体系、推断体系；所述dna获取体系用于获得个体dna；所述复合检测体系用于获得所述个体dna包括24个常染色体str基因座和1个性别决定基因座amelogenin在内共25个基因座的基因型，所述24个常染色体str基因座为d1s1656,d2s1338,d2s441,d3s1358,d5s818,d6s1043,d7s820,d8s1179,d10s1248,d12s391,d13s317,d16s539,d18s51,d19s433,d21s11,d22s1045,csf1po,fga,pentad,pentae,th01,tpox,vwa和d11s4463，包括采用与所述25个基因座一一对应的扩增引物对其进行扩增以获得扩增产物的步骤；所述各基因座对应的扩增引物的荧光标记为：amelogenin，d5s818,d21s11,d7s820,csf1po和d2s1338的扩增引物的荧光标记为fam；d3s1358,vwa,d8s1179,d16s539和pentae的扩增引物的荧光标记为hex；tpox,th01,d19s433,d18s51和fga的扩增引物的荧光标记为tamra；d6s1043,d13s317,d12s39和pentad的扩增引物的荧光标记为rox；d2s441,d1s1656,d22s1045,d10s1248和d11s4463的扩增引物的荧光标记为syp；所述推断体系用于根据所述个体的str分型结果对该进行个体识别或亲权鉴定。在本发明的一个具体实施方式中，所述扩增引物为序列表中seqidno.1至seqidno.50的核苷酸序列。更进一步的，所述复合检测体系还用于在获得扩增产物后，使用遗传分析仪分析该扩增产物，以获得所述25个基因座的基因型。更进一步的，所述遗传分析仪利用针对各基因座的等位基因的分型标准物来确定dna中各基因座的基因型。等位基因的分型标准物的制备可以根据本领域常规手段制备。本发明提供的一种复合检测体系，所述体系包括个体dna，25个基因座，以及扩增引物，所述复合检测体系用于获得所述个体dna包括24个常染色体str基因座和1个性别决定基因座amelogenin在内共25个基因座的基因型，所述24个常染色体str基因座为d1s1656,d2s1338,d2s441,d3s1358,d5s818,d6s1043,d7s820,d8s1179,d10s1248,d12s391,d13s317,d16s539,d18s51,d19s433,d21s11,d22s1045,csf1po,fga,pentad,pentae,th01,tpox,vwa和d11s4463，包括采用与所述25个基因座一一对应的扩增引物对其进行扩增以获得扩增产物的步骤，所述扩增引物为序列表中seqidno.1至seqidno.50的核苷酸序列。进一步的，所述体系中各基因座对应的扩增引物的荧光标记为：amelogenin，d5s818,d21s11,d7s820,csf1po和d2s1338的扩增引物的荧光标记为fam；d3s1358,vwa,d8s1179,d16s539和pentae的扩增引物的荧光标记为hex；tpox,th01,d19s433,d18s51和fga的扩增引物的荧光标记为tamra；d6s1043,d13s317,d12s39和pentad的扩增引物的荧光标记为rox；d2s441,d1s1656,d22s1045,d10s1248和d11s4463的扩增引物的荧光标记为syp。在本发明的方案中，所述dna聚合酶可以是faststartdna聚合酶、taqdna聚合酶、hotstartdna聚合酶中的一种或多种。本发明还提供了一种检测试剂盒，包括所述的复合检测体系。在本发明的方案中，本发明利用所述复合检测体系进行25个基因座的分型的方法，包括：1)将获取的dna作为模板；2)使用所述扩增引物对作为模板的dna进行多重pcr扩增反应以得到扩增产物；3)将所述扩增产物利用遗传分析仪进行分析，以获得25个基因座的基因型。在本发明的方案中，所述25个基因座信息如表1所示：表1本发明提供的扩增引物序列如下。所述扩增引物及其相对应的基因座如下表2所示，pcru代表上游引物，pcrl代表下游引物；表2本发明方案具有以下的优点：1、本发明的6色荧光str分型方法和分型系统采用特定的str基因座组合以及引物序列，使得最终获得的分型图谱上各位点之间排布均匀，图谱完整清晰；重复检测结果无明显差异；stutter峰面积比不超过10％，峰高比不超过15％，完全能够满足法医str检验的要求。2、使用本发明的6色荧光str分型方法和分型系统能同时检测特定的25个str位点，具有高的个体识别或亲权鉴定能力。突破了5色荧光对复合扩增基因座数量的限制，使对dna检测的使用更加高效，图谱质量更高，结果易于分析。3、本发明的方案可利用常规的遗传分析仪，根据所要扩增的基因的分子量和荧光颜色的不同，获得直观的检测结果，并且该结果与现有检测系统相比，准确性为100％。4、本发明的方案检测灵敏度达到0.125ng，系统重复性好，分型准确，并且可以适应最新毛细管电泳检测平台的要求，具有的累计匹配概率(pm)为3.5434×10-28，累计个体识别力(tdp)为0.999999999999999999999999969863，累计非父排除概率(cep)为0.99999999375。附图说明图1显示了使用本发明系统获得的一个样本的分型结果图。图2显示了本发明方法和系统的灵敏度检测结果。图3显示了本发明方法和系统的种属特异性检测结果。图4显示了本发明方法和系统的重复性检测结果。具体实施方式以下实施例中使用的180份无关人员血卡(男性90份,女性90份)，由公安部物证鉴定中心提供。以下实施例中使用的方法如无特别说明均为常规方法，所用试剂耗材和仪器如下表3所示：表3tris-hcl美国sigma-aldrich公司edta美国sigma-aldrich公司mgcl2美国sigma-aldrich公司kcl美国sigma-aldrich公司dntp美国amresco公司nacl国药集团化学试剂有限公司无水乙醇国药集团化学试剂有限公司热启动taq酶瑞士roche公司typer500内标公安部物证鉴定中心去离子甲酰胺美国appliedbiosystems公司毛细管电泳缓冲液appliedbiosystems公司abi3500xl型遗传分析仪appliedbiosystemsproflexpcr扩增仪appliedbiosystems实施例1、对本发明的对进行str分型的方法和系统准确性的验证在本实施例中，所述为180份人血卡，已知其个体来源，但在本申请实施例1的实施过程中设定其个体来源未知，采用本申请方法和系统对其进行str分型，包括：1)利用本发明的系统中的dna获取体系获得所述个体dna即所述180份人血卡，2)利用本发明的系统中的复合检测体系获得所述个体dna25个str基因座的基因型，并根据该基因型获得该个体的str分型结果，3)利用本发明的系统中所述推断体系，根据所述个体的str分型结果对该进行个体识别或亲权鉴定。本实施例中，所述复合检测体系用于获得所述个体dna包括24个常染色体str基因座和1个性别决定基因座amelogenin在内共25个基因座的基因型，所述24个常染色体str基因座为d1s1656,d2s1338,d2s441,d3s1358,d5s818,d6s1043,d7s820,d8s1179,d10s1248,d12s391,d13s317,d16s539,d18s51,d19s433,d21s11,d22s1045,csf1po,fga,pentad,pentae,th01,tpox,vwa和d11s4463，包括采用与所述25个基因座一一对应的扩增引物对其进行扩增以获得扩增产物的步骤，所述扩增引物为序列表中seqidno.1至seqidno.50的核苷酸序列；所述各基因座对应的扩增引物的荧光标记为：amelogenin，d5s818,d21s11,d7s820,csf1po和d2s1338的扩增引物的荧光标记为fam；d3s1358,vwa,d8s1179,d16s539和pentae的扩增引物的荧光标记为hex；tpox,th01,d19s433,d18s51和fga的扩增引物的荧光标记为tamra；d6s1043,d13s317,d12s39和pentad的扩增引物的荧光标记为rox；d2s441,d1s1656,d22s1045,d10s1248和d11s4463的扩增引物的荧光标记为syp，在本发明方案中使用常规染色手段对上述扩增引物进行染色。1、模板：180份人血卡。2、利用所述复合检测体系对上述模板进行25个基因座的分型，包括：使用所述扩增引物进行多重pcr扩增，以获得扩增产物；将扩增产物利用遗传分析仪确定25个基因座的基因型。具体过程如下：2.1、引物池配置扩增引物池的配置，其中所述25个基因座一一对应的25对扩增引物如上所述；本发明提供的各种引物序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成好的引物用1×te缓冲液稀释到100μm，将25个基因座的上下游引物等比混合，得到浓度为50μm的引物。从25管pcr引物中分别取不同体积加入到一个新的离心管中，作为25重pcr引物池，在该引物池中，各str位点的引物的终浓度为0.1-0.3μm。2.2、多重pcr反应本实施例使用proflexpcr扩增仪进行多重pcr反应。(1)配置pcr反应混合物(pcrmix)(10μl体系)，如下表4所示。表4(2)扩增程序将pcr反应混合物置于pcr仪上，调整循环程序如下表5进行扩增，得到扩增产物：表52.3、pcr产物分型待分型样品的准备：1.电泳上样混合物的准备，按下面比例准备由内标和去离子甲酰胺组成上样混合物：10μltyper500内标+1000μl去离子甲酰胺，混合均匀。2.每管加入10μl上样混合物、1μl扩增产物，混匀。3.95℃变性3分钟，立即放在冰上冷却3分钟，之后电泳。利用abi3500xl型遗传分析仪上进行检测。应用abi3500xldatecollectionsoftware3.1收集数据，genemapperidxv1.4软件对电泳结果进行分析，获得所述25个基因座的基因型。2.4、结果分析使用本发明系统对180份dna样品进行分型的一个代表性分型结果如图1所示，为了验证分型结果的准确性，从180份dna样品中随机抽取100份dna样品，对25个基因座进行测序(北京迈奥德恩生物科技有限公司测序)，采用本实施例的复合检测体系获得的所述个体的所有分型结果与测序结果均一致，一致性达到100％，此结果证明本发明复合检测体系分型结果准确。3、根据未知来源个体dna的25个基因座的基因型对其进行个体识别由本实施例方法获得的上述180份样品的个体来源结果，与其已知的个体来源结果一致，说明本发明方法可以对未知来源个体进行个体识别。4、根据180份dna样品所述25个基因座的基因型，获得个体的str分型结果，并进行亲权鉴定。由本实施例方法获得的上述180个个体的亲权鉴定结果，与其已知的个体亲权鉴定结果一致，说明本发明方法可以进行的亲权鉴定。实施例2本发明复合扩增体系灵敏度、种属特异性、系统重复性、分型结果准确性验证一、灵敏度检测当9947标准dna模板量≥0.125ng，25个基因座的全部等位基因均可正确分型，见图2。模板量<0.125ng，出现等位基因丢失现象。即本发明的系统能对低至0.125ng的dna进行检测。二、种属特异性检测复合扩增体系检测动物(猪、狗、羊、兔和大肠杆菌)血液样本，在分型区均未产生特异性峰型，见图3。可以看出本发明的方法和系统具有良好的种属特异性。三、系统重复性检测采用2个批次的试剂对100份样本(静脉血，来自公安部物证鉴定中心)进行检测，结果稳定、图谱完整清晰；重复检测结果无明显差异；stutter峰面积比不超过10％，峰高比不超过15％。使用本发明所述体系分型与使用pluspcramplificationkit试剂盒分型在共有基因座上分型结果完全相同，说明本发明的方法和系统具有良好的系统重复性。进一步的，将本发明pcr体系中pcr引物+反应混合物和typer500内标反复冻融5、10、15、20次获得的检测结果之间没有明显变化，各基因座间扩增平衡性好，参见图4(反复冻融20次结果)，可以看出本发明的方法和系统具有良好的系统重复性。四、各类案件检材分型准确性各类常见检材如存放15年的血痕样本、骨骼及唾液斑等样本，经本发明系统的25个str基因座复合扩增体系检测均能得到准确分型结果，峰型尖锐，扩增平衡性良好，且与dnatyper19tm、pluspcramplificationkit试剂盒在共有基因座上的分型结果完全相同。表724个str基因座在中国汉族人群中的遗传学参数(n＝209)利用以上表格中的数据，根据以下公式获得申请的累计匹配概率、累积个体识别率以及累计非父排除概率。pm(累计匹配概率)＝∑pi2pi群体中第i个表现型的频率。tdp(累积个体识别率)＝1-(1-dp1)(1-dp2)(1-dp3)…(1-dpk),其中dpk为第k个基因座的dp值。cpe(累计非父排除概率)＝1-(1-pe1)(1-pe2)(1-pe3)…(1-pek),其中pek为第k个基因座的pe值。本发明的24个str基因座在中国汉族人群中具有的累计匹配概率(pm)为3.5434×10-28，累计个体识别力(tdp)为0.999999999999999999999999969863，累计非父排除概率(cep)为0.99999999375。序列表<110>公安部物证鉴定中心<120>一种六色荧光str分型方法和系统<130>168727gf<160>50<170>patentinversion3.5<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>1cctgggctctgtaagaagt19<210>2<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>2ttaaactgggaagctg16<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>3ggtgattttcctctttggt19<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>4gattccaatcatagccaca19<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>5tatgtgagtcaattccccaa20<210>6<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>6gtattagtcaatgttctccag21<210>7<211>24<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>7gtcatagtttagaacgaactaacg24<210>8<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>8tgaggtatcaaaaactcagagg22<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>9ggaggtaaaggtgtcttaaag21<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>10ttcctgtgtcagaccctgtt20<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>11ccagtggatttggaaacaga20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>12acctagcatggtacctgcag20<210>13<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>13ctgcagtccaatctggg17<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>14tgaaatcaacagaggcttgc20<210>15<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>15gtggatgataagaataatcagta23<210>16<211>23<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>16gatgataaatacataggatggat23<210>17<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>17ttgcaacttatatgtatttttgtatttc28<210>18<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>18ccaaattgtgttcatgagtatagtt25<210>19<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>19gatcccaagctcttcctctt20<210>20<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>20acgtttgtgtgtgcatctgt20<210>21<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>21taccaacatgaaagggtaccaa22<210>22<211>27<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>22ttattaattgagaaaactccttacaat27<210>23<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>23ctagcacccagaaccgt17<210>24<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>24ttgtcagcgtttatttg17<210>25<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>25ttccgagtgcaggtca16<210>26<211>15<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>26gctgccctagtcagc15<210>27<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>27ctgggcaacagaataagat19<210>28<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>28aggtttttaaggaacaggtgg21<210>29<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>29cttgagcccagaaggt16<210>30<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>30tctaccagcaacaacacaaata22<210>31<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>31cataggttttgaactc16<210>32<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>32ttgtctgtaattgccag17<210>33<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>33aaggatgggtggatcaat18<210>34<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>34tgtatgagccacttccca18<210>35<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>35cagaagtctgggatgtgg18<210>36<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>36cccaaaaagacagacag17<210>37<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>37acaggatcaatggatgcat19<210>38<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>38tggcttttagacctggact19<210>39<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>39aaggtcgaagctgaagt17<210>40<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>40tagaattctttaatctggaca21<210>41<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>41tgtggctcatctatgaaaact21<210>42<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>42gaagtggctgtggtgttatg20<210>43<211>17<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>43gtgttgctcaagggtca17<210>44<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>44aaatagaatcactagggaac20<210>45<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>45ttccccgatgatagtagt18<210>46<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>46gcgaatgtatgattggcaat20<210>47<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>47aatgaattgaacaaatgagtg21<210>48<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>48gcaactctggttgtattgtct21<210>49<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>49atcctattggaggccatca19<210>50<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>50gattgacctgtctgtccg18当前第1页12