一种外源基因导入红腺忍冬的方法与流程

本发明涉及植物转基因技术领域，特别涉及红腺忍冬叶柄遗传转化的方法。

背景技术：

红腺忍冬(lonicerahypoglaucamiq.)是山银花的三种来源之一，具有清热解毒、疏散风热的功效。近年来，红腺忍冬还被广泛应用于食品、饮料、保健品、化妆品及兽医用等方面，药用价值及经济价值极高，同时红腺忍冬还可以绿化荒山、防止水土流失、改善石漠化地区的生态环境。红腺忍冬的社会需求大，市场供不应求，其药用功效、保健作用、观赏价值及生态效益足以推动红腺忍冬的种植、加工、销售等行业的发展及基础研究和临床应用研究。目前关于山银花遗传转化系统的报道较少，关于红腺忍冬遗传转化系统的研究尚未有报道，建立此物种的遗传转化系统，使其通过基因工程改良性状成为可能。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种以红腺忍冬叶柄为转基因受体材料，通过农杆菌介导红腺忍冬的遗传转化方法，该方法操作简单，培养周期短，转化率高，遗传性状稳定等优点。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：一种外源基因导入红腺忍冬的方法，其包括以下步骤：

1)实生幼苗的准备：挑取出经低温贮藏后的红腺忍冬成熟浆果的饱满的种子，使用自来水把种子漂洗干净后浸泡于种子浸泡液中，取出并沥干种子表面水分后及时播种于育苗基质中，育苗基质表面均匀覆盖细沙，保持湿润，进行培养，获得实生幼苗；

2)无菌瓶苗的准备：取实生幼苗无根植株作为外植体，刷洗干净其表面的灰尘杂质后使用自来水冲洗20～30min，沥干外植体表面水分后，用75％酒精和0.1％氯化汞水溶液分别浸泡进行表面灭菌，然后置于生根培养基中进行培养，获得无菌瓶苗；

3)农杆菌侵染：选取生长健壮的无菌瓶苗的叶柄于预培养基上进行预培养，接着于含附有表达载体的农杆菌重悬液中侵染，于共培养基上进行暗培养，诱导愈伤组织，获得侵染材料；

4)转基因愈伤组织的筛选：侵染材料于抑菌培养基中抑菌培养后转接入筛选培养基进行筛选培养，获得转基因愈伤组织；

5)转基因愈伤组织的氯酚红检测：将转基因愈伤组织表面杂质清洗干净并稍微晾干表面水分后，使用氯酚红进行检测；

6)转基因愈伤组织的pcr检测：将氯酚红检测为阳性的转基因愈伤组织进一步使用pcr方法进行检测。

优选的是，步骤1)中，所述低温贮藏的温度为2～8℃，贮藏时间为3～7天，所述种子浸泡液为150～250mg/l的赤霉素水溶液，浸泡时间为20～28小时，所述细沙的厚度为0.1～0.3cm，所述的育苗基质为菜园土：泥炭：珍珠岩按体积比例(2～4)：(1～2)：(1～2)混合均匀。

优选的是，步骤2)中，所述红腺忍冬的种子实生幼苗的苗龄为100～120天，具有4～6片真叶，75％酒精浸泡时间为20～40s，0.1％氯化汞水溶液浸泡4～7min，所述的生根培养基为每升1/2ms培养基中含α-萘乙酸0.1～0.3mg。

优选的是，步骤3)中，所述的无菌瓶苗为转接2～6代的实生幼苗，所述的叶柄经过剪开以增加伤口表面积，所述的预培养基及共培养基均为每升ms培养基中含6-苄氨基嘌呤0.06～0.15mg，α-萘乙酸0.5～1.5mg，预培养基培养时间为2～3d，共培养基上培养时间为2～4d，所述的含附有表达载体的农杆菌的活化方法为：将含附有表达载体的农杆菌在yep固体培养基上划平板，26～28℃培养，挑取生长健壮的菌落接种于活化培养基，在恒温摇床上进行震荡培养，培养温度为26～28℃，摇床转速为210～230r/min，所述活化培养基为：利福平50～100mg/l，卡那霉素50～100mg/l，其余成分为yep培养基。

优选的是，步骤4)中，所述的抑菌培养基为每升ms培养基中含6-苄氨基嘌呤0.06～0.15mg，α-萘乙酸0.5～1.5mg，头孢霉素100～300mg，在抑菌培养基中的培养时间为5～6d，所述的筛选培养基为每升ms培养基中含6-苄氨基嘌呤0.06～0.15mg，α-萘乙酸0.5～1.5mg，甘露糖：蔗糖＝(4～8g)：(26～22g)，头孢霉素100～300mg，在筛选培养基上培养时间为22～32d。

优选的是，步骤5)中，所述的氯酚红检测的方法为将转基因愈伤组织接种于每升ms培养基含甘露糖4～6g，氯酚红40～60mg，ph为6.4的检测试剂中，以未添加愈伤组织为空白对照，未侵染的愈伤组织为阴性对照，常温暗培养2～3d后观察颜色变化并进行氯酚红阳性植株比例统计。

优选的是，步骤6)中，所述的pcr检测方法为将转基因愈伤组织用ctab法提取基因组dna进行pcr检测，检测引物为：pmi1f:5'-cactgcgtgatgtgattgagag-3'；pmi1r:5'-cggctggagtagggagaca-3'，以质粒pcambia1301-pmi作为阳性对照，未侵染的红腺忍冬愈伤组织为阴性对照。

综上所述，本发明至少包括以下效果：

1)本发明能利用自播种之日起第3～4个月、具4～6片真叶的红腺忍冬实生幼苗作为外植体材料诱导无菌生根实生瓶苗，诱导出来的无菌瓶苗经多代转接后仍然长势稳定，经6代转接培养20d后其与第一代转接时的平均生根率83％，平均根数5条/株，平均根长5.5厘米，平均叶片数6.7张保持一致，克服了传统以多年生带腋芽茎段为外植体诱导的无菌瓶苗经继代转接后出现的长势下滑现象，如叶片细小、节间短等；以2～6代的无菌健壮生根实生瓶苗的叶柄为转基因受体材料，采用农杆菌介导方法，将6-磷酸甘露糖异构酶基因和外源基因导入红腺忍冬叶柄基因组，经过在含甘露糖的培养基上筛选和分化，得到转基因红腺忍冬叶柄愈伤组织，为忍冬属植物的遗传转化研究提供了重要的参考依据。

2)本发明使用6-磷酸甘露糖异构酶正向选择标记系统，将红腺忍冬的叶柄诱导分化成愈伤组织周期短，培养20天即可诱导出愈伤组织，转化效果相对稳定，转化成功率大于35％，克服了以抗生素、除草剂等为负向筛选标记的遗传转化体系转化效率低等缺陷，氯酚红检测数据估算叶柄转化率大于50％。

3)本发明使用叶柄作为愈伤组织诱导材料，扩大了材料选择的范围，降低了育苗成本。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明：

图1农杆菌侵染的叶柄愈伤组织氯酚红检测结果图；

图2农杆菌侵染的叶柄愈伤组织pcr检测结果图。

具体实施方式

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

下述实验例及实施例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1种子发芽率实验

将当年10月底-11月初采集的成熟浆果分做两份，一份将种子剥出直接进行播种，另一份浆果经4℃低温贮藏5d后将种子剥出，经发芽处理后进行播种，播种后均覆盖一层厚0.3cm左右的过40目筛的细沙。种子的发芽处理如下：⑴不浸泡；⑵清水浸泡24h；⑶自来水冲洗24h；⑷200mg/l赤霉素水溶液浸泡24h；⑸400mg/l赤霉素水溶液浸泡24h。每一处理设3次重复，每一重复播种50粒种子，每天观察并统计种子发芽等相关情况。

种子发芽能力指标统计：萌发以胚轴突破种皮为准，此时即为初次计数时间。自发芽开始之日起，每天记录萌发的正常幼苗数，挑出霉变种子，至无新萌发种子的天数为末次计数时间。以萌发启动时间、萌发结束时间、萌芽持续时间、发芽率、发芽势作为种子萌发试验评价指标，具体算法如下：

萌发启动时间：从播种之日起至开始萌发之日所经历的天数。

萌发结束时间：从播种之日起，经过萌发期，至无新萌发种子时所经历的天数。

萌芽持续天数：从种子开始萌发之日起，至萌发结束之日，之间所经历的天数。

发芽率＝(n/n)×100％(n为最终发芽数，n为供试种子数)。

发芽势＝(ni/n)×100％(ni：第i天种子发芽达到高峰时正常发芽的种子数，n为供试种子数)。

表1不同处理方式对红腺忍冬种子发芽的影响

由表1可知，不同处理方式对红腺忍冬种子的萌发启动时间、萌发结束时间、发芽持续时间、发芽率及发芽势的影响程度均不同。低温处理的种子平均发芽率及平均发芽势优于未经低温的处理，并且种子发芽持续时间缩短；赤霉素水溶液浸泡的处理种子发芽率与发芽势均高于其它处理，发芽持续时间缩短明显，以处理赤霉素200mg/l水溶液浸泡的平均发芽率和平均发芽势最高，发芽早，发芽持续时间短；是否经过清水浸泡或流水冲洗对种子平均发芽率的影响不大，但流水冲洗能缩短种子发芽持续时间。综合可知，以赤霉素200mg/l水溶液对经4℃低温储藏5d后的种子浸泡24h为红腺忍冬种子发芽的较佳处理。

实验例2甘露糖浓度对红腺忍冬叶柄愈伤组织诱导效果的影响

剪取经过增加伤口表面积的长度约为0.5cm，带1/6叶片的红腺忍冬无菌苗叶柄接种于甘露糖选择压培养基中培养，于接种后第20d、第30d及第60d各进行一次统计出愈率等相关数据。甘露糖选择压培养基为ms培养基+琼脂6g/l+6-苄氨基嘌呤0.1mg/l+α-萘乙酸1.0mg/l+蔗糖(g/l)/甘露糖(g/l)(30/0、25/5、20/10、15/15、10/20、5/25、0/30)，共7个处理，不同浓度甘露糖对红腺忍冬叶柄愈伤组织诱导效果的影响，结果见表2。

表2甘露糖浓度对红腺忍冬叶柄愈伤组织诱导效果的影响

如表2所示，不同浓度甘露糖对红腺忍冬叶柄愈伤组织诱导影响显著，在一定甘露糖浓度范围内，随着甘露糖浓度的逐渐升高，叶柄出愈率和成活率的3次统计(培养第20d、第30d及培养60d时各统计一次)结果均呈逐渐降低趋势，叶柄的出愈率和愈组大小均以未添加甘露糖的对照组为最高，组合甘露糖10/蔗糖20(g/l)中，第20d、第30d及第60d的3次统计中，叶柄的出愈率低于25％，愈伤组织体积也急剧变小，叶柄外植体半致死的甘露糖浓度为10g/l，结合出愈率，选择甘露糖10g/l为较适初筛选择压。

实验例3甘露糖浓度对侵染后的红腺忍冬叶柄愈伤分化的影响

取生长健壮的无菌瓶苗的叶柄作为转基因受体材料，经增加伤口表面积之后接种于预培养基上培养2～3d，接着于携带pcambia1301-pmi表达载体的农杆菌lba4404重悬液中侵染10min，无菌吸水纸吸干材料表面菌液，于共培养基上暗培养2d，接着于抑菌培养基中抑菌培养5d后，转接入培养基为ms+琼脂6g/l+6-苄氨基嘌呤0.1mg/l+α-萘乙酸1.0mg/l+头孢霉素100mg/l+蔗糖(g/l)/甘露糖(g/l)(30/0、20/10、15/15、10/20)，共4个处理的筛选培养基进行筛选培养，培养至第22d、第38d及第93d时各进行一次统计以观察甘露糖对侵染10min后的红腺忍冬叶柄愈伤组织分化的影响，结果见表3。

表3甘露糖浓度对侵染后红腺忍冬叶柄愈伤分化的影响

从表3可知，侵染条件下，甘露糖对红腺忍冬叶柄愈伤分化时间起到延迟作用；对出愈率、成活率及愈伤组织大小变化趋势的影响，与未侵染相似，都是随着浓度的升高而呈下降趋势，当甘露糖浓度从0上升至10g/l时，出愈率及成活率下降速度最快。因此初步确定10g/l为筛选培养基选择压的上限。

实施例1本发明一种外源基因导入红腺忍冬的方法的一种实现形式，包括以下步骤：

1)实生幼苗的准备：挑取出经低温贮藏后的红腺忍冬成熟浆果的饱满的种子，使用自来水把种子漂洗干净，浸泡于种子浸泡液中，取出并沥干种子表面水分后及时播种于育苗基质中，育苗基质表面均匀覆盖细沙，保持湿润，进行培养，获得实生幼苗。

2)无菌瓶苗的准备：取实生幼苗无根植株作为外植体，刷洗干净其表面的灰尘杂质后使用自来水冲洗20～30min，沥干外植体表面水分后，用75％酒精和0.1％氯化汞水溶液分别浸泡进行表面灭菌，然后置于生根培养基中进行培养，获得无菌瓶苗。

3)农杆菌侵染：选取生长健壮的无菌瓶苗的叶柄于预培养基上进行预培养，在携带有6-磷酸甘露糖异构酶基因和外源基因质粒的农杆菌重悬液中侵染后，于共培养基上进行暗培养，接着于抑菌培养基上进行抑菌培养，诱导愈伤组织，获得侵染材料。

4)转基因愈伤组织的筛选：侵染材料于抑菌培养基中抑菌培养后转接入筛选培养基进行筛选培养，获得转基因愈伤组织。

5)转基因愈伤组织的氯酚红检测：将转基因愈伤组织表面杂质清洗干净并稍微晾干表面水分后，使用氯酚红进行检测。

6)转基因愈伤组织的pcr检测：将氯酚红检测为阳性的转基因愈伤组织进一步使用pcr方法进行检测。

本发明以无菌健壮生根实生瓶苗的叶柄为转基因受体材料，采用农杆菌介导方法，将6-磷酸甘露糖异构酶基因和外源基因导入红腺忍冬叶柄基因组，经过在含甘露糖的培养基上筛选和分化，得到转基因红腺忍冬叶柄愈伤组织，为忍冬属植物的遗传转化研究提供了重要的参考依据；使用6-磷酸甘露糖异构酶正向选择标记系统，将红腺忍冬的叶柄诱导分化成愈伤组织周期短，转化效果相对稳定，克服了以抗生素、除草剂等为负向筛选标记的遗传转化体系转化效率低等缺陷，氯酚红检测数据估算叶柄转化率大于45％。

实施例2本发明一种外源基因导入红腺忍冬的方法的一种实现形式，包括以下步骤：

1)实生幼苗的准备：挑取出经4℃低温贮藏5d后的红腺忍冬成熟浆果的饱满的种子，使用自来水把种子漂洗干净，浸泡于150mg/l的赤霉素水溶液种子浸泡液中，浸泡时间为20小时，取出并沥干种子表面水分后及时播种于育苗基质中，育苗基质各组分的体积比为菜园土：泥炭：珍珠岩＝2：1：1，育苗基质表面均匀覆盖约0.1cm厚的细沙，保持湿润，进行培养，获得实生幼苗。

2)无菌瓶苗的准备：取实生幼苗无根植株作为外植体，刷洗干净其表面的灰尘杂质后使用自来水冲洗20～30min，沥干外植体表面水分后，用75％酒精和0.1％氯化汞水溶液分别浸泡进行表面灭菌，然后置于生根培养基中进行培养，获得无菌瓶苗。

3)农杆菌侵染：选取生长健壮的无菌瓶苗的叶柄于预培养基上进行暗培养，接着于含附有表达载体的农杆菌重悬液中侵染后，于共培养基上进行暗培养，再于抑菌培养基上进行抑菌培养，诱导愈伤组织，获得侵染材料。

4)转基因愈伤组织的筛选：侵染材料于抑菌培养基中抑菌培养后转接入筛选培养基进行筛选培养，获得转基因愈伤组织。

5)转基因愈伤组织的氯酚红检测：将转基因愈伤组织表面杂质清洗干净并稍微晾干表面水分后，使用氯酚红进行检测。

6)转基因愈伤组织的pcr检测：将氯酚红检测为阳性的转基因愈伤组织进一步使用pcr方法进行检测。

红腺忍冬成熟浆果经低温冷藏后，种子发芽率提高了2％以上；种子经赤霉素水溶液浸泡后，种子发芽率提高了14％以上；使用特定组合的育苗基质，使得种苗出苗齐整，出苗率高，培育的种苗根系发达，茎粗，苗壮，在育苗基质上面覆盖细沙，起到了很好的保水作用，节约了用水量及劳工。

实施例3本发明一种外源基因导入红腺忍冬的方法的一种实现形式，包括以下步骤：

1)实生幼苗的准备：挑取出经4℃低温贮藏5d后的红腺忍冬成熟浆果的饱满的种子，使用自来水把种子漂洗干净，浸泡于150mg/l的赤霉素水溶液种子浸泡液中，浸泡时间为20小时，取出并沥干种子表面水分后及时播种于育苗基质中，育苗基质各组分的体积比为菜园土：泥炭：珍珠岩＝2：1：1，育苗基质表面均匀覆盖约0.1cm厚的细沙，保持湿润，进行培养，获得实生幼苗。

2)无菌瓶苗的准备：取生长100d，具有4片真叶的红腺忍冬实生幼苗无根植株为外植体，刷洗干净其表面的灰尘杂质后使用自来水冲洗20～30min，沥干外植体表面水分后，用75％酒精浸泡30s，然后用0.1％氯化汞水溶液浸泡5min进行表面灭菌，然后置于每升1/2ms培养基中含α-萘乙酸0.2mg的生根培养基中进行培养，获得无菌瓶苗。

3)农杆菌侵染：选取生长健壮的无菌瓶苗的叶柄于预培养基上进行预培养，接着于含附有表达载体的农杆菌重悬液中侵染后，于共培养基上进行暗培养，再于抑菌培养基上进行抑菌培养，诱导愈伤组织，获得侵染材料。

4)转基因愈伤组织的筛选：侵染材料于抑菌培养基中抑菌培养后转接入筛选培养基进行筛选培养，获得转基因愈伤组织。

5)转基因愈伤组织的氯酚红检测：将转基因愈伤组织表面杂质清洗干净并稍微晾干表面水分后，使用氯酚红进行检测。

6)转基因愈伤组织的pcr检测：将氯酚红检测为阳性的转基因愈伤组织进一步使用pcr方法进行检测。

本发明能利用自播种之日起第3～4个月、具4～6片真叶的红腺忍冬实生幼苗无根植株作为外植体材料诱导无菌生根实生瓶苗，诱导出来的无菌瓶苗经多代转接后仍然长势稳定，不仅克服了传统以多年生带腋芽茎段为外植体诱导的无菌瓶苗经继代转接后出现的长势下滑现象，如叶片小，节间短等，还扩大了外植体材料的选材范围；取具有4片真叶的红腺忍冬实生幼苗无根植株作为外植体，具有生长速度快，代谢旺盛，再生能力强，遗传性稳定等优点，灭菌处理7天后平均污染率为0，平均成活率为100％，苗生长健壮；培养12d之后开始生根，20d之后生根率为83.33％，30d之后生根率为90.33％，60d之后生根率达100.00％。

实施例4本发明一种外源基因导入红腺忍冬的方法的一种实现形式，包括以下步骤：

1)实生幼苗的准备：挑取出经4℃低温贮藏5d后的红腺忍冬成熟浆果的饱满的种子，使用自来水把种子漂洗干净，浸泡于150mg/l的赤霉素种子浸泡液中，浸泡时间为20小时，取出并沥干种子表面水分后及时播种于育苗基质中，育苗基质各组分的体积比为菜园土：泥炭：珍珠岩＝2：1：1，育苗基质表面均匀覆盖约0.1cm厚的细沙，保持湿润，进行培养，获得实生幼苗。

2)无菌瓶苗的准备：取生长100d，具有4片真叶的红腺忍冬实生幼苗无根植株作为外植体，刷洗干净其表面的灰尘杂质后使用自来水冲洗20～30min，沥干外植体表面水分后，用75％酒精浸泡30s，然后用0.1％氯化汞水溶液浸泡5min进行表面灭菌，然后置于每升1/2ms培养基中含α-萘乙酸0.2mg的生根培养基中进行培养，获得无菌瓶苗。

3)农杆菌侵染：选取生长健壮的，转接了2代的无菌瓶苗的、经过剪开以增加伤口表面积的叶柄于每升ms培养基中含6-苄氨基嘌呤0.1mg，α-萘乙酸1.0mg的预培养基上进行培养2d，接着于含附有表达载体pcambia1301-pmi的农杆菌lba4404重悬液中侵染10min后，于每升ms培养基中含6-苄氨基嘌呤0.1mg，α-萘乙酸1.0mg的共培养基上进行暗培养2d，诱导愈伤组织，获得侵染材料，所述含附有表达载体的农杆菌的活化方法为将含附有表达载体的农杆菌在yep固体培养基上划平板，28℃培养，挑取生长健壮的菌落接种于活化培养基上，在恒温摇床上进行震荡培养，培养温度为28℃，摇床转速为210r/min，所述活化培养基为：利福平100mg/l，卡那霉素50mg/l，其余成分为yep培养基。

4)转基因愈伤组织的筛选：侵染材料于抑菌培养基中抑菌培养后转接入筛选培养基进行筛选培养，获得转基因愈伤组织。

5)转基因愈伤组织的氯酚红检测：将转基因愈伤组织表面杂质清洗干净并稍微晾干表面水分后，使用氯酚红进行检测。

6)转基因愈伤组织的pcr检测：将氯酚红检测为阳性的转基因愈伤组织进一步使用pcr方法进行检测。

使用转接了2代的无菌瓶苗的叶柄诱导愈伤组织出愈率高达100％，农杆菌经活化后，细胞活性强，叶柄经过剪开以增加伤口表面积，增加了侵染的成功率，使侵染成功率提高了6％以上。

实施例5本发明一种外源基因导入红腺忍冬的方法的一种实现形式，包括以下步骤：

1)实生幼苗的准备：挑取出经4℃低温贮藏5d后的红腺忍冬成熟浆果的饱满的种子，使用自来水把种子漂洗干净，浸泡于150mg/l的赤霉素种子浸泡液中，浸泡时间为20小时，取出并沥干种子表面水分后及时播种于育苗基质中，育苗基质各组分的体积比为菜园土：泥炭：珍珠岩＝2：1：1，育苗基质表面均匀覆盖约0.1cm厚的细沙，保持湿润，进行培养，获得实生幼苗。

2)无菌瓶苗的准备：取生长100d，具有4片真叶的红腺忍冬实生幼苗无根植株作为外植体，刷洗干净其表面的灰尘杂质后使用自来水冲洗20～30min，沥干外植体表面水分后，用75％酒精浸泡30s，然后用0.1％氯化汞水溶液浸泡5min进行表面灭菌，然后置于每升1/2ms培养基中含α-萘乙酸0.1mg的生根培养基中进行培养，获得无菌瓶苗。

3)农杆菌侵染：选取生长健壮的，转接了2代的无菌瓶苗的叶柄于每升ms培养基中含6-苄氨基嘌呤0.1mg，α-萘乙酸1.0mg的预培养基上进行培养2d，接着于含附有表达载体的农杆菌重悬液中侵染后，于每升ms培养基中含6-苄氨基嘌呤0.1mg，α-萘乙酸1.0mg共培养基上进行暗培养2d，诱导愈伤组织，获得侵染材料，所述含附有表达载体的农杆菌的活化方法为将含附有表达载体的农杆菌在yep固体培养基上划平板，26～28℃培养，挑取生长健壮的菌落接种于活化培养基，在恒温摇床上进行震荡培养，培养温度为26～28℃，摇床转速为210r/min，所述活化培养基为：利福平100mg/l，卡那霉素50mg/l，其余成分为yep培养基。

4)转基因愈伤组织的筛选：侵染材料于每升ms培养基中含6-苄氨基嘌呤0.1mg，α-萘乙酸1.0mg，头孢霉素100mg的抑菌培养基中抑菌培养5d，转接入每升ms培养基中含6-苄氨基嘌呤0.1mg，α-萘乙酸1.0mg，甘露糖6g，蔗糖24g，头孢霉素100mg筛选培养基进行筛选培养27d，获得转基因愈伤组织。

5)转基因愈伤组织的氯酚红检测：将转基因愈伤组织表面杂质清洗干净并稍微晾干表面水分后，使用氯酚红进行检测。

6)转基因愈伤组织的pcr检测：将氯酚红检测为阳性的转基因愈伤组织进一步使用pcr方法进行检测。

愈伤组织在抑菌培养基中培养5d后，转接入筛选压为甘露糖：蔗糖＝6g：24g的筛选培养基中，从预培养之日起的第50d时，出愈率大于50％，成活率大于55％。

实施例6本发明一种外源基因导入红腺忍冬的方法的一种实现形式，包括以下步骤：

1)实生幼苗的准备：挑取出经4℃低温贮藏5d后的红腺忍冬成熟浆果的饱满的种子，使用自来水把种子漂洗干净，浸泡于150mg/l的赤霉素种子浸泡液中，浸泡时间为20小时，取出并沥干种子表面水分后及时播种于育苗基质中，育苗基质各组分的体积比为菜园土：泥炭：珍珠岩＝2：1：1，育苗基质表面均匀覆盖约0.1cm厚的细沙，保持湿润，进行培养，获得实生幼苗。

2)无菌瓶苗的准备：取生长100d，具有4片真叶的红腺忍冬实生幼苗无根植株作为外植体，刷洗干净其表面的灰尘杂质后使用自来水冲洗20～30min，沥干外植体表面水分后，用75％酒精浸泡30s，然后用0.1％氯化汞水溶液浸泡5min进行表面灭菌，然后置于每升1/2ms培养基中含α-萘乙酸0.2mg的生根培养基中进行培养，获得无菌瓶苗。

3)农杆菌侵染：选取生长健壮的，转接了2代的无菌瓶苗的叶柄于每升ms培养基中含6-苄氨基嘌呤0.1mg，α-萘乙酸1.0mg的预培养基上进行培养2d，接着于含附有表达载体的农杆菌重悬液中侵染后，于每升ms培养基中含6-苄氨基嘌呤0.1mg，α-萘乙酸1.0mg共培养基上进行暗培养2d，诱导愈伤组织，获得侵染材料。

4)转基因愈伤组织的筛选：侵染材料于每升ms培养基中含6-苄氨基嘌呤0.1mg，α-萘乙酸1.0mg，头孢霉素100mg的抑菌培养基中抑菌培养5d，转接入每升ms培养基中含6-苄氨基嘌呤0.1mg，α-萘乙酸1.0mg，甘露糖6g，蔗糖24g，头孢霉素100mg的筛选培养基进行筛选培养27d，获得转基因愈伤组织。

5)转基因愈伤组织的氯酚红检测：将转基因愈伤组织表面杂质清洗干净并稍微晾干表面水分后，使用氯酚红进行检测。氯酚红检测的方法为将转基因愈伤组织接种于每升ms培养基含甘露糖6g，氯酚红40mg，ph为6.4的检测试剂中，以未添加愈伤组织为空白对照，未侵染的愈伤组织为阴性对照，常温暗培养3d后观察颜色变化并进行氯酚红阳性植株比例统计。

6)转基因愈伤组织的pcr检测：将氯酚红检测为阳性的转基因愈伤组织进一步使用pcr方法进行检测。

使用氯酚红检测，方法简单，颜色变化易于观察，检测效果如图1所示，氯酚红检测为阴性时培养基呈红色，为阳性则培养基呈黄色，本发明方法的检测阳性率大于60％。

实施例7本发明一种外源基因导入红腺忍冬的方法的一种实现形式，包括以下步骤：

1)实生幼苗的准备：挑取出经4℃低温贮藏5d后的红腺忍冬成熟浆果的饱满的种子，使用自来水把种子漂洗干净，浸泡于150mg/l的赤霉素种子浸泡液中，浸泡时间为20小时，取出并沥干种子表面水分后及时播种于育苗基质中，育苗基质各组分的体积比为菜园土：泥炭：珍珠岩＝2：1：1，育苗基质表面均匀覆盖约0.1cm厚的细沙，保持湿润，进行培养，获得实生幼苗。

2)无菌瓶苗的准备：取生长100d，具有4片真叶的红腺忍冬实生幼苗无根植株作为外植体，刷洗干净其表面的灰尘杂质后使用自来水冲洗20～30min，沥干外植体表面水分后，用75％酒精浸泡30s，然后用0.1％氯化汞水溶液浸泡5min进行表面灭菌，然后置于每升1/2ms培养基中含α-萘乙酸0.1mg的生根培养基中进行培养，获得无菌瓶苗。

3)农杆菌侵染：选取生长健壮的，转接了2代的无菌瓶苗的叶柄于每升ms培养基中含6-苄氨基嘌呤0.1mg，α-萘乙酸1.0mg的预培养基上进行培养2d，接着于含附有表达载体的农杆菌重悬液中侵染后，于每升ms培养基中含6-苄氨基嘌呤0.1mg，α-萘乙酸1.0mg共培养基上进行暗培养2d，诱导愈伤组织，获得侵染材料。

4)转基因愈伤组织的筛选：侵染材料于每升ms培养基中含6-苄氨基嘌呤0.1mg，α-萘乙酸1.0mg，头孢霉素100mg的抑菌培养基中抑菌培养5d，转接入每升ms培养基中含6-苄氨基嘌呤0.1mg，α-萘乙酸1.0mg，甘露糖：蔗糖＝6g：24g，头孢霉素100mg筛选培养基进行筛选培养27d，获得转基因愈伤组织。

5)转基因愈伤组织的氯酚红检测：将转基因愈伤组织表面杂质清洗干净并稍微晾干表面水分后，使用氯酚红进行检测。氯酚红检测的方法为将转基因愈伤组织接种于每升ms培养基含甘露糖6g，氯酚红40mg，ph为6.4的检测试剂中，以未添加愈伤组织为空白对照，未侵染的愈伤组织为阴性对照，常温暗培养2d后观察颜色变化并进行氯酚红阳性植株比例统计。

6)转基因愈伤组织的pcr检测：将氯酚红检测为阳性的转基因愈伤组织进一步使用pcr方法进行检测。pcr检测方法为将转基因愈伤组织用ctab法提取基因组dna进行pcr检测，检测引物为：pmi1f:5'-cactgcgtgatgtgattgagag-3'(seqidno.1)；pmi1r:5'-cggctggagtagggagaca-3'(seqidno.2)，以质粒pcambia1301-pmi作为阳性对照，未侵染的红腺忍冬愈伤组织为阴性对照，pcr反应体系为：2×estagmix6μl，pmi1f(10μm)1μl；pmi1r(10μm)1μl；dna(100ng/μl)1μl；用ddh2o补齐至20μl。pcr反应程序为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min。使用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测，凝胶成像系统观察拍照。

将氯酚红检测为阳性的转基因愈伤组织进一步使用pcr方法进行检测，进一步确认侵染结果，结果如图2所示。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

<110>广西壮族自治区药用植物园

<120>一种外源基因导入红腺忍冬的方法

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<213>人工序列

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