一种以蓝藻干藻粉为原料的MC‑LR提取试验方法与流程

本发明属于水处理应用领域，具体涉及以干藻粉为原料的mc-lr提取的研究。

背景技术：

水体富营养化使得蓝藻水华大面积爆发，引起的藻毒素(mc)污染问题，日益引起人们的关注，使得有关mc的研究成为当今环保、生物、医学等领域的热点问题之一。蓝藻多发生在夏季，但研究工作需全年开展，有的实验室远离湖泊，获取蓝藻困难，实验室培养的蓝藻相对较少，难以获取足够量的mc。商品化的藻毒素标样(纯品)昂贵，10ug高达3000元，使得实验室研究难以开展。常州位于太湖西北角，夏季东南风作用下，是太湖蓝藻主要聚集区域，每年夏秋2季打捞数千万吨的藻浆，经脱水后产生近万吨藻泥。

国内外有关学者对mcs的提取、提纯已有相关研究报道，如bote等首先研究了mcs的提取、提纯方法。专利号为201010524841.4，公开了一种甲醇作为提取剂，过ods柱精提、半制备色谱仪分离，得到微囊藻毒素的纯度在97％以上。专利号为02139093.2，公开了一种微囊藻毒素的提取纯化方法，用乙酸和甲醇浸泡，去除杂质、毒素分离，薄层层析等提取纯化，纯度达到90％以上。

本发明将浓藻浆离心脱水得到藻泥，藻泥置于阳光下暴晒，经球磨机研磨90min得到干藻粉，以干藻粉为原料筛选合适提取剂(甲醇、乙醇、乙酸、丁醇-甲醇-水混合溶液)，优化mc提取工艺参数，建立了一套“藻泥干化-干藻粉研磨-提取-富集-检测”提取路线，本发明可为实验室从事藻毒素毒性、化学或生物降解机制等研究工作提供商品化mc-lr。

技术实现要素：

本发明的目的是针对实验室进行藻毒素(mc)相关研究过程中mc样品昂贵、难以获取这一难题，以太湖水体中的浓藻浆为研究对象，进行了mc提取。

本发明的技术方案如下：

一种以太湖蓝藻为原材料，将浓藻浆离心脱水得到藻泥，藻泥置于阳光下暴晒，经球磨机研磨90min得到干藻粉，考察提取剂种类、干藻粉研磨时间、提取剂浓度、搅拌时间、微波消解工艺条件对mc提取量的影响，建立了一套“藻泥干化-干藻粉研磨-提取-富集-检测”提取路线。

本发明的主要优点：

本发明建立的这种以浓藻浆为原料，经过脱水、暴晒、研磨得到干藻粉，以甲醇等为提取剂的藻毒素提取方法，可为实验室从事藻毒素毒性、化学或生物降解机制等研究工作提供了便利。经测算，以甲醇为提取剂提取1g藻毒素成本仅402.67元。

附图说明

附图1为本发明晒干的蓝藻示意图；附图2为本发明研磨后的藻粉示意图。

具体实施方式

以太湖蓝藻为原料提取mc-lr。

1、蓝藻的采集与保存

太湖蓝藻爆发时期(每年6-9月)，从太湖蓝藻站收集浓藻浆，将浓藻浆离心脱水得到藻泥，将藻泥置于阳光下暴晒，晒干后保存。

2、藻粉的制备

取120g晒干的蓝藻，置于球磨罐中，加入磨球15个(直径r＝15mm)，转速400r/min，研磨90min，过120目筛，得到藻粉。

3、mc-lr的提取

称取藻粉放入100ml锥形瓶中，加入60ml提取剂，加入搅拌子放在磁力搅拌器上搅拌0.5-2.5小时，再将混合溶液超声振荡20min，然后再离心10min(转速4000r/min)，得到上清液。重复2次，将得到的上清液合并，在55℃条件下真空旋转蒸发，去除溶液中的提取剂。在粗提液中加入稀盐酸调节ph值至4，静置4h，可明显看到溶液中有絮状沉淀物，离心10min去除絮状物(4000r/min)，得到浅黄色上清液。在循环水式真空泵抽提下过0.45um滤膜，用稀氨水(5％)调节ph值为7，得到较为理想的粗提液。

4、mc-lr的纯化和富集

用50ml的玻璃注射器吸取10ml100％甲醇溶液，然后缓慢注入到c18固相萃取小柱，自然滴下，当甲醇液面快要到萃取小柱上层筛片时，立即加入10ml超纯水活化c18固相萃取小柱，活化过程中不能使c18小柱变干，将小柱和spe固相萃取装置连接；将稀释1000倍的粗提液缓慢流过固相萃取小柱，富集浓缩，控制流速为4ml/min。富集结束后先用5ml10％甲醇溶液淋洗c18小柱，再用10ml洗脱溶液(用甲醇将三氟乙酸定容到100ml容量瓶中)洗脱mc-lr。洗脱液用氮气缓缓吹干，用5ml超纯水溶解，用注射器吸取溶解液经过一次性0.45um针头式过滤器，测定mc-lr提取量。

以下提供4个实施例进一步说明本发明。实施例用于说明本发明内容，而不是限定本发明内容。

实施例1

提取剂对mc-lr提取量的影响

称取1g藻粉4份分别放入100ml锥形瓶中，分别加入60ml60％的甲醇、60％的乙醇、5％的乙酸以及5:20:75的丁醇-甲醇-水混合溶液，加入搅拌子放在磁力搅拌器上搅拌2小时，再将混合溶液超声振荡20min，然后再离心10min(转速4000r/min)，得到上清液。重复2次，将得到的上清液合并，在55℃条件下真空旋转蒸发，去除溶液中的提取剂。在粗提液中加入稀盐酸调节ph值至4，静置4h，可明显看到溶液中有絮状沉淀物，离心10min去除絮状物(4000r/min)，得到浅黄色上清液。在循环水式真空泵抽提下过0.45um滤膜，用稀氨水(5％)调节ph值为7，得到较为理想的粗提液。以下同具体实施方式中的步骤(4)、(5)。4种提取剂提取mc-lr的提取量约为250-300ug/g。而以甲醇作为提取剂时mc-lr提取量最多，达到了297.38ug/g。乙醇作为提取剂时mc-lr提取量相对较少，为289.20ug/g。可见，这4种提取剂均能有效提取mc-lr，其提取量排序是：甲醇>丁醇-甲醇-水>乙酸>乙醇。

实施例2

研磨时间对mc-lr提取量的影响

具体实施方式中的步骤(2)，研磨时间分别为30min、60min、90min以及120min。称取研磨30min、60min、90min以及120min的藻粉各1g放入锥形瓶中，加入60ml60％的甲醇，加入搅拌子放在磁力搅拌器上搅拌2小时，再将混合溶液超声振荡20min，然后再离心10min(转速4000r/min)，得到上清液。重复2次，将得到的上清液合并，在55℃条件下真空旋转蒸发，去除溶液中的提取剂。在粗提液中加入稀盐酸调节ph值至4，静置4h，可明显看到溶液中有絮状沉淀物，离心10min去除絮状物(4000r/min)，得到浅黄色上清液。在循环水式真空泵抽提下过0.45um滤膜，用稀氨水(5％)调节ph值为7，得到较为理想的粗提液。以下同具体实施方式中的步骤(4)、(5)。随着研磨时间的增加mc-lr提取量也在增加，在90min后提取量达到平衡，为278.20ug/g。

实施例3

甲醇溶液浓度对mc-lr提取量的影响

称取研磨90min的藻粉1g4份分别放入100ml锥形瓶中，分别加入60ml20％、40％、60％以及80％的甲醇溶液，加入搅拌子放在磁力搅拌器上搅拌2小时，再将混合溶液超声振荡20min，然后再离心10min(转速4000r/min)，得到上清液。重复2次，将得到的上清液合并，在55℃条件下真空旋转蒸发，去除溶液中的提取剂。在粗提液中加入稀盐酸调节ph值至4，静置4h，可明显看到溶液中有絮状沉淀物，离心10min去除絮状物(4000r/min)，得到浅黄色上清液。在循环水式真空泵抽提下过0.45um滤膜，用稀氨水(5％)调节ph值为7，得到较为理想的粗提液。以下同具体实施方式中的步骤(4)、(5)。20％的甲醇作为提取剂时提取效率相对较低，为284.92ug/g。随着提取液浓度的增加，mc-lr提取量也相应增加；当提取液浓度为60％时，mc-lr提取量最大，为296.40ug/g；甲醇提取液浓度继续增大时，mc-lr提取量开始减少，可能是甲醇浓度太高改变了mc-lr的性质。

实施例4

搅拌时间对mc-lr提取量的影响

称取研磨90min的藻粉1g4份分别放入100ml锥形瓶中，加入60ml60％的甲醇溶液，加入搅拌子放在磁力搅拌器上分别搅拌30min、60min、90min、120min以及150min，再将混合溶液超声振荡20min，然后再离心10min(转速4000r/min)，得到上清液。重复2次，将得到的上清液合并，在55℃条件下真空旋转蒸发，去除溶液中的提取剂。在粗提液中加入稀盐酸调节ph值至4，静置4h，可明显看到溶液中有絮状沉淀物，离心10min去除絮状物(4000r/min)，得到浅黄色上清液。在循环水式真空泵抽提下过0.45um滤膜，用稀氨水(5％)调节ph值为7，得到较为理想的粗提液。以下同具体实施方式中的步骤(4)、(5)。搅拌时间越长，mc-lr的提取量越高，在搅拌120min以后mc-lr提取量达到平衡，为297.38ug/g。

实施例5

微波消解对mc-lr提取量的影响

称取研磨90min的藻粉1g4份分别放入100ml锥形瓶中，加入60ml60％的甲醇溶液，加入搅拌子放在磁力搅拌器上搅拌120min，再将混合溶液超声振荡20min，把锥形瓶放入微波炉中，分别消解0min、1min、3min、5min。然后再离心10min(转速4000r/min)，得到上清液。重复2次，将得到的上清液合并，在55℃条件下真空旋转蒸发，去除溶液中的提取剂。在粗提液中加入稀盐酸调节ph值至4，静置4h，可明显看到溶液中有絮状沉淀物，离心10min去除絮状物(4000r/min)，得到浅黄色上清液。在循环水式真空泵抽提下过0.45um滤膜，用稀氨水(5％)调节ph值为7，得到较为理想的粗提液。以下同具体实施方式中的步骤(4)、(5)。由于采用普通微波炉消解，3min、5min提取液基本蒸发。消解1min的样品，mc-lr提取量提高约10ug/g。

实施例6

经济效益测算

以4种提取剂提取1kg藻粉中的mc-lr进行测算，甲醇、乙醇、乙酸、丁醇-甲醇总金额分别为100.8元、144元、15元、51元。1kg藻粉市场价20元计，则以甲醇作为提取剂提取1g藻毒素成本为402.67元。大大降低了实验室研究藻毒素的成本，同时为实验室研究微生物降解藻毒素实验提供了材料来源。若按1年处理10t藻粉计，需投入成本约为120.8万元，产生近900万元产值，可见其商业价值还是非常可观的。