CRISPER‑Cas9系统介导的山羊EDAR基因敲除的方法与流程

本发明涉及分子生物学及动物遗传育种领域，具体地说，涉及crisper-cas9系统介导的山羊edar基因敲除的方法。

背景技术：

现代的基因编辑技术包括：锌指核酸酶（znicfingernuclease，zfns）、转录激活因子样效应物核酸酶（transcriptionactivator-likeeffectornuclease，talens）和crispr-cas9系统。但是crispr-cas9系统以其独特的优点在其他两个技术出现之后迅速发展起来。crispr-cas9系统是由规律成簇间隔回文重复序列和crispr相关蛋白9所组合而成。crispr-cas9系统需要由一个sgrna（smallguiderna，sgrna）作为向导，识别靶位序列，引导cas9蛋白对其完成切割，使得该处发生双链断链，这样就会引发细胞中内源性的修复机制。在细胞中内源性的修复机制包括同源重组修复机制和非同源末端连接两种。其中同源重组修复机制是以修复模板存在时，依据修复模板，可以实现定点的不同长度的碱基缺失和插入，这样就会形成基于的敲入和基因敲除。非同源末端连接修复机制并不是精确地，在断裂处往往是通过随机的插入或者删除部分碱基。

绒山羊作为绒肉兼用型的家畜品种之一，在我国的畜牧业中占据了非常重要的地位。绒山羊的改良通过传统的育种改良和利用现代的生物技术育种这两种途径来完成的，其中通过现代的生物技术对其改良是研究者有目的对其的进行改良，这样整个改良过程中可以达到精准、快速等特点。

改善绒山羊的绒质和产绒量是在绒山羊育种中非常重要的育种方向。毛囊是动物皮肤的附属结构之一，它通过自己的不断更新和周期性生长完成了毛发的生长与脱落。绒山羊的皮肤中，以毛囊的发生早晚和结构特点被研究人员划分为初级毛囊和刺激毛囊两种。初级毛囊的生长发育会形成羊毛，但是次级毛囊的生长发育会形成羊绒。所以如何提高次级毛绒的生长发育变可以提高羊绒的产量。目前在小鼠的研究中发现，edar基因控制着初级毛囊的生长发育，在这个过程中是必不可少的，但是其在次级毛囊的生长发育过程中没有影响。所以在绒山羊的毛囊生长发育过程中是不是也是如此，有待进一步研究。如果在绒山羊中edar的敲除影响了初级毛囊的生长发育但是对次级毛囊的生长发育没有影响，这样就提高了次级毛囊的比率进一步增加了羊绒产量。

利用crisper-cas9系统敲除山羊edar基因的研究未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供crisper-cas9系统介导的山羊edar基因敲除的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供的crisper-cas9系统介导的山羊edar基因敲除的方法，其是依据山羊edar基因序列（geneid：102179206），在其第6号外显子上设计了两个方向相反的靶序列，并构建基于crisper-cas9系统的两个grna表达载体，然后将优化后的crisper-cas9载体和两个上述构建的grna表达载体共同转入山羊胎儿成纤维细胞中，获得山羊edar基因敲除细胞系。

本发明中述及的山羊包括但不限于阿尔巴斯绒山羊。

前述的方法，两个grna作用靶位点均位于山羊edar基因的6号外显子上。sgrna1作用位点的dna序列为5′-ggagaacttctccgcggggc-3′，sgrna2作用位点的dna序列为5′-cggcgccacaaggactgcga-3′。

前述的方法，所述的crisper-cas9载体（即hcas9质粒）的核苷酸序列如seqidno:1所示（hcas9质粒图谱见图1）；所述edar-grna1表达载体的核苷酸序列如seqidno:2所示；所述edar-grna2表达载体的核苷酸序列如seqidno:3所示。

本发明还提供根据上述方法获得的山羊edar基因敲除的细胞系。

本发明进一步提供上述方法在制备edar基因敲除的克隆山羊的应用。该应用是指将所述山羊edar基因敲除的细胞为核移植供体细胞，离体的羊卵母细胞为核移植受体细胞，通过体细胞核移植技术获得山羊克隆胚胎，然后将克隆胚胎通过胚胎移植技术移入受体山羊子宫内进行妊娠，获得edar基因敲除山羊。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

1）crisper-cas9载体的优化；2）根据山羊的edar基因序列，构建基于crisper-cas9系统的edar-grna1和edar-grna2表达载体；3）将上述优化的crisper-cas9载体、edar-grna1和edar-grna2表达载体共同转染到山羊胎儿成纤维细胞中，通过口吸管法、流式细胞仪法和稀释法筛选单克隆细胞系；4）通过pcr技术鉴定筛选单克隆细胞系，获得edar基因敲除的单克隆细胞系。

其中，步骤3）中利用稀释法挑取单克隆细胞系是指在完成细胞转染24小时后，用用0.25%胰蛋白酶消化2-3分钟，再用含有10%的胎牛血清的dmem/f12培养液终止消化，并轻轻吹打贴壁细胞，使其脱离培养皿壁形成细胞悬液并收集与10ml离心管中，1500rpm离心5分钟。再用pbs重悬上述细胞，取细胞悬液少量置于培养皿中，在显微镜下通过事先制备好的玻璃口吸管选取单个细胞转移至96孔细胞培养板中用含有10%的胎牛血清的dmem/f12培养液独立培养。

步骤3）中利用流式细胞仪筛选单克隆细胞系是指在完成细胞转染24小时后，用用0.25%胰蛋白酶消化2-3分钟，再用含有10%的胎牛血清的dmem/f12培养液终止消化，并轻轻吹打贴壁细胞，使其脱离培养皿壁形成细胞悬液并收集与10ml离心管中，1500rpm离心5分钟。再用pbs重悬上述细胞，再用流式细胞仪对其进行分选于96孔细胞培养板中，再用含有10%的胎牛血清的dmem/f12培养液独立培养。

步骤3）中利用稀释法筛选单克隆细胞系是指在完成细胞转染24小时后，用用0.25%胰蛋白酶消化2-3分钟，再用含有10%的胎牛血清的dmem/f12培养液终止消化，并轻轻吹打贴壁细胞，使其脱离培养皿壁形成细胞悬液并收集与10ml离心管中，1500rpm离心5分钟。再用含有10%的胎牛血清的dmem/f12培养液重悬上述细胞，使其稀释成1个细胞/100µl的细胞浓度。混匀后取细胞悬液100µl置于96孔细胞培养板中独立培养。

步骤4）中鉴定edar敲除单克隆细胞系主要采用设计扩增包含两个靶位区域的pcr引物的方法，通过pcr技术扩增靶序列区域的全部序列再对该扩增片段进行测序分析，目的是确定edar基因的突变情况。

本发明共成功获得89株edar基因打靶单克隆细胞系通过扩增各株细胞系的打靶区域片段进行测序分析发现共有62株细胞系的edar基因发生了突变，突变效率为69.7%。对各突变细胞株的突变类型进一步分析，共发现了9种不同的突变类型，具体突变类型见图6。

本发明具有以下优点。

（一）crispr-cas9基因编辑技术与常规的同源重组技术、talen技术和zfns技术相比，基因敲除效率显著提高。

（二）crispr-cas9系统中设计了两个方向相反的sgrna完成基因敲除任务，这样就造成了edar基因靶位的大片段缺失，提高了edar基因的敲除效率。

（三）通过crispr-cas9系统的介导，实现了不加任何筛选标记即可筛选出edar基因敲除的转基因细胞系，这是传统同源重组技术、talen技术和zfns技术无法实现的，很大程度提高了转基因动物的安全性。

（四）通过体细胞核移植技术制备edar基因敲除山羊，为构建成熟的基因修饰动物研究和生产奠定基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中hcas9质粒图谱。

图2为本发明实施例2中crispr-cas9系统介导山羊edar基因敲除模式图。

图3为本发明实施例4中利用surveyor突变检测试剂盒检测靶位点的电泳结果；其中，m:200bpladdermarker;1:阳性对照；2：grna1突变活性情况；3:grna2突变情况。

图4为本发明实施例5中edar基因敲除总细胞靶区序列测序双峰图。

图5为本发明实施例5中edar基因敲除单克隆细胞图。

图6为本发明实施例6中各单克隆细胞edar基因敲除类型图。其中短横线表示碱基缺失，方框表示插入碱基。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册（sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中测序工作由华大基因完成。

实施例1crisper-cas9载体的优化。

对购自北京中原公司的crispr-cas9表达载体进行优化，优化的crisper-cas9载体（即hcas9质粒）的核苷酸序列如seqidno:1所示，hcas9质粒图谱见图1。

实施例2grna表达载体的构建。

根据山羊的edar基因序列（geneid:102179206），针对edar的第6号外显子序列设计sgrna序列，并构建基于crisper-cas9系统的grna表达载体。grna表达载体包括4部分：u6启动子、靶序列、grna骨架和终止信号。基于crispr-cas9系统介导山羊edar基因敲除模式图见图2。其中，sgrna作用位点的dna序列如下：sgrna1：5′-ggagaacttctccgcggggc-3′，sgrna2：5′-cggcgccacaaggactgcga-3′。利用生物学软件根据sgrna作用位点（sgrna1靶位点和sgrna2靶位点）分别设计sgrna序列，克隆至grna表达载体上，转化大肠杆菌trans-110，涂板后挑取单菌落，进行菌液pcr，经电泳及测序鉴定，测序正确的单菌落接种于含amp的lb培养基中，37℃、220rpm过夜揺菌，提取质粒备用。edar-grna1载体和edar-grna2载体的核苷酸序列如seqidno:2和seqidno:3所示。

实施例3电穿孔法转染山羊胎儿成纤维细胞。

解冻山羊胎儿成纤维细胞接种于100mm培养皿中，置于37℃、5%co2、100%相对湿度的培养箱中用含有10%的胎牛血清的dmem/f12培养液培养。待其生长达到90%的细胞汇合度时用pbs清洗细胞，然后用0.25%胰蛋白酶消化2-3分钟，再用含有10%的胎牛血清的dmem/f12培养液终止消化，并轻轻吹打贴壁细胞，使其脱离培养皿壁形成细胞悬液并收集与10ml离心管中，1500rpm离心5分钟。离心结束后去除上清培养液，再加入pbs重悬细胞，再以1500rpm离心5分钟清洗细胞沉淀两次。最后用opti-mem培养液在此清洗细胞沉淀后，用适量opti-mem培养液重悬细胞达到1×10⁵个/µl细胞浓度。取上述90µl的细胞悬液加入10µg的质粒（cas9：grna=1:19），共10µl。混合均匀后小心将上述混合细胞悬液加入电击杯中，在这个过程中避免产生气泡，以免影响转染。将电击杯放入nepa21电转仪的电转杯腔中，按照225v/2.5ms的电转染条件按照电转仪的使用说明书来完成电转实验。电转后用预热的含有10%的胎牛血清的dmem/f12培养液重悬细胞并接种于含有10%的胎牛血清的dmem/f12培养液的培养皿中培养。

实施例4crisper-cas9系统中sgrna的活性检测。

以野生型的山羊胎儿成纤维细胞作为对照，将edar-grna1+cas9和edar-grna2+cas9质粒通过电穿孔法转染山羊胎儿成纤维细胞。通过培养富集打靶细胞后，分别提取这两组细胞和野生型细胞的基因组dna。然后以上述得到的基因组dna作为模板，通过pcr反应，扩增edar基因的靶位序列。具体的pcr反应引物如下：edar-6exonf：gtggtggtcgtcgtggtgatgc，edar-6exonr：ctgctcagccttccttatggtc。pcr反应总体系为20µlμl：lataq0.2µl，10×lapcrbufferⅱ2µl，dntpmixture3.2µl,质粒dna0.4µl，上、下游引物（100mmol•l-1）各0.8µl，灭菌水12.6µl。扩增edar基因靶位序列的pcr反应条件：94℃预变性10min；94℃变性30sec、63℃退火45sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃10min，16℃1h。扩增结束后，通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测目的条带的大小，并且回收目的条带胶条后纯化。再把野生型片段分别和两实验组的片段经过逐步退火的方法进行dna杂交。具体的dna杂交反应体系是：dna30µl（120ng/µl），10×lapcrbufferⅱ3µl,。杂交程序见表1。

表1dna杂交程序

得到了杂交dna后，通过用surveyor突变检测试剂盒来检测突变活性。根据surveyor突变检测试剂盒的使用说明书来完成实验，具体的反应体系见表2。

表2surveyor突变检测体系

将反应体系配置完毕后，置于42℃反应1小时，最后将入2.5µl的stopsolution后，将上述反应液通过2%琼脂糖凝胶电泳检测dna片段的大小。检测结果见图3，两种sgrna均具有活性，均可以介导cas9对靶位序列进行切割。

实施例5单克隆细胞系的筛选。

本实施例旨在筛选edar基因敲除单克隆细胞系。

将edar-grna1+edar-grna2+cas9质粒通过电穿孔法转染山羊胎儿成纤维细胞。细胞转染24小时后，用用0.25%胰蛋白酶消化2-3分钟，再用含有10%的胎牛血清的dmem/f12培养液终止消化，并轻轻吹打贴壁细胞，使其脱离培养皿壁形成细胞悬液并收集与10ml离心管中，1500rpm离心5分钟。再用pbs重悬上述细胞，获得edar基因敲除总细胞，并取部分细胞提取基因组dna，pcr扩增打靶区域序列进行测序分析。再通过三种方法挑取单克隆细胞。方法一，利用流式细胞仪分选成单细胞，将单细胞接种于预先平衡后含有细胞培养液的96孔细胞培养板中。方法二，利用口吸管挑取单克隆细胞系，用玻璃管拉制成保证可以使单个细胞通过的合适直径口吸管，在显微镜下无菌操作，将单细胞分别接种于预先平衡后含有细胞培养液的96孔细胞培养板中，进行细胞培养。方法三，用含有10%的胎牛血清的dmem/f12培养液重悬上述细胞，使其稀释成1个细胞/100µl的细胞浓度。混匀后取细胞悬液100µl置于96孔细胞培养板中独立培养。在第10天时，在显微镜下观察，将汇合度较高的细胞克隆传代至24孔板的两个孔中培养，传代后24h内对细胞进行换液，当传代的细胞克隆汇合度达到90%以上时，用0.25%胰蛋白酶进行消化，将一孔的细胞加入1ml冻存液（0.1mldmso+0.9ml血清）冻存，另一孔细胞提取基因组。

经过对edar基因敲除总细胞打靶区域序列测序分析发现在靶位后面出现双峰现象（见图4），所以认定edar基因敲除成功。经过单细胞培养扩大各edar基因打靶单克隆细胞株（见图5）。

实施例6单克隆细胞系的鉴定。

以各单克隆细胞系的基因组dna作为模板，通过pcr反应，扩增edar基因的靶位序列。具体的pcr反应引物为：edar-6exonf：gtggtggtcgtcgtggtgatgc，edar-6exonr：ctgctcagccttccttatggtc。pcr反应总体系为20µlμl：lataq0.2µl，10×lapcrbufferⅱ2µl，dntpmixture3.2µl,质粒dna0.4µl，上、下游引物（100mmol•l-1）各0.8µl，灭菌水12.6µl。扩增edar基因靶位序列的pcr反应条件：94℃预变性10min；94℃变性30sec、63℃退火45sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃10min，16℃1h。扩增结束后，将得到的pcr产物送于华大基因测序分析。经过测序分析发现各edar基因打靶单克隆细胞株共有9种突变类型，具体突变类型见图6。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

sequencelisting

<110>内蒙古大学

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<222>(319)..(338)

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<213>人工序列

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